李佳楠 劉瀟遙 劉 洋 蘆慧穎 王培軍 張 怡

上頜快速擴弓（rapid maxillary expansion，RME）快速打開腭中縫，增加上頜骨寬度，廣泛應(yīng)用于上頜牙弓狹窄、后牙對刃或反牙合、輕度牙列擁擠等錯牙合畸形的矯治。RME 的擴弓效果值得肯定，但多數(shù)患者在治療后常發(fā)生較為明顯的復(fù)發(fā)，影響RME 的長期穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致擴弓失敗[1]。RME 后腭中縫內(nèi)新骨形成不足是復(fù)發(fā)的主要原因之一，因此，如何促進RME 后腭中縫骨改建，增加骨縫內(nèi)新骨形成成為了研究熱點[2]。

超活化血小板裂解液（super-activated platelet lysate, sPL）是一種新型血小板濃縮物，富含高濃度的生物活性因子，可促進成骨細胞增殖和凋亡修復(fù)，加速骨組織再生[3]。sPL 可以注射的方式作用于局部，操作簡單、創(chuàng)傷小，可調(diào)節(jié)實驗性牙周炎大鼠炎癥小體和細胞因子的表達，具有明顯的緩解炎癥的作用[4]，可促進拔牙窩內(nèi)新骨形成和軟組織愈合[5]，但尚未見其在口腔正畸領(lǐng)域的應(yīng)用研究。骨髓間充質(zhì) 干 細 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是成骨細胞的重要來源，能夠有效促進骨折愈合和軟骨損傷的修復(fù)，是骨再生研究領(lǐng)域的熱點。

本研究通過擴弓裝置快速擴張大鼠的前腭縫，評估sPL 和BMSCs 聯(lián)合應(yīng)用對大鼠RME 后前腭縫骨改建的影響，從而為正畸臨床中提高RME 的長期穩(wěn)定性，縮短保持時間，提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

資料和方法

1.主要實驗材料和儀器

SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基、胎牛血清（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；水合氯醛（美國Sigma 公司）；酸蝕劑、粘接劑、光固化樹脂（美國3M公司）；多聚甲醛（廣州碩譜生物科技有限公司）；EDTA（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液（賽默瑞特科技有限公司）；倒置相差顯微鏡、正置顯微鏡及彩色照相系統(tǒng)（日本Nikon 公司）；全自動組織處理機、組織包埋機、組織切片機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；小動物Micro-CT 機（瑞士Scanco Medical 公司）；VG Studio Max 軟件（德國Volume Graphics公司）。

2.動物分組及處理

選用16 只6 周齡Sprague-dawley（SD）雄性大鼠，平均體重200±10 g。動物來源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心。本實驗經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗倫理委員會審查批準(zhǔn)。嚴(yán)格遵循《實驗動物保護條例》，所有大鼠統(tǒng)一自由進食水,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后分組實驗，隨機分為4 組：對照組（A 組）；sPL 注射組（B 組）；BMSCs 注射組（C 組）；BMSCs+sPL 注射組（D 組），每組4只，正常飲食，分籠喂養(yǎng)，每2～3 天更換墊料，保持鼠籠內(nèi)干燥衛(wèi)生。

3.大鼠RME模型的建立

使用0.016 英寸不銹鋼絲彎制大鼠上頜快速擴弓器，調(diào)整雙側(cè)擴張臂打開角度以提供100±5 g的擴弓力。大鼠經(jīng)腹腔注射8%水合氯醛溶液（4 mL∕kg體重）麻醉后，將擴弓器加載于上頜切牙，使用結(jié)扎絲進行結(jié)扎固位后，再使用光固化復(fù)合樹脂進行粘接固定，建立大鼠RME 模型（圖1）。擴弓7 天后拆除擴弓裝置，使用游標(biāo)卡尺測量上頜中切牙間距離，在中切牙間放置相應(yīng)長度的0.018×0.025 不銹鋼方絲，并用光固化復(fù)合樹脂固定，進入21 天的保持期（圖2）。

圖1 大鼠RME裝置的安放

圖2 大鼠RME后保持

4.sPL的制備

sPL 由天晴干細胞股份有限公司提供，具體制備方法參考先前的研究[4]：在麻醉下通過心臟穿刺從12只健康SD大鼠中采集血液80 mL，血液用3.8%的檸檬酸鈉抗凝?？鼓簶悠吩谑覝叵?000 rpm離心10 分鐘，去除下層紅細胞；然后將剩余血液混合均勻，再在18～20℃、2300～3300 rpm 條件下離心15 分鐘，將上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中留存，將底層的血小板血漿顛倒混勻、計數(shù)，利用留存的上層血漿，將富血小板血漿中的血小板濃度調(diào)整至1×1012個∕L；為激活血小板并釋放生長因子，將富血小板血漿與CaCl2和低分子量肝素鈉在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育1～2小時，然后將混合物凍存于-80℃冰箱內(nèi)1～2小時。最后，混合物在37℃下解凍5分鐘，并在4℃下冷卻1 小時，以允許纖維蛋白聚結(jié)。在4℃下離心后，過濾上清液，最終獲得約20 mL sPL。

5.BMSCs的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代

SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞購于廣州賽業(yè)生物科技有限公司。按照說明書進行細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代，使用生長狀態(tài)良好的第三代細胞進行后續(xù)實驗。

6.生理鹽水、sPL及BMSCs的注射

（1）注射方法

在異氟烷吸入麻醉下，將大鼠仰臥固定四肢，用碘伏消毒注射區(qū)域，于齦乳頭腭側(cè)2 mm 處進針，方向呈約30±5°銳角朝向口內(nèi)，進針深度約2 mm。將100μL 的生理鹽水、sPL 或BMSCs 細胞懸液注入大鼠前腭縫區(qū)域。

（2）動物分組及注射:①對照組（A 組）：在保持期間，每只大鼠每隔一天注射100 μL 生理鹽水，共注射11 次。②sPL 注射組（B 組）：在保持期間，每只大鼠每隔一天注射sPL100 μL，共注射11 次。③BMSCs 注射組（C 組）：在保持期的第1 天（即實驗第8 天），每只大鼠注射100μL 細胞密度為1×107 個∕L的BMSCs+生理鹽水懸液（含1×106個細胞）；在隨后的保持期間，每只大鼠每隔一天注射100 μL 生理鹽水，共注射10 次。④BMSCs+sPL 注射組（D 組）：在保持期的第1 天（即實驗第8 天），每只大鼠注射100 μL細胞密度為1×107個∕L的BMSCs+sPL懸液（含1×106 個細胞）；在隨后的保持期間，每只大鼠每隔一天注射sPL100 μL，共注射10次。

7.大鼠處死及上頜標(biāo)本的制備

保持21 天后，使用過量麻藥處死所有大鼠，去除大鼠口內(nèi)裝置，測量大鼠上頜中切牙間距離，取出上頜骨樣本，去除軟組織，立即置于4%多聚甲醛中固定48小時，進行后續(xù)的影像學(xué)和組織學(xué)檢查。

8.Micro-CT分析前腭縫成骨情況

樣本置于Micro-CT 掃描管中，在高分辨率Micro-CT 掃描儀載物臺上進行掃描，相關(guān)掃描參數(shù)為：電壓90 kV，電流200 μA，分辨率15 μm。使用VG Studio Max 軟件對圖像進行三維重建和分析。研究分析的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）位于大鼠上頜前腭孔近中4 mm 的前腭縫區(qū)域，厚度為0.6 mm，橫向延伸至前腭縫兩側(cè)各0.75 mm 的范圍（圖3）。測量ROI 內(nèi)前腭縫的三維整體寬度，將與ROI內(nèi)前腭縫體積相等的球體直徑定義為前腭縫的三維整體寬度，等效直徑計算式為：Deq=。測量骨體積分?jǐn)?shù)（BV∕TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分離度（Tb.Sp）評價大鼠前腭縫成骨情況。

圖3 Micro-CT感興趣區(qū)域（ROI）

9.組織學(xué)染色

樣本置于EDTA 脫鈣液中室溫脫鈣1.5 個月，每三天換用新鮮脫鈣液，期間使用針刺法判斷脫鈣的程度。對脫鈣后的樣本進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片處理，切片厚度5 μm。將樣本脫蠟至水，自來水沖洗后染色。蘇木素染液染色8～15 分鐘，流水沖洗1～2 分鐘，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗返藍30～60 分鐘，伊紅染液染色2～5 分鐘，然后流水沖洗、二甲苯透明、中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。每張切片先于低倍鏡下觀察全部組織，選擇前腭縫區(qū)域采集3 張400 倍圖片，測量單位骨小梁周長成骨細胞數(shù)(osteoblast number∕unit trabecular perimeter, Ob.N∕Tb.Pm)和新生血管數(shù)量。

10.統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，進行單因素方差分析和最小差異顯著法（LSD）檢驗，P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.動物模型建立結(jié)果

實驗期間，4 組大鼠均未出現(xiàn)裝置脫落、體重明顯下降、感染等意外情況，生長狀態(tài)良好，全部納入實驗。

（1）大鼠的體重變化情況：由于對擴弓裝置的不適應(yīng)，4組大鼠在擴弓的第1、2天出現(xiàn)明顯的體重下降，從第3 天起進食量增加，體重開始穩(wěn)步增長，整個實驗期間，4 組大鼠平均體重的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 實驗期間大鼠體重變化 g，±s

表1 實驗期間大鼠體重變化 g，±s

A 組，對照組；B 組，sPL 注射組；C 組，BMSCs 注射組；D 組，BMSCs+sPL 注射組；P＞0.05

時間∕天0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 A組201.75±3.86 183.75±4.03 194.00±6.58 208.25±7.27 219.25±5.56 232.50±5.26 243.50±5.07 255.50±5.07 269.75±5.68 282.75±6.18 294.75±5.85 305.75±5.85 318.00±4.40 330.00±2.94 B組202.50±6.81 185.75±7.41 193.75±5.74 208.25±6.13 220.75±7.50 231.75±7.68 244.25±7.76 257.75±8.06 270.25±7.80 283.00±8.98 294.75±8.34 307.00±8.83 318.50±9.33 329.00±9.59 C組201.00±4.55 182.50±5.45 193.00±3.56 206.75±5.56 219.75±6.80 232.50±7.33 246.00±9.20 257.50±8.58 269.25±7.93 282.25±8.54 294.75±8.06 307.50±8.10 319.75±7.59 331.25±7.14 D組199.75±4.43 184.75±2.63 197.75±5.91 209.50±6.76 221.50±6.76 234.50±7.55 247.50±9.47 262.50±9.88 275.25±9.18 288.50±9.47 302.75±8.10 314.00±7.35 325.75±6.75 337.25±6.65

（2）擴弓7 天后大鼠上頜中切牙間寬度測量結(jié)果：在擴弓力作用下，大鼠上頜中切牙之間從緊密接觸變?yōu)閷捈s2.2 mm 左右的間隙，且4 組大鼠中切牙間寬度無顯著差異（P＞0.05，表2），擴弓量基本一致，成功建立大鼠RME 模型。實驗結(jié)束拆除保持裝置時，保持鋼絲無脫落、無形變、無移位，間隙無縮窄。

表2 擴弓7天后大鼠上頜中切牙間寬度變化 mm，±s

表2 擴弓7天后大鼠上頜中切牙間寬度變化 mm，±s

A 組，對照組；B 組，sPL 注射組；C 組，BMSCs 注射組；D 組，BMSCs+sPL 注射組；P＞0.05

時間∕天0 7 A組0 2.23±0.13 B組0 2.28±0.15 C組0 2.23±0.96 D組0 2.26±0.11

2.Micro-CT三維重建與測量分析結(jié)果

（1）前腭縫寬度測量分析：與A 組相比，B、C、D組大鼠前腭縫寬度均縮窄，其中B 組和C 組的前腭縫寬度與A 組無顯著性差異，D 組前腭縫寬度顯著窄于A組（P＜0.05，圖4）。

圖4 Micro-CT前腭縫寬度測量分析

（2）Micro-CT 三維重建和骨組織參數(shù)測量分析：從Micro-CT三維重建圖中可見，D組前腭縫處骨表面修復(fù)效果最好。骨組織參數(shù)測量結(jié)果顯示，B組和D 組BV∕TV 均顯著高于A 組（P＜0.05）；C 組BV∕TV與A組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異；與D組相比，C組BV∕TV 顯著降低（P＜0.05）。D 組Tb.N 測量值與A組相比顯著增加（P＜0.05），B 組和C 組Tb.N 測量值與A 組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。4 組間的Tb.Th 測量值差異無顯著性。A 組Tb.Sp 測量值顯著高于B 組（P＜0.05）和D組（P＜0.01）（圖5）。

圖5 Micro-CT三維重建及骨組織參數(shù)測量分析

3.大鼠前腭縫HE染色的組織學(xué)表現(xiàn)

鏡下觀察可見多呈立方形的成骨細胞呈帶狀或散在分布于前腭縫近骨邊緣處，周圍骨質(zhì)部分區(qū)域呈現(xiàn)出齒狀不齊的外觀。前腭縫區(qū)可見大量的間質(zhì)樣細胞及紅染的纖維組織，被拉長的纖維組織排列方向與擴弓力基本平行，亦見數(shù)量不等的新生血管（圖6）。Ob.N∕Tb.Pm 測量結(jié)果顯示，與A 組相比，B、C、D 組大鼠Ob.N∕Tb.Pm 均有增加，其中B、C 組與A組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），D 組大鼠Ob.N∕Tb.Pm 顯著高于A 組和C 組大鼠（P＜0.05，圖7）。B 組大鼠新生血管數(shù)量顯著高于A 組大鼠（P＜0.05），D 組大鼠新生血管數(shù)量顯著高于A 組大鼠（P＜0.01）和C組大鼠（P＜0.05）（圖8）。

圖6 4組大鼠前腭縫組織學(xué)觀察

圖7 4組大鼠單位骨小梁周長成骨細胞數(shù)

圖8 4組大鼠新生血管數(shù)

討 論

1.大鼠RME模型的建立

相關(guān)研究中，常采用前腭縫快速擴張和腭中縫快速擴張兩種模型對RME 進行研究。腭中縫快速擴張即后牙擴弓法，雖然與臨床中RME 更相似，但其存在一定的弊端。如在安放擴弓裝置時易受口腔空間限制，使大鼠個體間擴弓力值不一致，且使用光固化樹脂粘接于后牙的擴弓裝置會影響大鼠的咬合，易造成大鼠進食困難、體重下降或裝置脫落等問題，進而干擾實驗結(jié)果。相比之下，前腭縫快速擴張有明顯的優(yōu)勢：操作簡單，不受限制；擴弓力大小一致，可重復(fù)性強；擴弓裝置對機體影響較小，較為安全、有效。因此，本實驗采用前腭縫快速擴張對RME 進行研究。文獻報道中，常采用100～200 g 擴弓力進行前腭縫擴張研究[6,7]，力值過大易導(dǎo)致牙周組織損傷和細胞增殖下降，力值過小則不足以擴開前腭縫。本實驗參考張蕾等[8]的研究，使用直徑0.016英寸的不銹鋼絲彎制前腭縫擴弓裝置，提供初始力值為100±5 g，擴弓7 天后大鼠兩切牙平行分開約2.2 mm，組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），擴弓量較為一致。

2.BMSCs對前腭縫骨改建的影響

BMSCs 是存在于骨髓中的非造血干細胞，具有多種分化潛能，在微環(huán)境因素的刺激下，BMSCs能夠分化為成骨細胞，參與注射部位的新骨形成。BMSCs 還可以通過分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 或血管內(nèi)皮細胞生長因子等生長因子來調(diào)節(jié)新骨的形成。作為一種理想的組織工程種子細胞，BMSCs 常與支架材料聯(lián)合應(yīng)用于頜骨缺損修復(fù)[9]、牙周組織再生[10]、顳下頜關(guān)節(jié)疾病治療[11]等口腔醫(yī)學(xué)研究中。RME 結(jié)束時，擴張的前腭縫中具有成骨潛能的細胞數(shù)量處于較低水平，本研究在此時進行BMSCs 單次局部注射，以期促進前腭縫處骨改建。但目前的研究結(jié)果顯示，BMSCs 注射組大鼠Micro-CT 各項測量指標(biāo)及Ob.N∕Tb.Pm 與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），僅在前腭縫內(nèi)單次局部注射BMSCs不能顯著促進骨再生，與Mohaghegh 等[12]和Ebadifar 等[13]的研究結(jié)果相似。與本研究結(jié)果相反，Ekizer 等[14]發(fā)現(xiàn)，注射BMSCs增加了RME后腭中縫處新骨的形成和血管化，認(rèn)為將BMSCs 應(yīng)用于腭中縫可能是提高RME 長期穩(wěn)定性的有效方法。研究結(jié)果不同的原因可能是，Ekizer 等在擴弓后24 小時就進行BMSCs局部注射，促進了RME早期前腭縫內(nèi)的新骨形成。

3.sPL對前腭縫骨改建的影響

sPL 是一種新型血小板濃縮物，富含對干細胞增殖、分化具有促進作用的高濃度生長因子，包括血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、TGF-β、BMP-2、BMP-4、BMP-6、白細胞介素-1等[3]。

PD-ECGF 通過間充質(zhì)干細胞和結(jié)締組織細胞的趨化和有絲分裂啟動傷口愈合，產(chǎn)生細胞粘附分子纖維連接蛋白，并通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖參與血管生成[15]。VEGF 與內(nèi)皮細胞上表達的相關(guān)受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞反應(yīng)，釋放基質(zhì)金屬蛋白酶，消化周圍的細胞外基質(zhì)，允許血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖，促進新生內(nèi)膜形成[16]。IGF 來源于骨細胞、內(nèi)皮細胞和血小板，在骨成熟和骨重塑的后期發(fā)揮作用，其分泌可能受到BMP的刺激[17]。FGF刺激骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨通路的信號傳遞，特別是成骨細胞的形成[18]。TGF-β1 和TGF-β2 刺激成纖維細胞趨化，產(chǎn)生膠原蛋白和纖維連接蛋白，通過降低蛋白酶和增加蛋白酶抑制劑抑制膠原降解，參與破骨細胞凋亡和抑制，加速骨再生[19]。

在本研究中，使用專利方法(專利號：CN 111686305 A)制備了sPL，并使用生物因子培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)和激活sPL。與PRP 或血小板裂解液（platelet lysate，PL）相比，sPL 含有更高純度的生物活性因子，且去除了白細胞、血小板片段和免疫球蛋白，降低了免疫原性，允許異體應(yīng)用。與PRP 相似，sPL 在前12 小時內(nèi)生長因子釋放明顯，約占總釋放量的25%，24 小時后生長因子釋放量約為初始釋放量的一半。因此，在本研究中，需要在保持期間每隔1 天局部注射sPL，以保持局部sPL的持續(xù)有效釋放。實驗結(jié)束時，與對照組大鼠相比，sPL 注射組大鼠BV∕TV 顯著增高（P＜0.05），Tb.Sp 測量值顯著降低（P＜0.05），說明sPL 注射組大鼠前腭縫處骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加，骨小梁排列更緊密。由于反復(fù)向前腭縫處注射sPL，外源性生長因子濃度保持在較高水平，持續(xù)促進RME后前腭縫處新骨形成。

4.BMSCs+sPL 對前腭縫骨改建的協(xié)同促進作用

本研究比較了sPL、BMSCs 單獨注射和BMSCs+sPL 聯(lián)合注射對大鼠RME 后前腭縫骨改建的影響。BMSCs+sPL 聯(lián)合應(yīng)用在促進前腭縫骨改建中具有協(xié)同作用，能夠更有效地促進新骨形成。在本研究中，除了內(nèi)源性生長因子參與前腭縫處成骨活動外，外源性sPL 中含有多種生長因子和細胞因子，為移植的BMSCs 增殖、分化提供良好的細胞外環(huán)境，促進BMSCs 分化為成骨細胞。sPL 還可以促進成骨細胞的激活，增加細胞周期調(diào)節(jié)因子的表達，加速進入細胞周期，增強成骨細胞增殖、分化和新骨形成。相關(guān)實驗證實了上述分析，崔同等[3]將成骨細胞接種至含sPL的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，sPL能明顯促進成骨細胞的增殖和凋亡修復(fù)。Guo 等[5]的動物實驗發(fā)現(xiàn)，sPL 治療組大鼠成骨相關(guān)因子ALP、OCN、COL-1、Runx2、BMP-2、Osterix 的mRNA 相對表達量均高于對照組。sPL 聯(lián)合BMSCs 移植有利于BMSCs的存活、增殖和分化，從而提高干細胞移植治療的有效率。

綜上所述，sPL 單獨應(yīng)用或BMSCs+sPL 聯(lián)合應(yīng)用均能促進大鼠上頜快速擴弓后前腭縫骨改建，促進骨質(zhì)形成。為其在正畸臨床中的應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ)。