陳小琴,母應春*,蘇偉,2

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550000) 2(貴州大學,貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品儲藏加工技術重點實驗室,貴州 貴陽,550000)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科草本植物,是我國藥食兩用的名貴中藥材,位列“九大仙草”之首,主治益胃生津、滋陰清熱。研究表明,鐵皮石斛含有多糖、黃酮、生物堿、香豆素、酚類和氨基酸等[1]功能成分,具有調(diào)節(jié)腸道菌群、消炎抑菌、增強免疫力和降低血糖血脂等[2-3]功效。鐵皮石斛的食用方式主要有鮮食、入藥、泡茶、燉煮等。2020年國家衛(wèi)健委新增鐵皮石斛為藥食同源物質(zhì),在食品領域掀起研發(fā)熱潮,如以鐵皮石斛為原輔料制成酒、醋、酵素等。中草藥入曲利于酵母菌和霉菌等功能菌繁殖,抑制雜菌生長,從而提高小曲品質(zhì)[4]。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)石斛小曲的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、根霉菌屬、曲霉菌屬和威克漢姆酵母屬[5],能起到較好地糖化發(fā)酵作用。糯米飲料是以糯米為主要原料,按需添加果蔬汁等輔料,發(fā)酵而成的液體飲料。糯米發(fā)酵時不僅能產(chǎn)生有機酸、氨基酸,還能形成特殊香氣,對改善飲料品質(zhì)有正向作用[6]。目前,國內(nèi)外對鐵皮石斛的研究集中在藥理方面,利用鐵皮石斛制曲,在糯米發(fā)酵時作為發(fā)酵劑進行研究的報道較少。

因此,本文以糯米飲料不同發(fā)酵階段的醪醅為研究對象,通過化學方法、HPLC和頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry, HS-SPME-GC-MC)動態(tài)監(jiān)測發(fā)酵期間的理化特性、有機酸和揮發(fā)性物質(zhì)。旨在初步明晰糯米飲料發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化趨勢,同時也為鐵皮石斛深加工的拓展研究提供新方向及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

石斛小曲:30%(質(zhì)量分數(shù))鐵皮石斛莖粉與大米粉混勻,經(jīng)潤料、滅菌、冷卻后,接入0.7%根霉菌Q303,于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,低溫干燥后即得石斛小曲。

糯米飲料:糯米上汽蒸煮20 min后,立即用涼白開降溫至28～30 ℃,隨后拌入0.8%石斛小曲,混勻后于31 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵49 h。在發(fā)酵0、12、24、36、48 h對醪醅上層、中層和下層物料進行取樣并混勻,隨即用無菌密封袋包裝,保存于-80 ℃超低溫冰箱中直至分析。

1.1.2 實驗試劑

草酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、酒石酸、磷酸二氫鉀,均為分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;蘋果酸、珀酸均為色譜純,麥克林生化科技有限公司;甲醇、異丙醇均為色譜純,河北百靈威超精細材料有限公司;環(huán)己酮為色譜純(>99.5%,GC),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

PHS-3C pH計,上?？朴觾x器儀表有限公司;手持式糖度計,Anton Paar上海商貿(mào)有限公司;GC-MS TSQ8000與TRACE1300氣質(zhì)聯(lián)用,美國賽默飛世爾科技公司;50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭、DB-WAX(30 m×0.25 μm)色譜柱、高效液相色譜儀、ZORBAX SB-Aq(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化指標的測定

總酸(酸堿滴定法),參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》;淀粉含量和還原糖含量(葡萄糖標準溶液反滴定法),參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》;氨基酸態(tài)氮(甲醛滴定法),參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》;pH值(pH計)和糖度(糖度計)直接測定。每組試驗重復3次。

1.2.2 有機酸的測定

樣品前處理:準確稱取1.00 g醪醅定容至10 mL,并超聲10 min,離心后(10 000 r/min,10 min)取1 mL上清液過0.45 μm濾膜,用于HPLC分析。每組樣品測3組平行。

HPLC分析條件:參考鄭莎莎[7]的方法稍作修改。流動相為V[0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=2.0)]∶V(甲醇)=96∶4,進樣量為10 μL,流速為0.8 mL/min,柱溫為30 ℃,色譜柱為ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測器為DAD檢測器,檢測波長為210 nm。

有機酸標準溶液配制:分別稱取草酸、蘋果酸和檸檬酸各0.05 g,酒石酸、琥珀酸各0.10 g,乳酸0.42 g,乙酸1.05 g,溶于純凈水并定容至100 mL,作為母液待用。分別取上述母液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL定容至50 mL,過0.22 μm濾膜,上機分析,每個濃度作3次平行,采用峰面積外標法進行定量分析。如表1所示,7種有機酸線性回歸方程的相關系數(shù)(R2)均大于0.999,表明所測7種有機酸在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

表1 七種有機酸的標準曲線Table 1 Standard curve of seven organic acids

1.2.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

樣品前處理:準確稱取2.50 g醪醅裝入20 mL頂空瓶,加入5 mL飽和食鹽水充分混勻,以10 μL環(huán)己酮(10 μg/kg)作為內(nèi)標物質(zhì)。制備完成后于60 ℃孵化20 min,后將老化的50/30 μmol/L DVB/Carboxen/PDMS萃取頭插入頂空瓶中振蕩提取40 min。提取完成后,立即將SPME纖維插入進樣端口,于240 ℃解析5 min。

GC-MS條件:進樣口溫度240 ℃;升溫程序為40 ℃(5 min),5 ℃/min上升到150 ℃(3 min),最后以5 ℃/min上升到240 ℃(5 min)。以高純氦氣(99.999%)為載氣,載氣流速為1.00 mL/min,不分流進樣。

質(zhì)譜條件:EI離子源,離子源溫度250 ℃,電離電壓70 eV,傳輸線溫度240 ℃,掃描范圍35～550 amu。

定性定量分析:具體方法參考母雨[8],稍作修改。與質(zhì)譜NIST光譜數(shù)據(jù)庫比對并鑒定,僅保留匹配度>800的化合物;通過內(nèi)標法計算各揮發(fā)性組分的質(zhì)量濃度。計算如公式(1)所示:

(1)

式中:Ci為待測揮發(fā)性組分含量,μg/kg;Cis為內(nèi)標含量,μg/kg;Ai為待測揮發(fā)性組分色譜峰面積;Ais為內(nèi)標色譜峰面積。

1.2.4 氣味活度值

通過計算氣味活度值(odor activity value, OAV),分析各風味物質(zhì)對糯米飲料風味的貢獻程度。計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ci為某種風味物質(zhì)的含量,μg/kg;OTi為該風味物質(zhì)的嗅覺閾值,μg/kg。

1.2.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS Statistics 26分析數(shù)據(jù),并用平均值±標準差(mean±SD)表示。采用SIMCA 14.1、Origin 2018和Tbtool對數(shù)據(jù)進行可視化。

2 結果與分析

2.1 糯米飲料發(fā)酵過程理化指標的變化

隨糯米飲料發(fā)酵進行,小曲中微生物代謝引起理化指標發(fā)生變化。如圖1所示,醪醅pH值和總酸呈此消彼長趨勢,總酸含量增多,導致pH降低,二者在發(fā)酵期間變化顯著(P<0.05),均在48 h出現(xiàn)峰值,總酸含量和pH值分別為2.23 g/L和4.38,這與陸雨潔等[9]利用單一根霉發(fā)酵糯米的研究結果相似。淀粉含量從25.27 g/100 g顯著降低到17.53 g/100 g;還原糖和糖度含量變化則與之相反,隨發(fā)酵進行顯著增加(P<0.05),均在48 h時最大,分別為26.9 g/100 g和29.37 °Brix。這是因為霉菌代謝時會產(chǎn)生豐富糖化酶和淀粉酶,能有效分解淀粉產(chǎn)糖,同時產(chǎn)酸菌代謝導致醪醅酸度增加。氨基酸態(tài)氮含量從9.97 mg/100 g顯著增加到22.99 mg/100 g,主要來自糯米中蛋白質(zhì)的降解和部分酵母自溶[10]。

a-pH值;b-總酸含量;c-氨基酸態(tài)氮含量;d-淀粉含量;e-還原糖含量;f-糖度值圖1 糯米飲料發(fā)酵過程中理化指標變化Fig.1 Changes of physical and chemical indexes in glutinous rice beverage during fermentation

2.2 糯米飲料發(fā)酵過程中有機酸分析

有機酸不僅能調(diào)節(jié)食品酸度,還能抑制雜菌,具有呈香調(diào)味作用[11]。如圖2-a所示,有機酸總含量由36.16 mg/L顯著上升至422.4 mg/L,在48 h時最高。乳酸、琥珀酸和檸檬酸是主要有機酸(圖2-b),三者含量均顯著增加(P<0.05),這與車逸心等[12]利用紫紅曲霉與釀酒酵母發(fā)酵糯米時產(chǎn)酸結論一致。發(fā)酵結束后,新增了草酸和乙酸(圖2-c)。

a-有機酸的總含量變化;b-7種有機酸含量相對百分比;c-7種有機酸含量變化圖2 糯米飲料發(fā)酵過程中有機酸含量變化Fig.2 Changes of organic acids contents in glutinous rice beverage during fermentation

乳酸含量最高(11.1～229.71 mg/L),酸味柔和,略帶乳香和澀感[13]。其次為檸檬酸(6.55～93.41 mg/L),具有清爽的酸味,有消除疲勞、炎癥和預防糖尿病等作用[14]。然后是琥珀酸(10.28～74.68 mg/L),具有特殊鮮酸味、辣味,在發(fā)酵36 h后趨于平緩,可能是作為反應底物參與到其他代謝途徑[15]。蘋果酸帶有生青味、酸澀味,可通過蘋果酸-乳酸途徑轉化成酒精和乳酸,致其含量在發(fā)酵36 h后略有下降,這與張婷等[16]研究結論相似。酒石酸口感粗糙、生硬,含量在發(fā)酵24 h達到最高[(37.05±5.1) mg/L],隨后快速下降,這可能與其生成酒石酸氫鉀或被降解成乳酸有關[17]。草酸和乙酸含量較低,均在發(fā)酵24 h時才被檢測到。草酸具有澀味,多以不溶性草酸鈣形式存在于植物中[18];乙酸酸味刺激濃烈,具有醋味。

2.3 發(fā)酵糯米飲料發(fā)酵過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的動態(tài)變化

2.3.1 揮發(fā)性風味物質(zhì)組成

由附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033657)可知,利用石斛小曲作為發(fā)酵劑,在糯米飲料發(fā)酵過程中共鑒定出58種揮發(fā)性風味物質(zhì),包括18種酯類、12種醇類、10種醛類、4種烷烴、3種酸類、3種酚類、2種烯烴、2種內(nèi)酯、1種酮類和3種其他類。0、12、24、36、48 h醪醅分別鑒定出34、41、53、53、50種揮發(fā)性風味物質(zhì),各階段總含量顯著增加(P<0.05),依次為16.37、48.25、117.68、221.17、281.27 μg/kg。隨發(fā)酵進行,醇類和酯類成為糯米飲料的主體香氣物質(zhì),這與蘇佳佳等[19]用甜酒曲發(fā)酵糙米時揮發(fā)性風味研究結果一致。

醇類在發(fā)酵期間含量最高,從2.74 μg/kg顯著上升至194.21 μg/kg。醇類能賦予食品醇甜和果香,少量高級醇能使香氣更飽滿[20];主要由氨基酸的Ehrlich代謝[21]、釀酒酵母發(fā)酵、葡萄糖代謝及亞油酸降解等產(chǎn)生。醇類總占比67.78%,各階段醇類含量依次為2.74、25.61、85.63、155.93、194.21 μg/kg。乙醇、異戊醇和苯乙醇顯著增加(P<0.05),是主要的醇類物質(zhì),均在發(fā)酵48 h含量最高,分別為90.22、62.67、33.62 μg/kg。乙醇、異戊醇屬于高級醇,能賦予糯米飲料較高香氣值,同時也促進其他香氣成分溶解[22];如乙醇能提供蘋果甜香、異戊醇散發(fā)白蘭地香和草香。苯乙醇呈類似玫瑰花香和茉莉花香,使糯米飲料更醇香,給人柔和愉悅的感覺[23]。

酯類在發(fā)酵期間種類最多(8～18種),大部分酯類呈花果香,主要由游離的酸類和醇類發(fā)生酯化反應、酵母菌代謝及酯化酶作用產(chǎn)生[24]。酯類含量總占比23.4%,變化趨勢同醇類,伴隨酵母菌活力降低,其增速在發(fā)酵36 h后趨于平緩,5個發(fā)酵階段酯類含量依次為6.05、13.01、20.77、50.68、69.72 μg/kg。糯米飲料中乙醇含量較高,因此酯類以脂肪酸乙酯為主,如正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯等。發(fā)酵后棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯成為主要酯類物質(zhì)。棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯屬于高級脂肪酸乙酯,棕櫚酸乙酯呈微弱果香和奶油香氣,能降低澀味,增加醇厚感[25];十四酸乙酯具有果香和鳶尾油香氣[26];油酸乙酯散發(fā)香蕉香氣。

此外,還含有少量醛類,能促進香氣釋放,協(xié)調(diào)各香氣組分[27]。醛類總占比5.81%,各階段含量依次為5.63、7.09、7.48、8.62、10.97 μg/kg。苯甲醛和壬醛是發(fā)酵階段主要的兩種醛類物質(zhì),但二者變化情況存在差異。苯甲醛呈特殊杏仁味和櫻桃香味,在36 h時才被檢測到,含量從2.03 μg/kg增加到4.96 μg/kg。壬醛能賦予愉悅的花果香、脂肪香,有報道稱其為米香味的關鍵呈香物質(zhì)[28],結合其存在于整個發(fā)酵過程,且無明顯變化,推測其來自糯米原料。

烷烴類、酸類、酚類、烯烴類、內(nèi)酯類、酮類及其他類揮發(fā)性風味物質(zhì)含量雖低,但也是形成糯米飲料風味的重要成分。上述所有揮發(fā)性風味物質(zhì)在發(fā)酵過程逐步積累,互相協(xié)同、轉化,就形成了糯米飲料獨特的香氣風格。

2.3.2 差異揮發(fā)性風味物質(zhì)的確定

如圖3所示,通過正交偏最小二乘判別法(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)挖掘相鄰兩階段醪醅中揮發(fā)性風味的差異。0～12、12～24、24～36、36～48 h醪醅樣品在得分圖上均能明顯分離,各相鄰兩階段模型的R2Y值和Q2值均大于0.9,依次為0.999、0.999、0.926、0.996和0.979、0.965、0.977、0.961,表明該模型穩(wěn)定,擬合度和預測能力較高,能用來分析糯米飲料發(fā)酵過程的風味差異[29]。

a-0、12 h;b-12、24 h;c-24、36 h;d-36、48 h圖3 相鄰兩階段揮發(fā)性風味物質(zhì)OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score chart of volatile flavor substances in two adjacent stages

在發(fā)酵過程中共篩選出33種具有重要顯著差異的揮發(fā)性風味物質(zhì)(VIP>1.0,P<0.05),包括11種酯類、7種醇類、醛類6種、烷烴類2種、酸類2種、酚類2種、內(nèi)酯類1種、其他類2種。如圖4所示,5個階段醪醅共聚為兩大類,12 h和24 h首先發(fā)生聚類,再與0 h聚為一大類,36 h和48 h聚為另一大類;這表明0～24 h醪醅中揮發(fā)性風味具有較高相似度,并與36～48 h醪醅存在差異。醇類物質(zhì)和脂肪酸乙酯隨發(fā)酵進行在熱圖中逐漸呈紅色,如乙醇、苯乙醇、苯甲醇、異戊醇、油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乙酸苯乙酯等,表明這些物質(zhì)隨發(fā)酵進行成為了糯米飲料的主要風味物質(zhì)。

圖4 發(fā)酵過程中重要顯著差異揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of volatile flavor compounds with important and significant differences during fermentation

2.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的OAV分析

通過計算OAV,進一步確定糯米飲料各發(fā)酵階段的特征香氣物質(zhì)。當OAV≥1時,該風味物質(zhì)對風味特征有重要貢獻,OAV越大,貢獻程度越大[30]。由表2可知,各發(fā)酵階段共得到3種OAV≥1的特征香氣物質(zhì),分別為1-辛烯-3-醇(0.54～2.06)、苯乙醇(0～3.34)和壬醛(2.48～2.86)。1-辛烯-3-醇和壬醛香氣閾值較低,即使含量較低也對糯米飲料風味有重要貢獻。1-辛烯-3-醇是發(fā)酵12～48 h醪醅中的特征香氣物質(zhì),散發(fā)蘑菇香和蔬菜香,可能來源于糯米中亞油酸的氧化分解[31]。壬醛(花果香、脂肪香)在各發(fā)酵階段OAV均大于1,且隨發(fā)酵時間延長無明顯波動。苯乙醇(玫瑰花香和茉莉花香)OAV最大,是發(fā)酵36～48 h醪醅的特征香氣物質(zhì),這可能與石斛小曲中較高含量的Wickerhamomyces有關[32]。大多數(shù)酯類和醇類香氣閾值較大,即使含量高,對糯米飲料風味也無明顯貢獻。

表2 發(fā)酵過程中特征風味物質(zhì)(OAV ≥ 1)Table 2 Characteristic flavor compounds during fermentation (OAV ≥ 1)

3 結論

本研究分析了以石斛小曲為發(fā)酵劑,糯米飲料發(fā)酵過程中理化指標、有機酸及揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化情況。結果表明,醪醅pH和淀粉含量隨發(fā)酵時間延長呈顯著降低的趨勢(P<0.05);總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖和糖度則顯著增加(P<0.05)。發(fā)酵期間共有7種有機酸被檢測到,總含量顯著增加(36.16～422.4 mg/L),主要有機酸為乳酸、琥珀酸和檸檬酸,發(fā)酵結束后新增了草酸和乙酸。5個階段共檢測出58種揮發(fā)性風味物質(zhì),以醇類和酯類為主,揮發(fā)性風味總含量隨發(fā)酵時間延長顯著增加(P<0.05);其中,棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯、乙醇、異戊醇和苯乙醇的含量較高;同時基于OPLS-DA確定了33種在發(fā)酵中具有重要顯著差異的風味物質(zhì)(VIP>1.0,P<0.05)。通過計算OAV共獲得3種OAV>1的特征香氣物質(zhì),即1-辛烯-3-醇、苯乙醇和壬醛。這為糯米飲料的風味研究提供參考價值,也為石斛深加工及其拓展應用提供新的研究方向。