王津果,盛楊杰,4,王續(xù)昆,倪嘉璇,武 卉,劉衛(wèi)國,周 偉*,

(1.江蘇海洋大學(xué),江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇 連云港 222005; 2.自然資源部濱海鹽沼濕地生態(tài)與資源重點實驗室,江蘇 連云港 222005; 3.江蘇海洋大學(xué),江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005; 4.汕頭大學(xué) 理學(xué)院,廣東 汕頭515000; 5. 乳山市牡蠣協(xié)會,山東 威海 264500)

0 引言

大型海藻在近海海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,例如:為海洋生物提供了多樣化的棲息地和繁殖場所;通過光合作用固定CO2,降低大氣中CO2的累積[1];大量吸收海水中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì),降低海水富營養(yǎng)化程度和有害赤潮的發(fā)生幾率[2]。然而,有一些廣溫、廣鹽性的海藻,因其強大的營養(yǎng)鹽吸收能力和高耐受性,會在特定環(huán)境下暴發(fā)性生長、聚集,引發(fā)綠潮[3-4]。綠潮在我國已持續(xù)發(fā)生15年,為黃海海域常態(tài)化的自然災(zāi)害之一,對江蘇和山東沿海等地的生產(chǎn)、生活產(chǎn)生了諸多不良影響。

滸苔(Ulvaprolifera)是黃海綠潮的常見種,其生活史包括孢子(2n)、配子(n)、合子(2n)、微觀繁殖體和藻體等階段[5]。微觀繁殖體泛指只進行營養(yǎng)繁殖的細胞團、單細胞或組織塊等,它具有強大的繁殖和抗逆能力,會在條件適宜時出現(xiàn)暴發(fā)性生長[5]。滸苔微觀繁殖體是綠潮“種子庫”,在綠潮暴發(fā)的早期階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。

近岸海水中氮、磷等物質(zhì)的增加會引起海水富營養(yǎng)化,也會對大型海藻生長、光合生理和生化組成產(chǎn)生影響[20-23]。氮、磷濃度的增加能顯著提高成體滸苔的相對生長速率、葉綠素熒光參數(shù)和凈光合速率[22],提高日本糖海帶(Saccharinajaponica)的相對生長速率,促進其Chla和可溶性蛋白的合成[23]。有研究發(fā)現(xiàn),相較于氮,磷對溫帶近岸海域石莼屬海藻的生長更為重要[24],并且海水中無機磷酸鹽(dissolved inorganic phoshphate, DIP)會與溫度、光強等環(huán)境因子產(chǎn)生交互作用[20,25]。目前有關(guān)磷對綠潮藻生長以及生理生化的研究多針對藻的成體階段[22-23],針對早期階段,如微觀繁殖體、幼苗的相關(guān)研究較少。

選取CO2和DIP兩個因子,探索單因子及交互作用對滸苔幼苗生長和光合生理特性的影響,為進一步揭示滸苔綠潮早期暴發(fā)原因和綠潮的預(yù)警防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 幼苗來源及培養(yǎng)條件

含滸苔微觀繁殖體的海水于2021年3月29日采自江蘇省南通市小洋口附近海水養(yǎng)殖場(121°09′73.45″E,32°33′50.06″N)。用孔徑200 μm篩絹過濾,去除海水中的藻絲體和大型浮游植物,低溫避光帶回實驗室。取過濾水樣50 mL置于滅菌燒杯中,加Provasoli培養(yǎng)基[26]和GeO2以抑制硅藻的生長,置于培養(yǎng)箱(GXZ-500C,寧波江南)中,通空氣培養(yǎng)3周,控制溫度為15 ℃、光合有效輻射為100 μmol·m-2·s-1、光周期為12 L∶12 D。實驗開始時,幼苗高度為0.8～1.0 cm。

1.2 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置CO2和DIP 2個因子,其中CO2分別為400 μatm(LC)和1 000 μatm(HC)2個水平,3個DIP梯度:0.32 μmol·L-1(LP)、3.62 μmol·L-1(MP)和36.2 μmol·L-1(HP)。實驗共設(shè)6個不同的CO2和DIP組合(LCLP: CO2400 μatm和DIP 0.32 μmol·L-1; LCMP: CO2400 μatm和DIP 3.62 μmol·L-1; LCHP: CO2400 μatm和DIP 36.2 μmol·L-1; HCLP: CO21 000 μatm和DIP 0.32 μmol·L-1; HCMP: CO21 000 μatm和DIP 3.62 μmol·L-1; HCHP: CO21 000 μatm和DIP 36.2 μmol·L-1),每個組合設(shè)3個平行,以LCMP 處理組(CO2400 μatm和DIP 3.62 μmol·L-1)為對照組。

LC為正常大氣CO2水平,通過直接向光照培養(yǎng)箱泵入空氣實現(xiàn),HC通過CO2植物培養(yǎng)箱(HP1000 G-D,武漢瑞華)來控制。DIP濃度通過NaH2PO4來調(diào)節(jié)。取(0.20±0.01)g幼苗置于550 mL通氣培養(yǎng)瓶中,瓶中裝500 mL滅菌海水(用0.45 μm濾膜過濾),按 1∶100 的比例添加Provasoli培養(yǎng)基[26]。培養(yǎng)瓶置于相應(yīng)植物培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d,培養(yǎng)箱溫度為15 ℃、光合有效輻射為100 μmol·m-2·s-1,每2天添加1次培養(yǎng)基。

1.3 海水碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)的測定

采用pH計(Seven Easy,Mettler Toledo)測定pH值,總堿度(total alkalinity,TA)根據(jù)Barakat滴定法測定[12],其他海水碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)根據(jù)TA和pH值計算得到[23]。

1.4 相對生長速率的測定和計算

每2天測定一次藻體質(zhì)量。用鑷子取出藻體,吸水紙輕輕吸干表面水分,快速稱重。相對生長速率(relative growth rate,RGR,%·d-1)計算公式如下:

RGR=100%×[ln(mt/m0)]/t

(1)

式中:mt為第t天藻體的質(zhì)量,m0為實驗開始時(第0天)藻體的質(zhì)量,t為培養(yǎng)天數(shù)。

1.5 葉綠素熒光參數(shù)的測定和計算

采用手持式PAM葉綠素熒光儀(AquaPen AP-P 100 Chech,捷克)測定不同光合有效輻射(photosynthetically active radiation,PAR)下的有效光合量子產(chǎn)率[effective quantum yield,Y(II)]。根據(jù)PAR和Y(II) 計算相對光合電子傳遞速率(relative electron transfer rate,rETR),公式如下:

rETR=Y(II)×0.5×PAR

(2)

式中:Y(II)指光系統(tǒng)II的有效光合量子產(chǎn)率;0.5為光系統(tǒng)II吸收的光量子占總光量子的比例;PAR分別為0,10,20,30,100,300,500和1 000 μmol·m-2·s-1。

對PAR和rETR值進行擬合,獲得快速光響應(yīng)曲線[27],計算最大相對光合電子傳遞速率(maximum rETR,rETRmax)、光能利用效率(light utilization efficiency,α)及飽和光強(saturation light intensity,Ek),公式如下:

rETR=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

(3)

式中:a、b、c為擬合參數(shù)。

rETRmax=1/[b+2×(a×c)1/2]

(4)

α=1/c

(5)

Ek=rETRmax/α

(6)

1.6 呼吸速率和凈光合速率的測定和計算

將藻體剪成1 cm左右的小段,在培養(yǎng)條件下適應(yīng)1 h以上,減小機械損傷造成的誤差。在反應(yīng)槽中加入8 mL純水,充分攪拌20 min,使其達到氧飽和,溫度控制在20 ℃。稱取約0.01 g藻體,在黑暗環(huán)境中適應(yīng)20 min,置于含8 mL培養(yǎng)基的反應(yīng)槽中待測。反應(yīng)槽避光,采用液相氧電極(YSI 5300A,美國)測定溶解氧百分比值,每間隔1 min測定一次并記錄數(shù)值,當連續(xù)3次測定數(shù)值變化幅度在0.1%～0.2%時,停止測定。根據(jù)GAO et al[28]的方法計算呼吸速率(Rd,μmol·g-1·h-1),公式如下:

Rd=(0.284×60×△d×8)/m

(7)

式中:0.284為 20 ℃時水中氧氣的飽和溶解度,60為時間單位轉(zhuǎn)換進率,△d代表穩(wěn)定后每隔1 min溶解氧百分比差值的平均值,8為反應(yīng)槽中的培養(yǎng)基體積,m為藻體的質(zhì)量。

同樣采用液相氧電極測定培養(yǎng)條件下(PAR為100 μmol·m-2·s-1)反應(yīng)槽中溶解氧百分比值,每隔1 min測定一次并記錄數(shù)值,當連續(xù)3次數(shù)值變化幅度在0.1%～0.2%時,停止測定。根據(jù)GAO et al[28]方法計算凈光合速率(Pn,μmol·g-1·h-1):

Pn=(0.284×60×△d×8)/m

(8)

1.7 色素的測定和計算

稱取0.05 g藻體置于離心管中,加入5 mL無水甲醇,于冰箱(4 ℃)中放置12 h,離心,取上清液,用分光光度計分別測定666 nm、653 nm、470 nm波長下的吸光度值。根據(jù)各波長下的吸光度值計算葉綠素a(chlorophylla,Chla)、葉綠素b(chlorophyllb,Chlb)、類胡蘿卜素(cartenoids,Car)的含量[29],公式如下:

wChl a=15.65A666-7.34A653

(9)

wChl b=27.05A653-11.21A666

(10)

wCar=(1 000A470-2.86wChl a-129.2wChl b)/221

(11)

式中:wChl a為Chla的含量;wChl b為Chlb的含量;wCar為Car的含量;A666、A653、A470分別為666 nm、653 nm、470 nm波長處的吸光度值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Origin 9.1軟件進行作圖和統(tǒng)計分析。分別用K-S檢驗和Levene檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。利用單因素方差分析和Turkey’s多重比較檢驗CO2和DIP處理組間的差異顯著性,利用雙因素方差分析檢驗CO2和DIP的交互作用對滸苔幼苗生長、生理的影響,以p<0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2和DIP對海水碳酸鹽系統(tǒng)的影響

表1 不同處理組的海水碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)

2.2 CO2和DIP對相對生長速率的影響

CO2和DIP對滸苔幼苗RGR均有顯著影響(p<0.05),但二者交互作用不顯著(p>0.05)。如圖1所示,在同一CO2水平下,RGR隨著DIP升高增加;相同DIP培養(yǎng)條件下,HC處理組RGR高于LC處理組,隨著DIP濃度增加,組間的差異增大。其中,在LP、MP培養(yǎng)條件下,不同CO2處理組間差異不顯著(p>0.05),在HP培養(yǎng)條件下,HC處理組RGR顯著高于LC處理組(p<0.05),增幅為11.75%。

圖1 不同處理下滸苔幼苗的相對生長速率

2.3 CO2和DIP對熒光參數(shù)的影響

雙因素方差分析顯示,CO2對滸苔幼苗Y(II)沒有顯著影響(p>0.05),DIP對其存在顯著影響(p<0.05),二者交互作用顯著(p<0.05)。如圖2所示,Y(II)隨著DIP增加而升高,在HP培養(yǎng)條件下達到高值0.76±0.01(LC)、0.74±0.02(HC),比在LP條件下分別提高了22.58%、15.63%。

圖2 不同處理下滸苔幼苗的有效光合量子產(chǎn)率

通過快速光響應(yīng)曲線(圖3)可以看出,各處理組的rETR均表現(xiàn)為先隨PAR的增加而升高,后逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢,其中,LCHP和HCHP組的rETR值較高。由該曲線計算得出的rETRmax、α和Ek,如表2所示。CO2和DIP對rETRmax存在顯著交互作用(p<0.05),對α、Ek的交互作用不顯著(p>0.05)。在同一CO2水平下,rETRmax、α、Ek均隨著DIP濃度的增加而升高,CO2水平顯著影響rETRmax與Ek(p<0.05),但對α影響不顯著(p>0.05)。在LP培養(yǎng)條件下,HC處理組的rETRmax、Ek水平顯著低于LC處理組(p<0.05),降幅分別為21.81%、27.52%;在MP、HP培養(yǎng)條件下,CO2對二者的影響均不顯著(p>0.05)。

圖3 不同PAR下滸苔幼苗的相對光合電子傳遞速率

表2 不同處理下滸苔幼苗的最大相對光合電子傳遞速率(rETRmax)、光能利用效率(α)與飽和光強(Ek)

2.4 CO2和DIP對凈光合速率和呼吸速率的影響

CO2和DIP單因子對Pn的影響顯著(p<0.05),但二者交互作用對其影響不顯著(p>0.05)。如 圖4a 所示,Pn隨著DIP濃度的增加而升高;同一DIP濃度下,HC處理組的Pn值均高于LC處理組,其中,高DIP濃度(HP)下的兩CO2處理組間的差異顯著(p<0.05)。

圖4 不同處理下滸苔幼苗的凈光合速率(a)和呼吸速率(b)

DIP對Rd存在顯著影響(p<0.05),但CO2以及交互作用對其影響不顯著(p>0.05)。圖4b顯示,同一CO2水平下,Rd隨DIP濃度的增加而降低。LC條件下,不同DIP處理組間的Rd差異不顯著(p>0.05);HC條件下,LP處理組的Rd值最高,為53.82±0.66 μmol·g-1·h-1,與MP處理組無顯著性差異(p>0.05),但顯著高于HP處理組(p<0.05),增幅為32.04%。

2.5 CO2和DIP對色素的影響

CO2、DIP單因子和二者交互作用均顯著影響滸苔幼苗的Chla、Chlb和Car的含量(p<0.05)。如圖5a所示,同一CO2水平下,Chla含量隨著DIP濃度的增加而升高,其中,在HP條件下,LC和HC處理組Chla含量均達到高值(0.98±0.05 mg·g-1,0.61±0.06 mg·g-1),二者間存在顯著差異(p<0.05);在MP條件下,HC處理組的Chla含量比LC處理組下降26.19%;在LP條件下,LC和HC處理組間的Chla含量沒有顯著差異(p>0.05),分別為0.10±0.04 mg·g-1和0.07±0.01 mg·g-1。

圖5 不同處理下滸苔幼苗的葉綠素a(a)、葉綠素b(b)與類胡蘿卜素(c)含量

Chlb、Car呈現(xiàn)出與Chla相同的變化趨勢(圖5b,5c)。同一CO2水平下,隨著DIP濃度的增加,色素含量升高;在MP、HP條件下,HC處理組的Chlb和Car含量顯著低于LC處理組(p<0.05);在LP條件下,LC和HC處理組間差異不顯著(p>0.05)。

3 討論

磷是大型海藻生長所需的關(guān)鍵因子,它既是遺傳物質(zhì)核酸的重要組分,也是光合磷酸化過程中三磷酸腺苷(ATP)形成的關(guān)鍵元素[34-35]。XU et al[21]研究發(fā)現(xiàn),當DIP濃度由0.5 μmol·L-1增加到40.5 μmol·L-1時,鈍馬尾藻的凈光合速率增加近1倍。在本研究中,高濃度DIP(HP)使?jié)G苔幼苗的凈光合速率較對照組(MP)增加了10%左右(圖4a),同時,有效光合量子產(chǎn)率(圖2)、最大相對光合電子傳遞速率和光能利用效率(表2)也均有提高,表明DIP升高促進了滸苔幼苗的光合作用,對其生長有利。并且,本研究中DIP濃度增加促進了幼苗色素的合成(圖5),與其他藻類如石莼屬[9,36]、鈍馬尾藻[21]、日本糖海帶[23]等的研究結(jié)果一致,這些研究認為高濃度DIP可能刺激一些與色素合成相關(guān)酶的生成[21]。

CO2和DIP的交互作用對生長和光合生理特性的影響在其他大型海藻中也有研究,如二者協(xié)同影響龍須菜、緣管滸苔的相對生長速率、凈光合速率、光合色素和蛋白質(zhì)含量[9,13]。本研究結(jié)果顯示,CO2和DIP對相對生長速率、凈光合速率、呼吸速率等指標的交互作用不顯著,但CO2或DIP單因子對3個指標的影響均顯著。高CO2水平和DIP在抑制幼苗的呼吸速率的同時提高其光合速率,從而對生長起到促進作用。另外,幼苗的飽和光強隨DIP的增加而升高,隨CO2的升高而降低,這與南方石莼(U.australis)[37]、條斑紫菜(Pyropiayezoensis)的結(jié)果不同[38],表明CO2和DIP對大型海藻的交互作用存在種屬特異性。

4 結(jié)論

本文研究了CO2和DIP對滸苔微觀繁殖體發(fā)育而來的幼苗的生長和光合生理特性的影響,結(jié)果表明,高CO2水平提高了幼苗的相對生長速率、凈光合速率和光能利用效率等指標,抑制Chla、Chlb和類胡蘿卜素合成;高DIP濃度顯著提高了相對生長速率、凈光合速率、最大相對光合電子傳遞速率、光能利用效率、飽和光強及色素含量等指標,抑制其呼吸速率。綜上所述,高CO2水平和DIP濃度會促進滸苔幼苗的生長,為滸苔綠潮的暴發(fā)提供有利條件。未來海洋酸化和富營養(yǎng)化的環(huán)境可能會使?jié)G苔綠潮暴發(fā)的可能性增加。