王 璐,單佳佳

(1.江蘇省丹陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 丹陽 212300;2.江蘇省南通市海門區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 南通 226000)

卵巢癌是女性中第七大最常見的癌癥類型,其預(yù)后很差,5年生存率為45%,并在全球范圍內(nèi)帶來了巨大的疾病負(fù)擔(dān)[1-2]。隨著這種疾病的診斷和治療的改進(jìn)和發(fā)展,患者的總體生存率得到了一定的控制。但是,70%的患者被診斷為卵巢癌晚期,也只有25%的生存率[3-4]。因此為了更好地抑制這種惡性腫瘤,需要在分子水平上研究其發(fā)病機(jī)制。研究表明,miRNAs控制涉及腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的人類癌癥進(jìn)展中的關(guān)鍵分子事件[5-7]。本研究通過下載分析高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)集中的卵巢癌與癌旁組中的miRNA表達(dá)譜,篩選差異miRNA,通過TCGA數(shù)據(jù)集篩選預(yù)后miRNA和預(yù)后差異基因,檢測預(yù)后相關(guān)miRNA:miR-187-3p和miR-381-5p異質(zhì)性表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響,使用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-187-3p和miR-381-5p潛在預(yù)后靶基因,探明miRNA調(diào)節(jié)卵巢癌遷移侵襲機(jī)制,為卵巢癌的治療提供新的見解和思路。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas Program,TCGA)數(shù)據(jù)集(https://portal.gdc.com)獲得卵巢癌患者376例腫瘤組織以及GTEX數(shù)據(jù)庫(Genotype-Tissue Expression,https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project)54例未患病患者180例癌旁組織的RNAseq數(shù)據(jù)和miRNA表達(dá)譜(level3)和臨床數(shù)據(jù)。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲取GSE119055數(shù)據(jù)集的6例卵巢癌患者腫瘤組織和3例癌旁組織的miRNA表達(dá)譜。

1.2差異表達(dá)分析 卵巢癌組織和癌旁組織差異表達(dá)miRNA采用R包limma包進(jìn)行分析,其中差異表達(dá)基因以P<0.05,|log2FC|>2為篩選條件,差異表達(dá)miRNA以P<0.05,|log2FC|>1為篩選條件,用火山圖和熱圖表示。

1.3預(yù)后分析 將從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得卵巢癌患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床信息,通過R軟件繪制Kaplan-Meier曲線,P值和具有95%CI的危險(xiǎn)比(HR)通過logrank檢驗(yàn)和單變量Cox回歸得出。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 IOSE-80和SK-OV-3細(xì)胞系從Cellcook Biotech Co.,Ltd.(中國廣州)購買。SK-OV-3細(xì)胞在McCoy的5A培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密蘇里州,美國)中培養(yǎng),添加NaHCO3至2.2 g/L,含10%胎牛血清(FBS,Gibco,Grand Island,NY,USA)。將IOSE-80細(xì)胞在RPMI 1640(Gibco)中培養(yǎng),具有20%FBS和10 mg/L胰島素(Cellcook)。兩種細(xì)胞系均在37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞接種在6孔板中并在培養(yǎng)基中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%匯合時(shí),取出培養(yǎng)基并用2 mL具有10%FBS的完全生長培養(yǎng)基刷新(ThermoFisher,美國)。按照說明書將miRNAmimic、inhibitor及其相應(yīng)對照物添加在150 μL opti-MEM(GIBCO)中,與在150 μL opti-MEM中稀釋的NedoFectin-Max(GeneCopoeia,美國)轉(zhuǎn)染試劑混合;將混合物在室溫下孵育20 min,然后加入到6孔板中。然后將細(xì)胞如上所述孵育并在指定時(shí)間收集以進(jìn)行后續(xù)檢測。細(xì)胞分組情況:IOSE-80、SK-OV-3、miRNANC(SK-OV-3轉(zhuǎn)染miR-187-3p mimic對照物)、miRNAmimic(SK-OV-3轉(zhuǎn)染miR-187-3pmimic)、miRNANC(SK-OV-3轉(zhuǎn)染miR-381-5p inhibitor對照物)、miRNAmimic(SK-OV-3轉(zhuǎn)染miR-381-5p inhibitor)。

1.5逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(ThermoFisher)分離RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(ThermoFisher)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。RT-qPCR使用GoTaq qPCR試劑盒(Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行檢驗(yàn)。U6被用作miRNA表達(dá)的內(nèi)部參考,特定引物見表1。

表1 引物序列

1.6細(xì)胞遷移檢測 傷口愈合試驗(yàn)用于檢測細(xì)胞遷移,將各組細(xì)胞接種到6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)106。細(xì)胞黏附后,向細(xì)胞中加入1 mg/L絲裂霉素C以抑制細(xì)胞增殖。使用200 μL尖端在細(xì)胞層上產(chǎn)生傷口。用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered solution,PBS)洗滌細(xì)胞以從板中除去松散的細(xì)胞,并將細(xì)胞培養(yǎng)基加入孔中。將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng),并在0和24 h后用于統(tǒng)計(jì)。

1.7細(xì)胞侵襲檢測 將細(xì)胞消化并調(diào)節(jié)至1×106細(xì)胞/mL在培養(yǎng)基中,不含血清。將Matrigel(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)加入上腔室并在37 ℃下孵育2 h。然后,分別將100 μL和600 μL培養(yǎng)基加入上腔室和底室,并在37 ℃下繼續(xù)孵育過夜。除去培養(yǎng)基,將100 μL細(xì)胞懸浮液加入上腔室,并將600 μL具有FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到底部室中。隨后,將細(xì)胞在37 ℃和5% CO2下孵育環(huán)境24 h。分離上腔室,取出細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定。用PBS洗滌細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色。用顯微鏡觀察染色的細(xì)胞(奧林巴斯,東京,日本)。

1.8miRNA靶基因預(yù)測 靶基因miRNA預(yù)測采用starbase網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)進(jìn)行預(yù)測。miRNA靶向結(jié)合關(guān)系使用ggalluvial包繪制?；鶊D。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)采用v4.1.3版R軟件(R Foundation for Statistical Computing,2022)執(zhí)行,細(xì)胞試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS24.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism8.0.1(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌差異miRNA篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE119055數(shù)據(jù)集作差異miRNA分析;其中差異miRNA為32個(gè),上調(diào)miRNA為20個(gè)(miR-183-3p、miR-381-5p、miR-660-3p、miR-202-3p、miR-377-3p、miR-513c-5p、miR-186-5p、miR-133a-3p、miR-329-3p、miR-4324、miR-99a-3p、miR-133b、miR-26b-3p、miR-145-3p、miR-508-3p、miR-101-5p、miR-1294、miR-204-5p、miR-362-3p、miR-502-5p、miR-383-5p),下調(diào)miRNA為12個(gè)(miR-200a-5p、miR-187-3p、miR-429、miR-200b-5p、miR-183-5p、miR-141-3p、miR-31-3p、miR-34c-3p、miR-200a-3p、miR-224-5p、miR-34c-5p),火山圖和熱圖見圖1,2。

圖1 差異miRNA火山圖

圖2 差異miRNA熱圖

2.2miR-187-3p和miR-381-5p與卵巢癌的預(yù)后相關(guān) 為了驗(yàn)證差異miRNA對卵巢癌的預(yù)后影響;通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選卵巢癌中的預(yù)后miRNA,共獲得82個(gè)預(yù)后相關(guān)miRNA,與差異miRNA取交集共獲得2個(gè)差異預(yù)后miRNA:miR-187-38、miR-381-5p(圖3)。然后,驗(yàn)證這2個(gè)miRNA的異質(zhì)性表達(dá)對卵巢癌預(yù)后的影響;結(jié)果表明,低表達(dá)的miR-187-38(圖4)和高表達(dá)的miR-381-5p(圖5)預(yù)示著卵巢癌的預(yù)后不良(P<0.05)。

圖3 差異miRNA和預(yù)后相關(guān)miRNA取交集

圖4 高低表達(dá)的miR-187-38的KM生存曲線

圖5 高低表達(dá)的miR-381-5p的KM生存曲線

2.3miR-187-3p和miR-381-5p對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 我們在卵巢上皮細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系中驗(yàn)證了miR-187-3p和miR-381-5p的表達(dá)情況,RT-qPCR結(jié)果表明,與卵巢上皮細(xì)胞相比,卵巢癌細(xì)胞中miR-187-3p顯著下調(diào)(表1),miR-381-5p顯著上調(diào)(表2)。隨后,在卵巢癌細(xì)胞中通過慢病毒轉(zhuǎn)染來過表達(dá)miR-187-3p或抑制miR-381-5p,并對細(xì)胞遷移和侵襲的影響,結(jié)果表明,過表達(dá)miR-187-3p或抑制miR-381-5p均會顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲(圖6,表3,4)。

圖6 miR-187-3p和miR-381-5p對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表1 miR-187-3p表達(dá)量

表2 miR-381-5p表達(dá)量

表3 miR-187-3p過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞遷移的影響

表4 抑制miR-381-5p對卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響

2.4miR-187-3p和miR-381-5p影響卵巢癌惡性發(fā)展的機(jī)制探討 為了進(jìn)一步明晰miRNA影響卵巢癌惡性發(fā)展作用機(jī)制,通過TCGA數(shù)據(jù)庫獲得了卵巢癌患者的腫瘤組織和癌旁組織的mRNA表達(dá)譜,并做差異分析,其中上調(diào)基因?yàn)? 073個(gè),下調(diào)基因?yàn)? 333個(gè)。隨后,通過starbase數(shù)據(jù)庫獲取miR-187-3p和miR-381-5p的靶基因,并與差異基因取交集(圖7A,B)。隨后對這些基因?qū)β殉舶┗颊叩念A(yù)后情況進(jìn)行分析,共獲得28個(gè)潛在的靶基因,其與miRNA的靶向結(jié)合關(guān)系見圖7C。

圖7 miR-187-3p和miR-381-5p靶基因篩選

3 討 論

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)中卵巢癌的miRNA表達(dá)譜,共獲得32個(gè)差異miRNA,其中上調(diào)miRNA有20個(gè),下調(diào)miRNA有12個(gè);在通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出來的與預(yù)后相關(guān)的miRNA為miR-187-3p和miR-381-5p。

miR-187-3p在不同癌癥的表達(dá)情況不同,其對癌癥的惡性發(fā)展作用也呈現(xiàn)不同的效果。在肝細(xì)胞癌中,miR-187-3p低表達(dá),低表達(dá)的miR-187-3p促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[8]。在乳腺癌中,miR-187-3p表達(dá)顯著降低,miR-187-3p過表達(dá)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活力并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[9]。與之相反的是,在甲狀腺癌中,高表達(dá)的miR-187-3p與較高的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌細(xì)胞中miR-187-3p表達(dá)量顯著降低,且低表達(dá)的miR-187-3p預(yù)示著卵巢癌患者的預(yù)后不良,細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲結(jié)果表明,過表達(dá)的miR-187-3p會顯著降低卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中,與癌旁組織相比,轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的miR-381-5p表達(dá)降低,且miR-381-5p抑制細(xì)胞增殖、EMT以及MDA-MB-231的入侵和遷移[11]。此外有研究表明,miR-381-5p是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的電磁場特異性靶標(biāo),將多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-87 MG細(xì)胞連續(xù)暴露于電磁場54 h,特異性靶向電磁場可以阻止U-87 MG細(xì)胞的增殖[12]。

miRNA在癌癥和疾病中經(jīng)常失調(diào),通過與關(guān)鍵蛋白的mRNA結(jié)合,miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白表達(dá),從而影響下游途徑。通常,它們會導(dǎo)致靶基因表達(dá)的RNA沉默[13-15]。而miRNA結(jié)合靶基因調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)研究已被廣發(fā)研究[16-19]。在這些研究中,miRNA靶向抑制靶基因的表達(dá),從而起到作用。在本研究中通過starbase預(yù)測miR-187-3p有19個(gè)靶基因,其靶基因在卵巢癌中高表達(dá)。miR-381-5p有9個(gè)靶基因,其靶基因在卵巢癌中低表達(dá)。但是,本研究只是初步探討了miR-187-3p和miR-381-5p的靶基因,并未深入進(jìn)行研究,也為對這些靶基因的在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用進(jìn)行探討。此外,本研究只涉及了體外研究,下一步的研究方向,將在體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,在卵巢癌中篩選出了2個(gè)預(yù)后相關(guān)miRNA:miR-187-3p和miR-381-5p,miR-187-3p呈現(xiàn)低表達(dá),miR-381-5p呈現(xiàn)高表達(dá),且過表達(dá)miR-187-3p或抑制miR-381-5p均會顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。