葉燕華?黃碧彥?鐘達(dá)均?楊明燦?魏秋靜?古潔若?蔣雨彤

【摘要】目的 分析廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)健康成人外周靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群的分布。方法 收集827名健康成人靜脈全血標(biāo)本，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD3+ T淋巴細(xì)胞、CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+ 雙陽性T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）的比例和 CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值。結(jié)果 CD3+ T淋巴細(xì)胞、CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+ T 淋巴細(xì)胞比值、雙陽性T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例分別為40.5%～75.2%、35.4%～68.9%、27.4%～61.8%、0.6～2.4、0.2%～2.7%和2.4%～6.0%。各淋巴細(xì)胞亞群的分布在不同年齡、性別間分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 < 0.05）。結(jié)論 本研究成功分析了廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)健康成人T淋巴細(xì)胞亞群的分布，可為本地區(qū)臨床醫(yī)師提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】淋巴細(xì)胞亞群；參考值范圍；流式細(xì)胞

Study of distribution of peripheral T-lymphocytes in healthy adults from Chashan Town of Dongguan in Guangdong Province Ye Yanhua△， Huang Biyan， Zhong Dajun， Yang Mingcan， Wei Qiujing， Gu Jieruo， Jiang Yutong.△Department of Otolaryngology， Chashan Hospital of Dongguan， Dongguan， 523000

Corresponding author， Jiang Yutong， E-mail： jiangyt7@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To explore the distribution of T lymphocyte subsets in peripheral blood of healthy adults from Chashan Town of Dongguan in Guangdong Province. Methods The venous whole blood samples were collected from 827 healthy adults. The percentage of CD3+ T cells， CD4+ T cells， CD8+ T cells， CD4+CD8+ double positive （DP） T cells， and regulatory T（Treg） cells and CD4+/CD8+ ratio were determined by flow cytometry. Results The percentage of CD3+ T cells， CD4+ T cells， CD8+ T cells， CD4+/CD8+ ratio， DP T cells and Treg cells were determined as 40.5%-75.2%， 35.4%-68.9%， 27.4%-61.8%， 0.6-2.4， 0.2%-2.7% and 2.4%-6.0%， respectively. Significant differences were observed in the distribution of lymphocyte subsets regarding age and gender （all P < 0.05）. Conclusion The distribution of T lymphocyte subsets in healthy adults from Chashan Town of Dongguan in Guangdong Province was successfully analyzed， providing valuable reference for clinicians in this region.

【Key words】Lymphocyte subset； Reference range； Flow cytometry

外周血淋巴細(xì)胞對(duì)于維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞通過體液和細(xì)胞免疫促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定對(duì)感染、移植排斥反應(yīng)、風(fēng)濕免疫病、惡性腫瘤等疾病的診斷具有重要價(jià)值［1］。分析健康個(gè)體中這些免疫細(xì)胞的比例可以幫助鑒定患者的免疫狀況。既往研究表明，淋巴細(xì)胞亞群的分布與性別、年齡、種族和生活方式等因素相關(guān)［1-2］。我國地大物博，不同地域人民的生活環(huán)境與習(xí)慣有較大差別，因此有必要分析本地區(qū)淋巴細(xì)胞亞群的分布。茶山鎮(zhèn)位于東莞市中北部，常住人口21.97萬人，男/女構(gòu)成比約為1.3∶1。筆者對(duì)廣東省東莞市茶山地區(qū)常住人口健康成人的淋巴亞群百分比進(jìn)行了檢測(cè)，分析了不同性別和年齡健康成人淋巴細(xì)胞亞群之間的差異，初步探索廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)健康成人T淋巴細(xì)胞亞群的分布，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

本研究的研究時(shí)間為2020年10至12月，納入至東莞市茶山醫(yī)院的827名健康體檢者，均為當(dāng)?shù)爻Ｗ【用?。研究?duì)象均為漢族，其中男479名（男性組）、女348名（女性組）。年齡22～79歲。根據(jù)年齡段將研究對(duì)象分為4個(gè)年齡組，即22～30歲組、31～40歲組、41～50歲組和51～79歲組。研究對(duì)象排除患有系統(tǒng)性疾病、感染、惡性腫瘤和正在服用可能會(huì)影響免疫系統(tǒng)的藥物（即糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等）的受試者。研究得到東莞市茶山醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)［批件號(hào)：2021（20）］，所有參與者已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 主要儀器與試劑

使用以下抗體用于流式細(xì)胞術(shù)：抗CD3、CD4、CD8、CD127、CD19、CD56和CD25抗體（Biolegend，美國）。熒光染料使用CD3-APC-Cy7、CD4-FITC、CD8-PerCP-Cy5.5、CD127-PE、CD19-AF700、CD56-PE-Cy7和CD25-BV421。使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀 （Beckman，美國）分析樣品。

2. 檢測(cè)方法

采集研究對(duì)象外周靜脈血3 mL，用依地酸二鉀抗凝，并于6 h內(nèi)檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作：取專用試管內(nèi)加入熒光素標(biāo)記抗體

10 μL，抗凝全血50 μL，振蕩混勻并在室溫下孵育20 mL。然后加入溶血素2 mL，充分混勻后避光溶血15 min，離心后棄上清，用2 mL磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，離心后棄上清，加450 mL PBS待測(cè)。標(biāo)本制備后立即上機(jī)運(yùn)行，分析CD3+ T淋巴細(xì)胞、CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 （Treg，CD3+CD4+CD25+CD127-）的比例并計(jì)算CD4+/CD8+ T 淋巴細(xì)胞的比值（CD4+/CD8+）。分析不同性別、不同年齡健康成人淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果間的差異。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，用M（P25，P75）或參考值范圍（RR）表示。每個(gè)淋巴細(xì)胞亞群的RR定義為百分位數(shù)2.5%～97.5%［1］。不同年齡和性別的亞組之間的比較中，2組數(shù)據(jù)選用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較使用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)。使用Spearman秩相關(guān)分析確定年齡和免疫細(xì)胞百分比的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。

結(jié)果

一、不同性別健康成人的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

男性組年齡為39（33，46）歲，女性組年齡為37（31，44）歲，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z =

?1.892，P = 0.058）。男性組的CD4+ T淋巴細(xì)胞百分比為47.6（43.0，55.6）%，女性組為49.5 （44.0，56.8）%，其中男性組的CD4+ T淋巴細(xì)胞比例更低（Z = 2.838，P = 0.005）。男性組CD8+ T淋巴細(xì)胞比例為43.3（36.6，50.9）%，女性組為40.0（34.7，46.8）%，其中男性組的CD8+ T淋巴細(xì)胞比例更高（Z = ?4.400，P < 0.001）。健康男性的雙陽性T淋巴細(xì)胞比例為1.3（1.1，1.5）%，女性組為1.4 （1.1，1.7）%，其中男性組的雙陽性T淋巴細(xì)胞比例更低（Z = 2.705，P = 0.007）。見表1。

二、不同年齡健康成人的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

不同年齡組的CD4+CD8+ T淋巴細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H = 4.011，P = 0.260），而其余T淋巴細(xì)胞亞群在不同年齡組的分布比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。其中CD4+ T淋巴細(xì)胞（H = 47.197，P < 0.001）及CD4+/CD8+（H = 50.784，P < 0.001）隨著年齡增長而升高，CD8+ T淋巴細(xì)胞隨著年齡增長而下降（H = 42.007，P <

0.001）。31～40歲以上年齡越大的人群CD3+ T淋巴細(xì)胞比例隨著年齡增長有下降趨勢(shì)，其中51～79歲人群較31～40歲人群的CD3+ T淋巴細(xì)胞下降（P <

0.001）。CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞比例在40歲以上和40歲以下人群間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。Bonferroni法校正顯示，Treg比例在22～30歲和31～40歲年齡組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >

0.008），Treg比例在50歲以上人群明顯下降，在51～79歲和22～30歲年齡組的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.003）。見表2。Spearman相關(guān)性分析顯示，年齡與CD4+ T淋巴細(xì)胞（rs = 0.269，P <

0.001）、CD4+/CD8+比值（rs = 0.275，P < 0.001）呈

正相關(guān)，而與CD3+ T淋巴細(xì)胞（rs =?0.102，P = 0.003）、CD8+ T淋巴細(xì)胞（rs = ?0.248，P < 0.001）和Treg（rs = ?0.112，P = 0.001）呈負(fù)相關(guān)。

討論

T 淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的一組免疫細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化發(fā)育可分別經(jīng)歷雙陰性細(xì)胞階段， 其主要表型為 CD4-CD8-；雙陽性細(xì)胞階段，其主要表型為CD4+ CD8+；最后為單陽性細(xì)胞階段，由雙陽性細(xì)胞經(jīng)正、負(fù)選擇過程， 分化發(fā)育為具有免疫功能的成熟T淋巴細(xì)胞， 其主要表型為只表達(dá)CD4+或CD8+［3］。T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量反映個(gè)體的免疫功能狀態(tài)，與免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等許多疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［4］。外周免疫細(xì)胞的百分比可能因種族、年齡和性別的不同而有所差異，因此需要評(píng)估種族、年齡和性別特定人群的T淋巴細(xì)胞的分布，作為評(píng)估個(gè)人免疫功能的依據(jù)。本研究首次分析東莞市茶山地區(qū)的健康成人T淋巴細(xì)胞亞群的比例，并提出該人群的RR，對(duì)指導(dǎo)臨床診斷和治療具有重要的意義。

本研究通過對(duì)廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)827名健康志愿者的T淋巴細(xì)胞分布進(jìn)行分析，制定出茶山地區(qū)健康人外周血的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD8+和Treg的RR分別為40.5%～75.2%、35.4%～68.9%、27.4%～61.8%、0.6～2.4、0.2%～2.7%和2.4%～6.0%。與國內(nèi)地區(qū)的健康成人T淋巴細(xì)胞亞群RR比較，廣東地區(qū)的T淋巴細(xì)胞和CD4+/CD8+比例與北京、重慶、山西地區(qū)的相似，但CD8+ T淋巴細(xì)胞比例均有升高，體現(xiàn)了T淋巴細(xì)胞亞群的區(qū)域差異［2， 5］。Treg能夠抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受，對(duì)維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。本研究中，不同性別健康人群的Treg的比例無顯著性差異，但51～79歲健康人的Treg百分比較小于30歲人群的百分比減低，這與部分研究結(jié)果不同，可能是由于不同研究Treg標(biāo)志物的差異［6］。Treg通過維持對(duì)自身抗原的無反應(yīng)和抑制過度的免疫反應(yīng)來促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)。隨著年齡的增加，Treg比例下降可能與年齡相關(guān)疾病有關(guān)［7］。Treg參考范圍的建立，有助于幫助評(píng)估個(gè)體的免疫功能及進(jìn)行相關(guān)研究。

T淋巴細(xì)胞亞群的分布受年齡等因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)外周CD4+ T淋巴細(xì)胞的比例隨著年齡升高，CD8+ T淋巴細(xì)胞比例隨著年齡下降，這部分與既往研究相一致，但與部分研究結(jié)果相反［5-6］。研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群隨著年齡的變化提示可能是由于機(jī)體的免疫力隨著年齡的增長對(duì)各種外界因素的耐受力的降低。CD8+ T淋巴細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)增殖時(shí)保持細(xì)胞靜止的能力較低，而CD4+ T細(xì)胞更高的抗衰老能力［8］。同時(shí)，部分年齡組的淋巴細(xì)胞亞群比例存在顯著差異，這可能與研究人群不同的年齡分布及地域、生活方式的不同相關(guān)。T淋巴細(xì)胞亞群的分布也與性別密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，健康男性的CD4+ T淋巴細(xì)胞比例較女性減少，而CD8+ T淋巴細(xì)胞比例較女性升高，這與既往研究相一致，但與部分研究的發(fā)現(xiàn)不同［5， 9］。相關(guān)差異有待開展進(jìn)一步研究證實(shí)。

外周血雙陽性T淋巴細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中的比例很低，但在病理狀態(tài)下，如自身免疫性疾?。ㄏ到y(tǒng)性硬化癥） 及病毒感染（HIV感染等）等情況下，外周雙陽性T表達(dá)水平上升，其臨床意義仍不明確［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)不同性別健康人雙陽性T淋巴細(xì)胞比例無明顯差異，年齡與雙陽性淋巴細(xì)胞無顯著相關(guān)，這與既往的報(bào)道相一致［12］。需要更多研究去發(fā)現(xiàn)雙陽性 T淋巴細(xì)胞的作用及變化的意義。本研究對(duì)健康人雙陽性 T淋巴細(xì)胞比例的探究有助于分析及比較疾病狀態(tài)下雙陽性T淋巴細(xì)胞的變化及意義。

值得指出的，本研究年齡段為51～79歲的健康人的數(shù)量相對(duì)較少，對(duì)該年齡段參考范圍的建立可能有一定影響。本研究對(duì)象為東莞市茶山醫(yī)院的健康體檢者，未能全面反映當(dāng)?shù)厝丝诘那闆r；納入研究對(duì)象的時(shí)間較短，未考慮到季節(jié)氣候和季節(jié)性流行病等因素對(duì)結(jié)果的影響。而且，本研究只選取了本地一家醫(yī)院的健康查體者作為研究對(duì)象，所以未來的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究對(duì)象、延長研究時(shí)間，從而得到更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。此外，除了不同地區(qū)、種族、年齡、性別等因素會(huì)對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生影響，不同實(shí)驗(yàn)室采用的檢測(cè)方法、儀器試劑和標(biāo)本保存時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果存在差異［13］。綜上所述，分析不同地區(qū)T淋巴細(xì)胞亞群的分布及參考范圍的設(shè)立，有助于準(zhǔn)確了解實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于醫(yī)師準(zhǔn)確判斷本地區(qū)患者病情有重要意義。

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（收稿日期：2022-06-10）

（本文編輯：林燕薇）