楊峰,胡承剛,嚴玲,李先芝*,陳彥和,胡楊

1(勁牌有限公司,湖北 大冶,435100)2(中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室,湖北 大冶,435100)

保健酒是一種具有某些特定保健養(yǎng)生功能的飲料酒,根據(jù)2019年2月1日起實施的T/CBJ 5102—2019《保健酒》,將保健酒定義為以蒸餾酒、發(fā)酵酒或食用酒精為基酒,加入符合國家相關規(guī)定的原料、輔料或食品添加劑,經(jīng)注冊或備案,并聲稱具有保健功能的飲料酒。保健酒適用于特定人群食用,它不以治療疾病為目的,對人體不產(chǎn)生危害,主要用于調(diào)節(jié)機體的功能,在養(yǎng)生保健方面具有顯著的功效和作用。

保健酒在中國歷史悠久,古人以酒泡藥材制成,其原理是利用一定濃度的白酒通過浸泡的方式將藥材中有用的成分提取出來,飲后具有特定的保健養(yǎng)生效果;現(xiàn)代采用新興技術將藥材原料中的有效成分以更加科學的方法提取出來,通過提取、滲漉、調(diào)配等工藝制成保健酒,生產(chǎn)過程中對重要功效成分進行控制,保證保健酒質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

追風八珍酒是以清香型小曲原酒為基酒,以黃芪、杜仲、五加皮、枸杞子、天麻、桑椹、制黃精、木瓜共八味藥材以及一味風味藥材肉桂為藥材原料,提取藥材的有效成分,運用中醫(yī)組方以適合比例混合精制而成的一款具有增強免疫力功效的保健酒。本研究采用液相色譜結(jié)合中藥材指紋圖譜技術研究追風八珍酒的微量成分,并對微量成分的功效進行分析,為追風八珍酒的健康內(nèi)涵提供科學依據(jù)。

1 追風八珍酒微量成分含量分析

對追風八珍酒的微量成分進行分離提純,采用液相色譜分析技術,對其原料藥材中可能存在的化學成分以保留時間及二極管陣列檢測器(diode array detector,DAD)全波長吸收曲線定性,最終分離出了響應值較高的7種特征化合物,并對其含量進行了測定。

1.1 微量成分分離提純

取酒樣10 mL于50 ℃減壓蒸至近干,用5 mL水溶解殘渣,上HLB固相萃取柱(SelectCore HLB 200 mg 6 mL),用10 mL水預洗,去掉水洗脫液,再用10 mL 50%(體積分數(shù))乙醇洗脫,收集洗脫液,于50 ℃減壓蒸至近干,殘渣用50%(體積分數(shù))甲醇溶解,定容至5 mL,搖勻。

1.2 高效液相色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(如Agilent SB-Aq C18色譜柱4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈為流動相A,0.1%磷酸溶液為流動相B,梯度洗脫(0～10 min,5%～10%A;10～60 min,10%～20%A);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長為210 nm;進樣量20 μL。

1.3 微量成分含量測定

經(jīng)分離提純的樣品采用以上色譜條件檢測分析,得到原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁共7種微量成分的含量,分析了6批次追風八珍酒微量成分,檢測結(jié)果如表1所示,追風八珍酒微量成分色譜圖如圖1所示。

圖1 追風八珍酒微量成分色譜分析圖Fig.1 Chromatographic analysis of trace components in Zhuifengbazhen wine

1.4 追風八珍酒微量成分含量分析測定

追風八珍酒經(jīng)分離提純,采用液相色譜技術分析,利用色譜峰保留時間及DAD全波長掃描吸收曲線定性,最終鑒定出了原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁共7種含量相對較高的微量成分。

2 追風八珍酒微量成分來源篩查

追風八珍酒采用了黃芪、杜仲、五加皮、枸杞子、天麻、桑椹、制黃精、木瓜八味主體藥材,一味風味藥材(肉桂),為了解和確認追風八珍酒微量成分的來源,采用中藥指紋圖譜技術對追風八珍酒及其使用的原料藥材進行研究,以更好地了解藥材中有效成分向追風八珍酒中的轉(zhuǎn)移情況。

2.1 供試品溶液的制備

追風八珍酒使用的藥材原料種類較多,且中藥材成分復雜多樣,故追風八珍酒及藥材原料指紋圖譜供試品溶液制備過程中分兩步洗脫,得到水飽和乙醚部位及無水乙醇部位供試品溶液,并選擇合適的色譜條件分別進行分析,以此優(yōu)化各種化合物的分離效果。

2.1.1 追風八珍酒供試品溶液的制備

量取10 mL追風八珍酒,于40 ℃減壓蒸至近干,上樣于Copure HLB固相萃取小柱(規(guī)格:200 mg/6 mL,上柱前先用6 mL甲醇和12 mL水活化,下同),水洗40 mL,然后用10 mL水飽和乙醚洗脫,收集洗脫液,取乙醚層,50 ℃旋蒸至干,殘渣用1 mL 50%甲醇溶解,搖勻,即得水飽和乙醚部位供試品溶液;再用10 mL 無水乙醇洗脫,收集洗脫液,50 ℃旋蒸至干,殘渣用1 mL 50%甲醇溶解,搖勻,即得無水乙醇部位供試品溶液。

2.1.2 藥材供試品溶液的制備

根據(jù)藥材有效成分的性質(zhì),將追風八珍酒中用到的藥材分為兩組,采用兩種方法分別進行提取提純制備供試品溶液:

第一組:桑椹、制黃精、木瓜,各取藥材粉末1 g,加入100 mL水,加熱回流提取2 h,取出,放冷,過濾,取濾液10 mL,上樣于Copure HLB固相萃取小柱,后續(xù)同追風八珍酒供試品溶液的制備方法制備藥材供試品溶液。

第二組:黃芪、杜仲、五加皮、枸杞子、肉桂、天麻,各取藥材粉末1 g,加入100 mL 50%乙醇,加熱回流提取2 h,取出,放冷,過濾,取濾液10 mL,40 ℃減壓蒸至近干,上樣于Copure HLB固相萃取小柱,后續(xù)同追風八珍酒供試品溶液的制備方法制備藥材供試品溶液。

2.2 指紋圖譜色譜條件

2.2.1 水飽和乙醚部位

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(如Sepax HP-C18色譜柱 4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.1%(體積分數(shù))磷酸溶液梯度洗脫(表2);檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;流速1.0 mL/min。

表2 追風八珍酒水飽和乙醚部位指紋圖譜梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of fingerprints of the water saturated diethyl ether part of Zhuifengbazhen wine

2.2.2 無水乙醇部位

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(如Sepax HP-C18色譜柱 4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫(表3);檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;流速1.0 mL/min。

表3 追風八珍酒無水乙醇部位指紋圖譜梯度洗脫條件Table 3 Gradient elution conditions of fingerprints of the absolute ethanol part of Zhuifengbazhen wine

2.3 色譜峰的指認

2.3.1 水飽和乙醚部位指紋圖譜色譜峰的指認

對比追風八珍酒與各藥材水飽和乙醚部位指紋圖譜,以保留時間及DAD光譜圖定性,分別查找追風八珍酒中7種微量成分的來源。水飽和乙醚部位指紋圖譜分析結(jié)果表明,追風八珍酒水飽和乙醚部位中原兒茶酸主要來源于桑椹、木瓜,綠原酸來源于五加皮,如表4所示。

表4 追風八珍酒水飽和乙醚部位指紋圖譜色譜峰來源考察Table 4 Investigation on the source of the chromatographic peaks of the fingerprints of the water saturated diethyl ether part of Zhuifengbazhen wine

追風八珍酒及其原料藥材水飽和乙醚部位指紋圖譜如圖2、圖3所示。

圖2 追風八珍酒水飽和乙醚部位指紋圖譜Fig.2 Fingerprint analysis of water saturated diethyl ether parts of Zhuifengbazhen wine

圖3 藥材水飽和乙醚部位指紋圖譜Fig.3 Fingerprint analysis of water saturated diethyl ether parts of medicinal materials

2.3.2 無水乙醇部位指紋圖譜色譜峰的指認

對比追風八珍酒與各藥材無水乙醇部位指紋圖譜,以保留時間及DAD光譜圖定性,分別查找追風八珍酒中7種微量成分的來源。無水乙醇部位指紋圖譜分析結(jié)果表明,追風八珍酒無水乙醇部位中綠原酸主要來源于五加皮、杜仲、桑椹,巴利森苷B來源于天麻,松脂醇二葡萄糖苷來源于杜仲,毛蕊異黃酮葡萄糖苷來源于黃芪,巴利森苷A來源于天麻,蘆丁來源于桑椹、枸杞,如表5所示。

表5 追風八珍酒無水乙醇部位指紋圖譜色譜峰來源考察Table 5 Investigation on the source of the chromatographic peaks of the fingerprints of the anhydrous ethanol part of Zhuifengbazhen wine

追風八珍酒及其原料藥材無水乙醇部位指紋圖譜如圖4和圖5所示。

圖4 追風八珍酒水飽和乙醚部位指紋圖譜Fig.4 Fingerprint analysis of anhydrous ethanol parts of Zhuifengbazhen wine

圖5 藥材無水乙醇部位指紋圖譜Fig.5 Fingerprint analysis of anhydrous ethanol parts of medicinal materials

2.4 追風八珍酒微量成分來源篩查結(jié)論

綜合追風八珍酒及其藥材原料水飽和乙醚部位及無水乙醇部位指紋圖譜分析結(jié)果,研究表明,追風八珍酒微量成分中綠原酸主要來源于五加皮、杜仲及桑椹;原兒茶酸主要來源于桑椹及木瓜;巴利森苷A和巴利森苷B來源于天麻;松脂醇二葡萄糖苷來源于杜仲;毛蕊異黃酮葡萄糖苷來源于黃芪;蘆丁來源于桑葚及枸杞。運用中藥指紋圖譜技術,確認了7種微量成分的來源,同時也證實了這7種微量成分來自這八味天然中藥材。

3 微量成分的功效探討

近年來,國內(nèi)外眾多學者開展過很多研究,證實了原兒茶酸、綠原酸、蘆丁及松脂醇二葡萄糖苷等化合物具有某些特定的藥理作用及功效,這些化合物是追風八珍酒藥理作用的基礎。

研究表明,綠原酸具有增強免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒、降壓、抗腫瘤、降血糖、降血脂,抗炎等作用。PARK 等[1]研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素1受體相關激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4,IRAK4)是綠原酸調(diào)節(jié)免疫力的分子靶點。ABAIDULLAH等[2]首次在體內(nèi)外研究綠原酸對傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的抗病毒特性,結(jié)果表明在高濃度下綠原酸是一種強抗IBV的化合物,能有效地通過黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation related gene 5,MDA5)、Toll樣受體7(toll-like receptors 7,TLR7)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路調(diào)節(jié)固有免疫。GUO 等[3]研究綠原酸的異構(gòu)化和氧化作用對RAW264.7巨噬細胞中核轉(zhuǎn)錄因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2)和NF-κB 信號通路的潛在免疫調(diào)節(jié)活性的影響,結(jié)果表明異構(gòu)化和氧化通過Nrf2和NF-κB通路顯著影響綠原酸的免疫調(diào)節(jié)。張建華等[4]考察綠原酸對小鼠細胞免疫和體液免疫的影響,結(jié)論表明綠原酸可明顯增強機體細胞免疫和體液免疫的功能。劉迪等[5]從榆葉中分離純化黃酮類化合物和綠原酸,通過動物實驗和自由基清除實驗研究其體內(nèi)外抗氧化活性,結(jié)果表明杜仲葉綠原酸具有顯著的體內(nèi)外抗氧化活性。KABIR 等[6]采用分光光度法評定綠原酸的抑菌效果,結(jié)果表明綠原酸及其相關化合物不僅具有抑菌作用,而且具有殺菌效果。DING 等[7]研究綠原酸對甲型流感病毒的抗病毒作用及其可能的作用機制,結(jié)果表明綠原酸在細胞和動物模型中均可作為神經(jīng)氨酸酶阻斷劑抑制甲型流感病毒。李旭等[8]研究杜仲葉綠原酸提取工藝優(yōu)化及對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用,結(jié)果表明綠原酸提取物高劑量組對自發(fā)性高血壓大鼠具有良好且穩(wěn)定的降壓效果。ZENG 等[9]研究綠原酸對乳腺癌的抗腫瘤活性,研究表明綠原酸通過損傷NF-κB/EMT信號通路,提高了乳腺癌的抗腫瘤免疫功能,發(fā)揮了抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用。袁俊[10]通過對小鼠口服耐糖體內(nèi)實驗,比較小鼠空腹服用淀粉及同時服用淀粉和綠原酸血糖濃度的變化,結(jié)果表明綠原酸可以抑制淀粉所致的血糖濃度上升,而這一抑制作用可能是通過抑制α-淀粉酶來實現(xiàn)的。ZHONG等[11]研究綠原酸對肥胖小鼠的降脂作用及其解脂機制,結(jié)果表明綠原酸可以改善肥胖小鼠血脂和肝功能,其機制可能與過氧化物酶體增生物激活受體γ輔激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 α,PGC-1α)/解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)通路有關。LUO 等[12]采用活的痤瘡丙酸桿菌誘導ICR小鼠耳部皮膚炎癥模型探討綠原酸對痤瘡的影響及其機制,結(jié)果表明綠原酸有效地挽救了痤瘡丙酸桿菌誘導的ICR小鼠耳腫脹、紅腫和紅斑皮膚,并通過降低NF-κB信號通路的活性顯著下調(diào)炎性細胞因子的表達。

原兒茶酸具有增強免疫力、抑菌、抗炎、抗氧化等作用。GUO等[13]評估了SPF雞對原兒茶酸的體液和細胞反應,結(jié)果表明原兒茶可以通過增強體液免疫和細胞免疫反應來改善家禽健康。蘆平等[14]研究原兒茶酸對副溶血弧菌的抑菌活性和減毒作用,并揭示原兒茶酸抑菌的作用機制,結(jié)果表明原兒茶酸主要作用于細胞膜,通過影響細胞膜的完整性和通透性抑制副溶血弧菌的生長,在亞抑菌濃度下便可有效減弱副溶血弧菌毒力。KAEWMOOL等[15]通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1),考察原兒茶酸對小膠質(zhì)細胞活化誘導的神經(jīng)細胞死亡是否具有抗炎作用,結(jié)果表明SIRT1介導原兒茶酸的抗神經(jīng)炎癥作用可以改善小膠質(zhì)細胞活化誘導的神經(jīng)元死亡。近年研究表明,原兒茶酸具有體內(nèi)外抗氧化活性的藥理作用[16]。

蘆丁具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗炎等作用。GANESHPURKAR等[17]通過遲發(fā)型超敏反應、碳廓清試驗、白細胞動員試驗和環(huán)磷酰胺誘導的骨髓抑制測定蘆丁對細胞免疫的影響,通過血凝抗體滴度測定蘆丁對體液免疫的影響,研究結(jié)果表明蘆丁具有通過細胞和體液介導的機制增加免疫活性的作用。此外,蘆丁及其代謝產(chǎn)物被證實還具有抗氧化及抗炎作用[18]。

松脂醇二葡萄糖苷具有降血壓、改善骨質(zhì)疏松等作用。韓莉娟[19]分別采用正常動物、模型動物、離體器官,在整體和離體水平研究了松脂醇二葡萄糖苷不同給藥方式、給藥周期對于血壓的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明松脂醇二葡萄糖苷是一種高效、安全的天然降壓活性成分。ZHANG 等[20]探討松脂醇二葡萄糖苷對地塞米松誘導的大鼠骨質(zhì)疏松的影響,結(jié)果表明松脂醇二葡萄糖苷通過增加骨量和調(diào)節(jié)骨代謝對地塞米松誘導的骨質(zhì)疏松表現(xiàn)出保護作用。

毛蕊異黃酮苷具有治療骨關節(jié)疾病、抗腫瘤、抗氧化等作用。JIAN 等[21]探討毛蕊異黃酮苷在骨髓基質(zhì)細胞系ST2細胞中的成骨作用及其機制,結(jié)果表明毛蕊異黃酮苷通過調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP/WNT信號通路促進ST2細胞成骨分化,毛蕊異黃酮苷可以改善骨質(zhì)減少性疾病和促進骨再生。厲婷等[22]探討毛蕊異黃酮苷對卵巢上皮性癌細胞的增殖抑制和誘導凋亡的作用及其可能機制,結(jié)論表明毛蕊異黃酮苷能夠通過抑制人卵巢上皮性癌細胞SKOV3增殖,并誘導其凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用,其機制可能與p53和Caspase-3通路激活有關。劉靖麗等[23]考察中藥黃芪中黃酮類化合物的抗氧化活性強弱,研究表明毛蕊異黃酮苷具有較強的抗氧化活性。

4 結(jié)論與討論

本研究鑒定了追風八珍酒中主要有綠原酸、原兒茶酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A及蘆丁等微量成分,對含量進行了測定,并確認了這些微量成分分別來自于哪幾味天然中藥材原料。近些年來,眾多學者開展過很多試驗,證實了這些化合物具有增強免疫力、抗菌、抗氧化、降血壓等多方面的功效,其中綠原酸、原兒茶酸及蘆丁均具有增強免疫力的作用。此研究為追風八珍酒具有增強免疫力等功效提供了科學依據(jù),同時為保健酒微量成分的研究提供了一種可以借鑒的方法。