馬晨陽,黃丕苗,段萍,王璐,馮西婭,闞建全*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(中匈食品科學聯(lián)合研究中心,重慶,400715) 3(農業(yè)部農產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶),重慶,400715) 4(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室(重慶),重慶,400715)

白鰱(Hypophthalmichthysmolitrix),隸屬于鯉形目,鯉科,鰍亞科,鰱屬,為我國四大淡水魚之一。白鰱富含優(yōu)質蛋白、不飽和脂肪酸和微量元素,同時具有價格低廉、抗病性強、生長迅速等優(yōu)點,深受食品企業(yè)和消費者的歡迎,對于豐富人類膳食結構具有重要作用[1]。但白鰱肉中普遍存在腥味較重的缺點,嚴重降低了白鰱肉的食用品質和商業(yè)接受度。腥味產(chǎn)生的原因主要有3個,分別是環(huán)境因素、脂肪氧化以及微生物作用。首先是淡水魚在生長過程中會吸附環(huán)境中的異味物質;其次是不飽和脂肪酸在微生物和內源酶的作用下氧化所產(chǎn)生的醛酮類物質和三甲胺(trimethylamine,TMA)[2]。目前,脫除腥味的方法主要有物理法、化學法和生物法。物理脫腥法存在較大的應用限制,且效果較差。生物脫腥不僅會產(chǎn)生其他異味,并且會對魚產(chǎn)品理化性質造成影響。化學脫腥中化學物質的殘留以及可能產(chǎn)生其他有害物質會引起公眾擔憂[3]。因此,急需尋找一種綠色天然的脫腥劑替代品。

迷迭香(Rosmarinusofficinalis)是一種產(chǎn)自地中海地區(qū)的芳香植物,除具有抗動脈粥樣硬化、抗抑郁、抗炎和抗菌活性外,還被廣泛用作烹飪香料,并且能顯著提高食品的感官特性[4]。黃丕苗等[5]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香提取物能顯著降低白鰱肉的腥味物質含量和提高其感官品質。MARTNEZ-ZAMORA等[4]發(fā)現(xiàn)使用迷迭香提取物處理后可以有效地降低魚餅的TMA含量和改善魚肉餅的風味。目前使用天然植物提取物浸泡脫腥已被廣泛使用,雖然天然植物提取物中多酚、蛋白質和多糖與揮發(fā)性物質之間具有相互作用,并影響揮發(fā)性化合物濃度[6],但對于天然植物提取物中哪些組分具有脫腥效果尚不明確。

因此,本文以白鰱為研究對象,擬采用分別脫除多酚、多糖和蛋白質后的迷迭香水提取物(Rosmarinusofficinalisaqueous extract,RE)對白鰱肉進行浸泡脫腥試驗;以感官腥味值、揮發(fā)性成分含量變化作為脫腥效果評價指標,考察具有脫腥作用的組分;采用液相色譜/質譜聯(lián)用技術對RE中的酚類物質進行定性與定量分析,選擇不同濃度酚類單體物質進行脫腥實驗。本文旨在探索RE中具有脫腥效果的組分及其主要脫腥活性物質,為進一步明確迷迭香提取物脫腥機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RE,西安圣青生物科技有限公司;白鰱(1.40～1.50 kg),重慶北碚區(qū)天生麗街永輝超市。將活魚處理后,切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊。

分析純試劑:無水碳酸鈉、苯酚、無水葡糖糖、乙醇、硫酸氫鈉,成都市科隆化工試劑廠;福林酚,北京索萊寶科技有公司;沒食子酸、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP)、庚醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、E-2-辛烯醛、壬醛和癸醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;濃硫酸,川東化工。

色譜純試劑:2-辛醇、迷迭香酸、甲醇和己醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鼠尾草酸、鼠尾草酚,北京索萊寶科技有限公司;乙腈、甲酸,成都市科隆化工試劑廠。

總蛋白定量測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

固相微萃取頭(配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維),美國Supelco公司;Agilent 1260型超高效液相色譜儀,美國Agilent公司;QP 2010 Plus型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀,日本島津公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器,河南予華儀器有限公司;SQP電子分析天平,德國賽多利斯科學儀器有限公司;Synergy H1全波長酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;5810型臺式高速離心機,德國Eppendorf公司;impact Ⅱ型高分辨率質譜儀,德國布魯克科技有限公司;ALPHA1-4/2-4LSC 型冷凍干燥機,德國CHRIST公司;YF-111B型中藥粉碎機,西安市永歷制藥機械有限公司;YM-080S型超聲儀,深圳市方奧微電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RE不同組分對白鰱肉腥味脫除實驗

1.3.1.1 RE的提取

參照TAJNER-CZOPEK等[7]的方法并略作修改。將迷迭香置于真空冷凍干燥機中進行凍干,之后使用研磨機將其粉碎。稱取迷迭香粉末2 g置于圓底燒瓶中,加入100 mL蒸餾水混合,加入1 g/L的NaHSO3,將混合物進行超聲提取,超聲提取的條件為:功率220 W,時間15 min,溫度25 ℃。超聲提取后以5 000 r/min離心10 min,取其上清液置于旋轉蒸發(fā)儀中進行干燥。收集其干燥物于棕色小瓶中于-20 ℃保存待用。

1.3.1.2 對比試驗

稱取0.1 g的RE,溶解于超純水中并定容至100 mL,設為C1組。C1組為未經(jīng)任何處理的迷迭香水提物原液,然后隨機選取預處理后的白鰱肉塊,稱重,并浸泡在C1溶液中,料液比為1∶3(g∶mL),浸泡時間30 min,然后進行揮發(fā)性成分測定和感官評價,此為對比組試驗。

1.3.1.3 RE多酚對白鰱肉脫腥效果的影響

分別向未經(jīng)任何處理的迷迭香水提物原液C1組中加入0.5、1、2 g/L溶脹PVPP[V(PVPP)∶V(超純水)=1∶10,溶脹60 min以上]脫除多酚。在室溫下靜置1 h后離心(9 000×g,15 min),取上清液分別得到C2、C3、C4組,進行總酚、總糖和總蛋白測定。隨機選取預處理后的白鰱肉塊,稱重,并浸泡在C2、C3、C4組溶液中,料液比(g∶mL)為1∶3,浸泡時間30 min,然后進行揮發(fā)性成分測定和感官評價。

1.3.1.4 RE多糖對白鰱肉脫腥效果的影響

分別向未經(jīng)任何處理的RE原液C1組中加入400 mL的無水乙醇以脫除多糖,在4 ℃下條件下靜置24 h后離心(10 000 ×g,15 min)得到上清液,旋轉蒸發(fā)去除多余乙醇,再溶解于超純水和3%(體積分數(shù))乙醇溶液中,定容至100 mL得到C5組,進行總酚、總糖和總蛋白測定。隨機選取預處理后的白鰱肉塊,稱重,并浸泡C5組溶液中,料液比為1∶3(g∶mL),浸泡時間30 min,然后進行揮發(fā)性成分測定和感官評價。

1.3.1.5 RE蛋白質對白鰱肉脫腥效果的影響

分別向未經(jīng)任何處理的RE原液C1組中加入適量的三氯乙酸以脫除蛋白質,調節(jié)質量濃度為150 g/L后定容至100 mL。充分混勻后在-20 ℃下靜置2 h,離心(10 000×g,15 min)后取上清液得到C6組,進行總酚、總糖和總蛋白測定。隨機選取預處理后的白鰱肉塊,稱重,并浸泡C6組溶液中,料液比為1∶3(g∶mL),浸泡時間30 min,然后進行揮發(fā)性成分測定和感官評價。

1.3.2 RE中酚類物質的定性與定量

稱取0.1 g的RE,配制成1 mg/mL溶液,過0.22 μm的微孔濾膜后待測。

1.3.3 酚類單體物質對白鰱肉的脫腥效果和脫腥能力評價

隨機選取預處理后的白鰱肉塊,稱重,并分別浸泡在天然濃度(參考2.3節(jié)所得酚類物質定量結果)和固定濃度的酚類單體物質溶液中,料液比為1∶3(g∶mL),浸泡時間30 min,進行揮發(fā)性成分測定和感官評價。

1.4 分析測定方法[8]

1.4.1 總酚、總糖、總蛋白含量的測定

以沒食子酸為對照品,采用福林酚法測定迷迭香水提物樣品中總酚含量;采用苯酚硫酸法測定迷迭香水提物中總糖含量;參照市售BCA試劑盒使用方法測定總蛋白含量。

1.4.2 腥味值評定

1.4.2.1 感官評價人員的選擇

在西南大學食品科學學院招募志愿者,將TMA稀釋為不同質量濃度梯度(10～1 000 mg/L)的供試液,測試受評人員(身體健康,無嗅覺障礙)的腥味敏感度,最終篩選出10名嗅覺靈敏的感官分析人員(5男5女,年齡20～28歲)。對感官評價人員進行定期感官評定訓練,使他們熟悉嗅覺語言和嗅覺評價方法,感官評定在感官實驗室中進行。

1.4.2.2 感官評價方法

取脫腥前后魚肉各10 g于20 mL棕色試劑瓶中。在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min后,感官評價人員對白鰱肉的腥味進行5分制感官評定。以100 mg/L的TMA水溶液為標準參照,定義腥味強度為5分。氣味強度進行如下評級:1分,非常微弱;2分,弱;3分,正常;4分,強勁;5分,非常強勁。

1.4.3 脫腥前后白鰱肉中揮發(fā)性成分測定

取3 g脫腥前后的白鰱肉置于20 mL螺口頂空樣品瓶中,再向瓶內加入100 μg/mL的2-辛醇標準品1 μL作為內標物,最后加入7 mL的250 g/L NaCl溶液及磁轉子,密封。將已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶當中,在60 ℃下平衡15 min 后開始萃取,相同條件頂空吸附30 min,萃取完成后在GC-MS進樣口解吸5 min,進行氣質測定。

氣相色譜條件:采用DB-5MS毛細管(30 m×0.25 mm,0.25 μm)色譜柱。升溫程序:柱初溫度40 ℃,保持2 min,先以5 ℃/min升溫到150 ℃,1.5 ℃/min升溫到165 ℃,再以15 ℃/min升溫到210 ℃,最后以10 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min,進樣口溫度250 ℃;載氣(氦氣)流速為1.2 mL/min。

質譜條件:接口溫度280 ℃;電子能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;質量掃描范圍:30～500m/z。

樣品中各揮發(fā)性成分的含量Ci(μg/kg)按公式(1)計算:

(1)

式中:ρ為內標物的質量濃度,μg/mL;V為內標物體積,μL;Si為各揮發(fā)性組分的峰面積;S為內標物質的峰面積;m為樣品的質量,g。

1.4.4 香氣活力值(odour active values,OAV)的計算

OAV值計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ci為各揮發(fā)性化合物的濃度;OTi為各揮發(fā)性化合物在文獻中報道的氣味閾值。

1.4.5 RE中酚類物質的定性分析

RE中酚類物質的定性參照HUANG等[8]的方法,并略做修改。色譜條件:色譜柱為Eclipse Plus column C18 (3.5 μm, 4.6 mm×100 mm);流動相A為0.1%(體積分數(shù))甲酸水,流動相B為0.1%(體積分數(shù))甲酸乙腈溶液,RE梯度洗脫:0～10 min,12%～25% B;10～18 min,25%～90% B;18～19 min,90%～100% B;19～24 min,100% B,流速為0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量1 μL;進樣進樣前以初始流動相比例平衡5 min。

質譜條件:采用電噴霧離子源,質譜掃描模式采用負離子掃描模式,毛細管電壓為3 000 V,脫溶劑氣體(氮氣),干燥溫度為220 ℃,脫溶劑氣體流量為8 L/min,干燥器溫度為220 ℃,掃描范圍為m/z50～1 300,碰撞氣體為氬氣。

1.4.6 RE中主要酚類物質的定量分析

RE中主要酚類物質的定量條件為:色譜柱為ZORBAX SB-Aq C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為甲醇,梯度洗脫:0～10 min, 5% B;10～30 min,5%～30% B;30～40 min,30%～50% B;40～50 min,50%～70% B;50～60 min,70%～5% B。流速為1 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量10 μL,使用外標法對酚類物質進行定量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

除特殊說明外,所有試驗數(shù)據(jù)均由3次重復試驗以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 19.0、Excel、Origin軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析和作圖,采用Duncan′s進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同處理后的RE中總酚、總糖和總蛋白的含量變化

由圖1可知,經(jīng)過PVPP處理后,RE的總酚含量均顯著下降(P<0.05)。這是因為PVPP作為一種多酚吸附劑,通過吸附和疏水相互作用從而吸附多酚。此外,PVPP添加量不同,吸附的多酚含量也有所不同,多酚含量隨著PVPP添加量增加而下降。C5和C6相比C1組總酚含量較略有下降但無顯著性差異,這可能是因為在脫蛋白和脫多糖的過程中破壞了部分多酚。上述結果說明,除去多酚和蛋白質對迷迭香水提物的總糖含量沒有影響。C1組的總蛋白含量為112.67 mg/g,C5組的總蛋白含量C1組降低92.33%。這是因為蛋白質在三氯乙酸的作用下形成了不可逆沉淀,從而達到脫除蛋白的效果。

圖1 不同處理后的RE中總酚、總糖和總蛋白的含量變化Fig.1 Changes in the contents of total phenols, total sugars and total proteins in RE under different treatments注:不同小寫字母表示表示差異性顯著(P<0.05)(下同)

2.2 不同處理后的RE對白鰱肉脫腥效果的比較

2.2.1 不同處理后的RE對白鰱肉揮發(fā)性物質的影響

如表1所示,26種揮發(fā)性成分在白鰱肉中被檢出,包含8種醛類、6種醇類、5種烴類、2種酮類、4種酯類和1種肟類,大多數(shù)化合物在白鰱或者其他魚類(鱈魚、帶魚和草魚等)已被報道過[9]。α-蒎烯、芳樟醇和長葉薄荷酮等來源于RE本身的揮發(fā)性成分在處理組中被檢出。

表1 不同處理后的RE對白鰱肉揮發(fā)性物質的影響Table 1 Effects of RE under various treatments on volatile compounds in silver carp

醛類化合物是脂質氧化降解的二級產(chǎn)物,閾值較低,是導致魚腥味的主要原因。己醛主要由亞油酸和亞麻酸氧化分解產(chǎn)生,對魚腥味的貢獻是所有醛類之中最大,同時在白鰱肉被檢測到的所有醛類物質之中含量也是最高的,達到了65.64 μg/kg。揮發(fā)性醇類化合物主要由脂肪氧化分解和羰基化合物還原產(chǎn)生,也會導致魚腥味。在本研究中,醇類物質中1-辛烯-3-醇含量高達81.75 μg/kg。有研究報道,1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化分解產(chǎn)生,具有蘑菇味和魚腥味,因其閾值低,也是造成魚制品具有不愉快氣味的原因[10]。烴類、酮類和酯類物質因其閾值高,所以對魚腥味貢獻較小。

與對照組相比,所有RE處理組的揮發(fā)性化合物的含量均有所下降。RE處理組中,C1、C5和C6組之間揮發(fā)性化合物的含量變化較小,C1、C2、C3和C4組揮發(fā)性化合物的含量存在較大差異。C1、C2、C3、C4、C5和C6組的己醛含量較CK組分別下降45.70%、39.41%、29.62%、23.23%、40.93%和39.74%;壬醛含量下降了42.42%、30.87%、23.22%、18.52%、36.27%和37.44%;1-辛烯-3-醇含量下降了40.97%、36.07%、24.91%、13.59%、36.84%和34.26%。這說明不同處理后RE對白鰱肉中腥味物質脫除效果存在差異,脫除多酚組中RE脫腥能力下降,而脫除蛋白和多糖則不影響RE脫腥能力,表明多酚是RE中起到脫腥作用的主要成分。CHEN等[11]也發(fā)現(xiàn)波紋巴非蛤酶解液經(jīng)過茶多酚處理后,波紋巴非蛤酶解液中的醛類物質含量顯著下降。RE處理組之間對白鰱肉腥味物質的脫除效果不同可能是因為其多酚含量的差異。

2.2.2 不同處理后的RE對白鰱肉感官評分的影響

由圖2可知,RE處理組的腥味值均顯著小于對照組(P<0.05),表明白鰱肉的感官品質得到了顯著改善。這一結果與MARTNEZ-ZAMORAL等[4]研究結果一致,即RE能顯著改善食品的感官品質。此外,不同多酚含量的RE處理組的腥味值存在顯著性差異(P<0.05)。RE處理時,C1、C2、C3、C4、C5和C6組的腥味值為對照組的57.37%、66.21%、78.74%、83.68%、55.79%和57.68%。CHOI等[12]的研究也表明,多酚含量會影響植物水提物的除臭能力,多酚含量越高,除臭效果越好。感官評價實驗結果與揮發(fā)性物質變化實驗結果相印證,均表明多酚是RE中起到脫腥作用的主要成分。

圖2 不同處理后的RE對白鰱肉腥味值的影響Fig.2 Effect of RE under different treatments on fishy odor value in silver carp

2.2.3 不同多酚含量的RE對白鰱肉中腥味活性物質OAV值的影響

如前所述,實驗證明多酚是RE中起到脫腥作用的主要成分,而RE中的蛋白質和多糖對其脫腥效果無顯著影響。因此進一步分析多酚含量的差異對白鰱肉中腥味活性物質OAV值的影響。揮發(fā)性化合物對食品風味風味的貢獻由OAV值確定,將化合物的濃度除以其氣味閾值來獲得OAV值,當OAV大于或等于1時,該化合物的定義為活性揮發(fā)性化合物,對食品的總體風味起到主要貢獻。己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E-2-辛醛、1-辛烯-3-醇和癸醛等OAV值均大于1,認為是白鰱肉的腥味活性物質。由圖3可知,與對照組相比,RE處理組的腥味物質OAV值均有所下降,不同多酚含量的RE對腥味物質OAV值的下降程度存在顯著性差異(P<0.05)。該實驗結果與POURASHOURI等[13]研究一致,即魚油腥味的脫除程度取決于迷迭香提取物中的多酚含量。

圖3 不同處理后的RE對腥味活性物質OAV值的影響Fig.3 Effect of RE under different treatments on OAV of fishy-odor active compounds

2.3 RE中酚類物質的定性與定量分析

基于2.2節(jié)的實驗結果,得到RE中起到主要脫腥作用的成分為多酚。因此,對RE中的酚類物質進行定性與定量。結合表2,從RE中檢測出4種酚類物質,其中代水溶性酚酸迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)被檢測出。MUNEKATA等[14]認為RA是迷迭香提取物中的主要活性物質并具有增強其他化合物的的效果(增強化療藥物的活性)。本研究中RE中RA含量為30.12 mg/g。有文獻報道,RA是迷迭香提取物中主要活性物質,可顯著改善魚制品風味,降低其異味物質含量[8]。HUANG等[15]的研究表明RA可以與腥味物質競爭性的結合肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)中的疏水位點,并且增強蛋白質與蛋白質之間的相互作用,從而促性腥味物質的釋放。因此,選擇RA作為RE中的主要活性物質繼續(xù)探究其對白鰱肉脫腥效果的影響。

表2 RE中的酚類物質組成Table 2 Phenolic compounds composition of RE

2.4 酚類單體化合物對白鰱肉脫腥效果的影響

基于2.3節(jié)的實驗結果,得到RE中RA的含量,將其定義為天然質量濃度。天然質量濃度的RA對腥味活性物質脫除效果如圖4所示,白鰱肉腥味活性物質含量和腥味值均顯著下降(P<0.05)。

a-下降率;b-腥味值圖4 天然質量濃度的迷迭香酸對白鰱肉脫腥效果的影響Fig.4 Effects of natural concentrations of RA on the deodorizing effect of silver carp

不同質量濃度的RA對腥味活性物質脫除效果如圖5所示。由圖5可知,RA能有效降低白鰱肉中的腥味活性物質。在質量低濃度下(10 μg/mL),RA對大多數(shù)腥味活性物質的脫除效果無顯著性差異(P>0.05),隨著質量濃度的上升,RA對腥味活性物質的脫除能力逐漸增大。SHI等[17]使用迷迭香提取物涂抹凍藏泥蝦能賦予其良好的感官品質,迷迭香提取物的主要活性物質為迷迭香酸。此外,白鰱肉腥味活性物質含量和腥味值下降可能是因為蛋白質與腥味物質之間的相互作用被酚類化合物所影響。白鰱魚的腥味感知不僅取決于腥味物質的濃度和氣味閾值,還取決于腥味化合物與其他食物成分的相互作用,尤其是與蛋白質的相互作用,蛋白質能結合和釋放腥味物質從而影響白鰱肉的腥味感知。GENOVESE等[18]研究表明,將橄欖油酚類化合物添加到乳清蛋白中時,觀察到揮發(fā)性化合物的含量顯著增加。綜合上述結果,說明RA能有效脫除白鰱肉的腥味,脫腥能力與酚類物質的結構和濃度相關。此外,RA和白鰱肉蛋白質之間的相互作用可能會影響白鰱肉的腥味感知,值得在后續(xù)研究進一步探究。

a-下降率;b-腥味值圖5 不同質量濃度的迷迭香酸對白鰱肉脫腥效果的影響Fig.5 Effects of different concentrations of RA on the deodorizing effect of silver carp

3 結論

(1)揮發(fā)性成分含量變化和感官評價結果表明,迷迭香中主要脫腥組分為多酚且脫腥效果與多酚含量呈正相關。(2)己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E-2-辛醛、1-辛烯-3-醇和癸醛的OAV值大于1,是白鰱肉的腥味活性物質。(3)腥味活性物質含量變化和感官評價結果表明,RA為主要脫腥活性物質,在低濃度下,RA對大多數(shù)腥味活性物質的脫除效果無顯著性差異(P>0.05),但隨著質量濃度的上升,RA對腥味活性物質的脫除能力逐漸增強。本文說明了RE中具有脫腥效果的組分為多酚類物質,其脫腥活性物質為RA,對進一步明確RE的脫腥機理提供理論基礎。