李梅花，劉燦輝，丁 野，呂 欣

(1 邵陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 邵陽 422000；2 湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長沙 410000)

蜂蜜入藥最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。可見，蜂蜜自古就被用作藥材廣泛使用，一直也被我國藥典收載；同時(shí)也是一種重要的中藥輔料，廣泛用于中藥材炮制及蜜丸制備，歷史悠久。蜂蜜用作中藥輔料需經(jīng)過煉制，蜂蜜煉制的目的是為增加蜂蜜的粘度，以滿足不同藥材粉末的制劑需要。煉蜜目前有嫩蜜、中蜜、老蜜三個(gè)等級(jí)，其區(qū)分主要以煉蜜人按經(jīng)驗(yàn)定。

現(xiàn)行中國藥典(2020年版)及各省標(biāo)準(zhǔn)都沒有明確的數(shù)據(jù)規(guī)定具體的煉蜜標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)收集了不同廠家經(jīng)驗(yàn)豐富的老工人煉制的嫩、中、老蜜，對(duì)其性狀、相對(duì)密度、水分、5-羥甲基糠醛進(jìn)行檢驗(yàn)；以性狀、相對(duì)密度、水分作為煉蜜粘度的具體指標(biāo)，區(qū)分各種煉蜜；以5-羥甲基糠醛作為煉蜜的安全性指標(biāo)，區(qū)分煉蜜的好壞；以期讓嫩、中、老蜜的標(biāo)準(zhǔn)具體化，為蜂蜜的煉制提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 主要儀器

LC-20A高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)，日本島津公司；IR140溫控自動(dòng)折光儀，上海儀邁儀器科技有限公司；AUW 220電子天平(0.1 mg)，日本島津公司；MS205DU/A電子天平(0.01 mg)，瑞士Mettler公司；超純水儀，德國Sartorius 集團(tuán)。

1.2 主要藥品與試劑

鳥苷(111977-201501，純度：93.6%)、5-羥甲基糠醛(11626-201509，純度：97.8%)，中國食品藥品檢定研究院；19035087乙腈(色譜純)，TEDIA公司；水為超純水；其余所用試劑(甲酸、甲醇等)均為分析純。

所有煉蜜樣品分別由5個(gè)廠家的老藥工煉制，嫩、中、老蜜各12批，分別編號(hào)nm01～nm12、zm01～zm12、lm01～lm12。

2 方法與結(jié)果

2.1 性 狀

綜合共36批煉蜜的性狀特點(diǎn)，對(duì)嫩、中、老蜜的性狀進(jìn)行描述，區(qū)別點(diǎn)見表2。

2.2 相對(duì)密度

將大部分嫩蜜和中蜜分別按《中國藥典》2020版一部蜂蜜項(xiàng)下相對(duì)密度的測(cè)定法[1]和《中國藥典》2020年版四部通則0183煎膏劑(膏滋)項(xiàng)下相對(duì)密度的測(cè)定法[2]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 煉蜜的相對(duì)密度(25 ℃)

由表1可知附溫比重瓶法測(cè)定的相對(duì)密度均比韋氏比重秤法高，差值為0.02～0.04，分析其原因可能是蜂蜜通過煉制后粘度增加，流動(dòng)性變差，倒進(jìn)量筒內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，且難以消除，導(dǎo)致比重秤法所得結(jié)果偏低。另因比重秤法在煉蜜密度測(cè)定中，浮錘下沉耗時(shí)長，難以達(dá)到平衡，測(cè)定難度大，且老蜜粘度太大，基本無法用比重秤測(cè)定，故比重稱法不適用于煉蜜的相對(duì)密度測(cè)定。用煎膏劑項(xiàng)下相對(duì)密度的附溫比重瓶法，解決了煉蜜粘度大，流動(dòng)性差的問題，簡(jiǎn)單易操作，重復(fù)性好，樣品用量小，測(cè)定效率高，可用于煉蜜的相對(duì)密度測(cè)定，也是本研究的一次新探索。

由上表可知，在比重瓶測(cè)定方法下，12批嫩蜜相對(duì)密度主要集中在1.430～1.460之間；9批中密相對(duì)密度主要集中在1.468～1.491之間；11批老蜜相對(duì)密度主要集中在1.492～1.534之間；忽略一些性狀不符樣品的結(jié)果數(shù)據(jù)，擬定各煉蜜相對(duì)密度指標(biāo)見表2。

表2 3種煉蜜的數(shù)據(jù)指標(biāo)

2.3 水 分

參照《中國藥典》2020年版一部蜂蜜[檢查]項(xiàng)下水分測(cè)定法，對(duì)共36批煉蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)用儀器：儀邁IR140溫控自動(dòng)折光儀。

結(jié)果如下：12批嫩蜜的水分主要集中在17.1～20.4之間；12批中蜜水分主要集中在13.6～15.9之間；11批老蜜水分主要集中在9.2～12.9之間。擬定各煉蜜水分指標(biāo)見表2。

2.4 5-羥甲基糠醛

蜂蜜中的5-羥甲基糠醛(5-HMF)是己糖經(jīng)加熱分解產(chǎn)生的降解物[3]，在新鮮蜂蜜中含量極其微少[4-5]，會(huì)隨著加工或老化過程不斷增加，有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)人體有一定的毒害作用，可引起動(dòng)物橫紋肌麻痹及內(nèi)臟損害[6-7]。5-羥甲基糠醛作為一個(gè)安全性指標(biāo)及是否過度加熱的指示性指標(biāo)，檢測(cè)煉蜜中5-羥甲基糠醛的含量很有必要。但5-HMF性質(zhì)不穩(wěn)定，常溫下極易潮解，高于30 ℃極難準(zhǔn)確稱量[7]，故選擇結(jié)構(gòu)相近，性質(zhì)穩(wěn)定的鳥苷為參照物，用校正因子法計(jì)算煉蜜中的5-HMF含量。

2.4.1 對(duì)照品溶液

精密稱取鳥苷對(duì)照品：(1)10.56 mg；(2)9.81 mg；(3)10.26 mg，分別置50 mL量瓶中，加10%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(1)、(2)、(3)。精密稱取5-HMF對(duì)照品8.89 mg，置50 mL量瓶中，加10%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得5-HMF對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取5-HMF對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL置100 mL量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得5-HMF對(duì)照品溶液，作為定位用。

2.4.2 供試品溶液

取本品約1 g，置燒杯中，精密稱定，加10%甲醇適量溶解，并分次轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，精密加入鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(2)或(3)1 mL，加10%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液(5∶95)；流速1.0 mL·min-1；5-HMF檢測(cè)波長為284 nm；鳥苷檢測(cè)波長為254 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

取鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液、5-HMF對(duì)照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，樣品中其他成分對(duì)鳥苷和5-羥甲基糠醛的測(cè)定無干擾。

圖1 煉蜜HPLC圖

2.4.4 線性關(guān)系考察

精密吸取鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(1)0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0 mL，分別置100 mL量瓶中，再分別精密加入5-羥甲基糠醛對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以鳥苷與5-HMF的質(zhì)量濃度比值X為橫坐標(biāo)，以兩者的峰面積比值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y= 0.3457x-0.0047，R2=0.9999。結(jié)果表明：鳥苷/5-HMF不同濃度比值(0.28～4.55)與峰面積比值的線性關(guān)系良好(R2=0.9999)，校正因子(Y/X)均值為0.340。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

取同一中蜜供試品溶液(zm05)，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD(n=6)為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一中蜜供試品(zm05)，依法制備6份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算，RSD為0.4%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.7 回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的同一中蜜供試品(zm05)(含5-HMF 50.70 μg/g)約0.5 g(6份)，精密稱定，置燒杯中，精密加入5-HMF對(duì)照品溶液6 mL，依法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果平均加樣回收率為96.8%，RSD為3.24%，表明回收良好。

2.4.8 各煉蜜5-HMF含量測(cè)定結(jié)果及限度擬定

對(duì)共36批煉蜜樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果如下：12批嫩蜜的5-HMF含量主要集中在0.0021%～0.0044%之間；11批中密主要集中在0.0046%～0.0800%之間，其中一批為0.0140%；9批老蜜主要集中在0.0050%～0.0179%之間，lm10～lm12樣中5-HMF含量特別高(0.0388%、0.0674%、0.1331%)，可能跟加熱時(shí)的溫度有關(guān)，此3批老蜜均可見不同程度的黑色糊狀物。本實(shí)驗(yàn)擬定的限度以藥典蜂蜜(限度0.004%)為參照，計(jì)劃嫩、中、老蜜每等級(jí)增0.004%，老蜜相對(duì)密度及水分沒設(shè)上限，所以老蜜適度放寬，根據(jù)實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，忽略其中的明顯偏離值，擬定各煉蜜5-HMF含量見表2。

3 結(jié) 論

所有煉蜜樣品均是憑經(jīng)驗(yàn)煉制，難免會(huì)出現(xiàn)部分樣品不能達(dá)到既定要求的現(xiàn)象，比如lm04樣品兩手指捻之分開時(shí)無長白絲出現(xiàn)，未達(dá)到老蜜要求，故其各數(shù)據(jù)未納入老蜜指標(biāo)考慮。

本研究擬定的水分限度，嫩蜜與中蜜限度與中藥藥劑學(xué)的描述比較接近；老蜜限度稍有出入。在我們收集到的樣品中含水量10%以下的流動(dòng)性極差，幾成固體，且含水量在12.9%的樣品性狀上也能滿足要求，兩手指捻之分開時(shí)有較長白絲出現(xiàn)；另中藥藥劑學(xué)[8]中關(guān)于中蜜和老蜜的水分?jǐn)鄬?14%與10%的斷層)也找不到相關(guān)說明，故在限度擬定中根據(jù)實(shí)際情況補(bǔ)足斷層。另外，我們也考查了烘干法做水分，很難達(dá)到恒重，折光法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，樣品用量小，適用于煉蜜的水分測(cè)定。

綜上所述，總結(jié)3種煉蜜的各數(shù)據(jù)指標(biāo)于表2，今后將繼續(xù)擴(kuò)大樣本，收集數(shù)據(jù)，制定更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。