申海艷 周靜 肖麗娜 馬武開 姚血明 陳琳 韓珊

(1貴州省骨科醫(yī)院骨外科,貴州 貴陽 550001;2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科;3貴州中醫(yī)藥大學(xué))

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA),又稱膝痹、骨痹,苗醫(yī)學(xué)中稱為“冷骨風(fēng)(冷風(fēng)濕)”。是因關(guān)節(jié)軟骨退行性改變導(dǎo)致骨質(zhì)、滑膜增生的一種慢性、進(jìn)展性、非感染性疾病。中老年發(fā)病率較高,發(fā)病時多就診于骨科及風(fēng)濕免疫科。隨著病情進(jìn)展,嚴(yán)重影響患者日常活動,使患者生活質(zhì)量下降,成為老年患者致殘的主要原因之一。在近年來KOA的治療中,藥物治療長期療效并不理想,臨床推廣受限較多〔1〕。隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的不斷發(fā)展,中醫(yī)外治療法對KOA的治療逐漸得到了認(rèn)可。苗醫(yī)藥作為祖國醫(yī)學(xué)的重要組成部分,擅長外治法由來已久。苗醫(yī)認(rèn)為“以通為用、以暢為安、壅塞為病、通達(dá)為康”;因此,“冷骨風(fēng)”治療時主要以“通筋散血”為主。近年來,苗醫(yī)藥在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕類疾病中療效顯著,其外治法也在臨床得到了廣泛應(yīng)用。苗藥五藤膏作為我院外治經(jīng)驗方,前期臨床研究已證實治療KOA有效〔2～5〕。

近年來,越來越多研究表明Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a的異常表達(dá),能特異地激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路,影響軟骨化生,從而引起相關(guān)靶基因的表達(dá),導(dǎo)致OA的發(fā)生〔6～9〕。前期研究〔2～5〕認(rèn)為Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵因子β-catenin可能對KOA發(fā)生發(fā)展、軟骨組織的病變進(jìn)程有很大的相關(guān)性;因此,本研究在前期研究基礎(chǔ)上,為證實苗藥五藤膏是否能使Wnt信號參與骨化,調(diào)控其通路上游相關(guān)基因的表達(dá)水平,通過建立KOA模型兔,探討不同劑量苗藥五藤膏干預(yù)對KOA模型家兔關(guān)節(jié)軟骨糖原合酶激酶(GSK)-3β蛋白及上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 2019年3～6月選取同一批4～5月齡健康家兔96只(雌雄各半),體質(zhì)量1.5～2.5 kg,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗室提供,實驗動物合格證號:SCXK(黔)2018-0012。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,遵照實驗動物倫理要求,將96只家兔隨機(jī)分為空白組、模型組、巴布膏對照組、苗藥五藤膏高劑量組、苗藥五藤膏中劑量組、苗藥五藤膏低劑量組,每組16只。

1.2實驗藥物 苗藥五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青風(fēng)藤30 g、香血藤30 g和絡(luò)石藤30 g打成細(xì)粉與凡士林按1∶1的比例混合制成),由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供(黔藥制字Z20120072)。使用前均勻?qū)⑽逄俑嗤坑诩啿忌献龀少N膏。氟比洛芬巴布膏(日本三笠制藥株式社會,規(guī)格:40 mg,批號:J20160090)。

1.3主要儀、試劑DYCZ-24DN電泳槽(北京六一儀器廠)、CPA電子天平秤(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、TS-1水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)、mμlISKANMK3酶標(biāo)儀(Thermo)、QuantStudio6實時熒光定量PCR儀(ABI)、電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司)、袋裝吸頭(美國Extragene吸頭)、AJY-0501純水儀,艾科浦(Aquapro)、TS8080灰度掃描儀(Canon)、JY02S超微量紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、JY300水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);RIPA裂解液(廠家:碧云天,批號:P0013B)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(廠家:碧云天,批號:P0010)、蛋白marker10-250KD(廠家:海利克思,批號:P12103-2)、兔多抗GSK-3β(45 kD,廠家:LSBio,批號:LS-C458918-100)、兔多抗GAPDH(37 kD,廠家:杭州賢至生物有限公司,批號:AB-P-R 001)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(廠家:武漢博士德生物工程有限公司,批號:BA1054)、Trizol(廠家:Ambion,批號:15596-026)、DNA Marker(廠家:TIANGEN,批號:MD114-02)、5×HiScript緩沖液(廠家:VAZYME,批號:R101-01/02)。

1.4構(gòu)建兔KOA模型 為了減少或避免對家兔膝關(guān)節(jié)的人為損傷,更好地模擬人KOA的疾病發(fā)展,反映中醫(yī)外治法對兔KOA的治療作用;采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射方法制備兔KOA模型〔10〕,即:將4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 ml分別于第1、4、7天注入兔右膝關(guān)節(jié),第7天注射完畢后,不再進(jìn)行任何干預(yù)(整個造模過程與指導(dǎo)小組成員協(xié)助完成)。正常飼養(yǎng)4 w后,通過組織切片觀察造模,建立穩(wěn)定的兔KOA模型。

1.5給藥方法 從造模后第5周開始干預(yù)治療,空白組不做任何干預(yù),正常飼養(yǎng)。其余各組患膝均備皮,模型組患膝無菌紗布包扎固定,其余各組分別給予氟比洛芬巴布膏貼敷及不同劑量苗藥五藤膏貼敷干預(yù);各治療組家兔藥物使用劑量均為人體等效劑量〔11〕,氟比洛芬巴布膏和苗藥五藤膏面積均約為4 cm×3 cm,氟比洛芬巴布膏(約2 g),苗藥五藤膏高劑量組(約4 g)、中劑量組(約2 g)、低劑量組(約1 g)。將苗藥五藤膏(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室研制)均勻涂于紗布上做成貼膏,直接敷貼于兔患膝關(guān)節(jié)面,藥物能覆蓋患肢膝關(guān)節(jié),用繃帶包扎固定8 h防止藥物掙脫,每日給藥一次。給藥后第1、2、3、4周各處死4只,在右側(cè)膝關(guān)節(jié)剝除皮膚取軟骨進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。

1.6實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 檢測Wnt信號上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA的表達(dá)。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,引物合成由武漢擎科公司完成,NCBI網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計、驗證,引物序列:Rabbit Wnt3a上游引物 5′-CGCGACCTGGTCTATTACGA-3′、下游5′-TAGCAGCACCAGTGGAAGAC-3′,203 bp;Rabbit Wnt5a上游引物5′-GTCAACAGCCGCTTCAACTC-3′、下游5′-GTCAACAGCCGCTTCAACTC-3′,235 bp;Rabbit Wnt7a上游引物5′-CAAGAAGCCACTGTCGTACC-3′、下游5′-CATTTGACGTAGCAGCACCA-3′,246 bp;GAPDH上游引物5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3′、下游5′-AGTGCGACGTGGACATCCG-3′,295 bp。提取樣本總RNA(Trizol法):取(-80 ℃)凍存軟骨組織100 mg,研磨,根據(jù)說明書操作,加入Trizol試劑,勻漿靜置10 min;再加入氯仿;離心機(jī)12 000 r/min離心,可見上-中-下(即:RNA-蛋白-DNA)三相。上層RNA轉(zhuǎn)移至EP管中加入異丙醇,靜置后離心,可見白色RNA沉淀;棄上清,加入無RNase的75%乙醇1 ml,重復(fù)此步驟一次。棄上清,干燥RNA沉淀,將沉淀溶于20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。取DEPC水溶解后的RNA測定、計算樣本RNA濃度。實時熒光定量PCR檢測:將所得到的cDNA做4倍稀釋,進(jìn)行實時熒光定量PCR;采用2-ΔΔCt分析最終目的基因的表達(dá)量。

1.7Western印跡檢測GSK-3β蛋白表達(dá) 按照說明書要求,將稱量后將軟骨組織塊剪碎,液氮研磨后再用鋼珠(鋼珠直徑:0.9～2.0 mm混合)研磨。每組加入裂解液裂〔含2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)、2 μl磷酸酶抑制劑〕勻漿,然后裂解(冰上),將裂解液離心,取上清移至離心管,將蛋白樣品稀釋20倍牛血清白蛋白,稀釋牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品,(按說明書要求,單位:mg/ml)。將蛋白樣品(經(jīng)PBS稀釋20倍)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白按組依次加入96孔板內(nèi),BCA試劑盒按50∶1混合后加入96孔板內(nèi)。溫箱孵育后酶標(biāo)儀測吸光值(OD)值(OD568)。算出樣品蛋白濃度。掃膜曝光,最后BandScan分析灰度值。

1.8病理觀察 患膝軟骨取材后,由專人將所取病理組織用中性甲醛固定、脫鈣、透蠟包埋等處理,蘇木素-伊紅(HE)染色,病理變化參考改良版Mankin〔12〕評分對患膝關(guān)節(jié)軟骨造模情況進(jìn)行分析、評分。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組關(guān)節(jié)軟骨病理改變比較 經(jīng)過4 w干預(yù)后,空白組關(guān)節(jié)面軟骨無退變,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布均勻,無變性、萎縮等;模型組患膝關(guān)節(jié)面軟骨重度退性改變,軟骨細(xì)胞分布紊亂,重度變性、萎縮;巴布膏對照組關(guān)節(jié)面軟骨輕度退性改變,軟骨細(xì)胞分布輕度紊亂,輕度變性、萎縮;苗藥五藤膏低、中、高劑量組退變程度與劑量呈正相關(guān)。見圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨病理(×200)

2.2各組Mankin評分比較 空白組改良版Mankin評分明顯低于模型組、巴布膏對照組及苗藥五藤膏低、中、高劑量組(P<0.05),苗藥五藤膏低、中、高劑量組及巴布膏對照組改良版Mankin評分均明顯低于模型組(P<0.05);苗藥五藤膏低、中、高劑量組組內(nèi)病理改良版Mankin評分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理改良版Mankin評分、GSK-3β蛋白表達(dá)比較

2.3各組GSK-3β蛋白表達(dá)比較 與空白組比較,模型組、苗藥五藤膏低、中、高劑量組、巴布膏對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,苗藥五藤膏低、中、高劑量組、巴布膏對照組GSK-3β蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1、圖2。

1～6:空白組、模型組、苗藥五藤膏低劑量、苗藥五藤膏中劑量、苗藥五藤膏高劑量、巴布膏對照組圖2 各組干預(yù)4 w后軟骨組織中GSK-3β蛋白表達(dá)

2.4各組Wnt3a mRNA表達(dá)水平比較 與空白組相比,給藥后1、2、3、4 w模型組、苗藥五藤膏中、低劑量組、給藥后4 w苗藥五藤膏高劑量組Wnt3a mRNA明顯升高(P<0.05);與模型組比較,苗藥五藤膏低、中、高劑量組、巴布膏對照組Wnt3a mRNA明顯降低(P<0.01);與巴布膏對照組相比,苗藥五藤膏低劑量Wnt3a mRNA明顯升高(P<0.01);與苗藥五藤膏低劑量組比較,苗藥五滕膏中、高劑量組Wnt3a mRNA明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組Wnt5a mRNA表達(dá)水平比較 與空白組相比,給藥后1、2、3、4 w模型組、苗藥五藤膏高、中、低劑量組、給藥后1 w苗藥五藤膏高劑量組、巴布膏對照組Wnt5a mRNA明顯升高(P<0.05);與模型組相比,巴布膏對照組及苗藥五藤膏高、中、低劑量組Wnt5a mRNA明顯降低(P<0.01);苗藥五藤膏低劑量與中劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

2.6各組Wnt7a mRNA表達(dá)水平比較 與空白組相比,給藥后1、2、3、4 w模型組、苗藥五藤膏中、低劑量組Wnt7a mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01);與模型組相比,巴布膏對照組、苗藥五藤膏高、中、低劑量組Wnt7a mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01);與巴布膏對照組比較,苗藥五藤膏低劑量組Wnt7a mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01);與苗藥五藤膏低劑量組比較,苗藥五藤膏中、高劑量組Wnt7a mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討 論

目前與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的4條主要信號通路中,Wnt/β-catenin信號通路最為重要,其在KOA軟骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,信號通路的異常導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)代謝失衡,最終導(dǎo)致KOA的形成〔13～15〕。Wnt來源于對果蠅的無翅基因與小鼠Int-1基因的研究,由許多富含半胱氨酸的小型分泌蛋白組成〔16〕。 Wnt/β-catenin 信號通路是Wnt蛋白激活的4條信號通路中最經(jīng)典的一條信號通路。Wnt/β-catenin 信號通路主要調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化以維持關(guān)節(jié)完整性,是調(diào)節(jié)軟骨代謝的重要途徑。KOA的發(fā)生發(fā)展與Wnt信號通路的異常有著密切聯(lián)系,有研究表明,GSK-3β對Wnt通路有一定的調(diào)節(jié)作用,可使軟骨骨化的進(jìn)程減緩,延緩病情惡化〔17〕。在RNA表達(dá)層面,β-catenin信號通路參與KOA模型大鼠滑膜炎癥反應(yīng),在其下游炎癥因子IL-1β的表達(dá)中及KOA退變中均可能發(fā)揮重要調(diào)控作用〔18〕。Wnt信號中任何組成分子出現(xiàn)異常,都會導(dǎo)致此信號異常活化,通路中配體、轉(zhuǎn)錄因子、受體等表達(dá)異常均會加速 KOA的形成與發(fā)展〔19〕。

Wnt家族蛋白中Wnt3a、Wnt5a和Wnt7a等已被證實參與β-catenin信號通路上游基因的激活〔20～22〕。Wnt3a可通過激活下游β-catenin抑制軟骨細(xì)胞形成。有研究表明,骨關(guān)節(jié)炎患者在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及間充質(zhì)祖細(xì)胞(MPCs)中,Wnt3a明顯抑制了MSCs向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)因子表達(dá),減少成骨鈣化形成〔23〕;Wnt3a表達(dá)增高時,MPCs中Wnt/β-catenin通路被激活時,β-catenin在細(xì)胞中表達(dá)也隨之增多〔24〕。軟骨化生期,Wnt5a與Wnt5b加速軟骨小體形成、化生,對維持軟骨細(xì)胞的增長起著關(guān)鍵的作用;而Wnt5a與Wnt5b在軟骨成熟分化期的異常表達(dá),反而會抑制其增殖、分化〔25〕,已有研究顯示W(wǎng)nt5a在骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)與關(guān)節(jié)軟骨的退變程度呈正相關(guān)〔26〕。另一方面,Wnt7a在骨骼形成、發(fā)生及發(fā)育中起重要作用,Wnt7a可通過β-catenin來抑制軟骨內(nèi)MSCs,影響軟骨細(xì)胞發(fā)育,Wnt7a拮抗劑可抑制Wnt7a在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)〔27,28〕。Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a均為激活Wnt/β-catenin信號通路的配體蛋白,如果能通過相應(yīng)的中醫(yī)藥外治干預(yù),阻止或減少其信號的激發(fā),則可能阻斷或延緩KOA的疾病進(jìn)展。

本研究結(jié)果說明,Wnt/β-catenin信號通路GSK-3β蛋白與上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a與KOA的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系,且其表達(dá)量與疾病進(jìn)程有很大的相關(guān)性,通過本實驗研究結(jié)果進(jìn)一步證明了Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA與GSK-3β蛋白表達(dá)與KOA關(guān)節(jié)軟骨退變程度及疾病進(jìn)展有一定的正相關(guān)性。