宋梅杰 譚春艷 劉翠華 李瑞 劉芳芳 任小林

摘要：【目的】篩選澳洲青蘋蘋果果實貯藏過程中虎皮病發(fā)生前的關鍵表達基因，為澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生預警研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳园闹耷嗵O蘋果果實為試材，于商業(yè)采收期采收并于低溫（0±0.5 ℃）下長期貯藏，監(jiān)測果實色澤和乙烯釋放量，同時統(tǒng)計冷庫貯藏期及冷藏后貨架期的虎皮病發(fā)病情況，并采用實時熒光定量PCR技術檢測與澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生相關基因的表達水平。【結果】澳洲青蘋蘋果低溫貯藏50 d 時，果實在冷庫中未發(fā)病，置于貨架期2 d 時，果實出現(xiàn)輕微的虎皮病癥狀；低溫貯藏70 d 時，果實在冷庫中開始發(fā)病?；谇叭搜芯考稗D錄組數(shù)據(jù)，鑒定到MdACO、MdAFS、MdCAT1、MdCAT2、MdPAL1、MdPAL2、MdC3H、MdPPO、MdPOD1、MdPOD2 與澳洲青蘋蘋果虎皮病相關；通過實時熒光定量PCR技術進一步分析，確定MdAFS、MdC3H和MdCAT1 的表達量在虎皮病發(fā)生前10 d，即貯藏第40 天急劇上升，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢，可作為虎皮病發(fā)生的預警基因。【結論】MdAFS、MdC3H和MdCAT1 可作為澳洲青蘋蘋果貯藏期虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。

關鍵詞：澳洲青蘋蘋果；冷藏；虎皮病；預警；基因表達

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1121-14

澳洲青蘋（Malus domestica Borkh.‘GrannySmith）作為世界上著名的綠色蘋果品種，果實具有優(yōu)良的品質和良好的耐貯性，備受廣大消費者的喜愛[1]。該品種果實除可直接食用外，更是加工蘋果汁的首選品種[2-3]。然而該品種在貯藏后期和貨架期會出現(xiàn)典型的虎皮病癥狀[4]。

虎皮病是蘋果采后主要生理性病害之一，表現(xiàn)為果皮上出現(xiàn)棕色或黑色斑點。隨著病程的加重，由開始的斑點逐漸向外擴展成片，顏色也會逐漸呈現(xiàn)褐色至深褐色，甚至果實出現(xiàn)凹陷、皺縮，最終腐爛變質[5]。雖然通常不會影響到果實的內(nèi)部質量，但伴隨著該病的發(fā)展，會嚴重影響果實的外觀品質和商品價值[6-7]。因此，如果能夠將澳洲青蘋蘋果在虎皮病發(fā)生前提前出庫，則可以在保持果實品質的同時，降低經(jīng)濟損失。因此，建立蘋果虎皮病的早期預測模型在蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展上具有重要意義。

目前關于蘋果虎皮病的研究多集中在其病因、發(fā)生條件以及利用不同采后處理方式延緩和控制蘋果虎皮病發(fā)生等方面[8]。大量研究表明，果實中α-法尼烯的氧化是虎皮病發(fā)生的主要因素，α-法尼烯合酶基因MdAFS 的表達量會先于虎皮病的發(fā)生而增加[9-12]。乙烯能通過調(diào)控AFS基因的表達，進而調(diào)節(jié)α-法尼烯的合成，對蘋果果實虎皮病的發(fā)展起到控制作用[13]。此外，在冷藏過程中，伴隨著H2O2和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累，果實開始出現(xiàn)虎皮病[14]。前人的研究也表明，虎皮病敏感的品種中過氧化物酶（peroxidase，POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性明顯低于抗病性品種，進一步表明抗氧化系統(tǒng)與虎皮病的發(fā)病率之間存在密切關系[15]。POD可將過氧化物還原為H2O2，并進一步清除體內(nèi)過量的過氧化氫，從而保護果實免受損害，過氧化氫酶（hydrogen peroxide，CAT）的作用與POD類似[13]。此外，Busatto 等[16]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸含量的增加與苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、對香豆酸3 羥化酶（P‐coumarate 3 hydroxylase，C3H）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的基因表達增強一致，表明虎皮病的發(fā)生與綠原酸途徑存在密切關系。另外Gong 等[17]認為發(fā)生虎皮病的蘋果果皮組織褐變的形成除了受多酚氧化酶的影響外，還有可能是由漆酶（laccase，LAC）活性變化引起的。

關于蘋果虎皮病發(fā)生預警的研究主要集中在葉綠素熒光參數(shù)及揮發(fā)性物質檢測方面，其中葉綠素熒光參數(shù)作為一種無損檢測指標，被廣泛地運用到采后貯藏相關領域。有研究初步證明，葉綠素熒光參數(shù)，即Fv/Fm的值可以預測澳洲青蘋、紅富士等多種果實虎皮病的發(fā)展狀況[18-19]。此外，有研究表明利用紫外吸收光譜評估α-法尼烯和共軛三烯（conjugated trienes）的含量變化，可作為冷庫中長期貯藏蘋果的虎皮病預警標記物[20-21]。然而，目前在分子層面還沒有可靠的方法預測蘋果虎皮病的發(fā)生。在蘋果采后貯藏期間，基因表達通常先于或伴隨著果實的成熟和衰老而變化，基于目前蘋果虎皮病的相關研究基礎，可通過結合轉錄組測序以及qPCR 進一步驗證的方法確定相應品種虎皮病發(fā)生的關鍵基因[22-23]。

筆者在本研究中以澳洲青蘋蘋果果實為試材，于商業(yè)采收期采收并對其進行低溫貯藏[ （0 ±0.5）℃]，90% 濕度，貯藏期監(jiān)測果實色澤和乙烯釋放量；同時統(tǒng)計冷庫貯藏期間及出庫后貨架期的虎皮病發(fā)病情況；并采用qPCR 技術分析與蘋果虎皮病發(fā)生密切相關的基因的表達水平；以篩選虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因，從而在果實發(fā)病前出庫，降低虎皮病造成的經(jīng)濟損失。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 植物材料澳洲青蘋于商業(yè)采收期（即花后150 d）采摘自寶雞千陽蘋果試驗站，選取大小一致，成熟度相對均勻、色澤相近、無機械損傷且無病蟲害的950 個果實，采收后立即運往實驗室，常溫下放置于西北農(nóng)林科技大學園藝學院采后生物實驗室12 h，去除田間熱后轉入冷庫[溫度：（0±0.5）℃，相對濕度：90%]中貯藏備用。

1.1.2 處理方法該試驗分為取樣組（150 個果實）和調(diào)查組（800 個果實），調(diào)查組分為冷庫調(diào)查組（200 個果實）及貨架期調(diào)查組（600 個果實）。冷庫調(diào)查組：分別在貯藏60、70、73、76、79、82、85 d 統(tǒng)計200 個果實的虎皮病發(fā)病情況。

貨架期調(diào)查組：分別在冷庫貯藏0、15、30、40、50、60、70、80 d 隨機取40 個果實測定色差，之后將果實轉移至常溫貯藏（溫度：25±0.5 ℃，相對濕度：85%），模擬貨架期，并統(tǒng)計0～10 d 貨架期期間果實虎皮病的發(fā)病情況（圖1）。

取樣組：分別在冷庫貯藏0、15、30、40、50、60、70、80 d 隨機取9 個果實，將其分為3 組，每組為1 個重復，共設置3 個生物學重復，于冷庫中測定乙烯釋放速率（圖1），之后立即對果皮組織進行存樣；當澳洲青蘋果實出現(xiàn)虎皮病后，對果皮健康組織與發(fā)病組織分別取樣。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實基礎生理指標的測定乙烯釋放速率的測定，在冷庫中隨機選取9 個果實，分為3 組，每組3個，放入8 L 玻璃干燥器中密封，1 h 后抽取1 mL氣體并使用氣相色譜儀（島津GC-14A）進行測定。色譜條件：GDX-502 色譜柱，載氣為氮氣（99.999%），柱溫為70 ℃ ，進樣口溫度為100 ℃ ，檢測室溫度110 ℃，乙烯釋放速率的單位為μL·kg-1 ·h-1。

色差的測定：使用手持式色差儀（日本美能達CR-400 型色差計）進行測量，每個果實沿果實赤道面取3 個點進行測量。用L*、a*、b*表示。其中，L*表示光澤明亮度，由0～100 表示由黑到白；a*表示紅綠值，由負到正表示由綠到紅；b*表示黃藍值，由負到正表示由藍到黃。

1.2.2 虎皮病發(fā)病情況的統(tǒng)計分別在0、15、30 d以及之后的每10 d 統(tǒng)計冷庫調(diào)查組中200 個果實的發(fā)病情況，同時在貨架期調(diào)查組中取出40 個果實轉移至常溫貯藏，統(tǒng)計7 d 或10 d 后該40 個果實的發(fā)病情況。發(fā)病率及發(fā)病指數(shù)計算公式如下：虎皮病發(fā)病率/%=（發(fā)病果數(shù)/總果數(shù)）×100，虎皮病的病情指數(shù)=Σ（病果數(shù)×病果級數(shù)）（/ 檢查總數(shù)×最高級數(shù)）[19]。

其中病果級數(shù)是根據(jù)蘋果虎皮病發(fā)病面積進行劃分，分為5 個等級，分別是：0 級未發(fā)病的正常果；1級病果病斑面積小于等于10%；2級病果病斑面積大于10%、小于等于30%；3 級病果病斑面積大于30%、小于等于50%；4級病果病斑面積大于50%（圖2）。

1.2.3 虎皮病相關基因qRT-PCR 驗證總RNA提?。簩Σ煌瑫r期存樣的果皮采用CTAB 法進行總RNA提取。稱取1 g 果皮組織，在液氮中將果皮研磨成粉末并放入離心管中；加入65 ℃下預熱的CTAB 溶液700 μL 和40 μL 的巰基乙醇，充分渦旋混勻；放置于65 ℃水浴鍋中水浴10 min，期間每隔幾分鐘進行輕微的上下翻轉，使其充分混合；加入700 μL 的氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻至乳白色，10 000 r · min-1 離心10 min；吸取上清液500μL 于2 mL的離心管中，再加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻后，10 000 r ·min-1離心10 min；吸取上清液500 μL 于1.5 mL 的離心管中，加入125 μL的LiCl 溶液，輕微翻轉數(shù)次；于-20 ℃過夜沉降；沉降后于4 ℃下融化，12 000 r·min-1離心20 min，小心吸掉上清；加入4 ℃預冷的75%乙醇500 μL，離心1 min，倒掉乙醇；加入4 ℃預冷的無水乙醇400 μL，離心1 min，倒掉無水乙醇，此步驟重復1次；之后吸掉無水乙醇，置于通風櫥，打開離心管蓋子自然晾干；20 min 后加入30 μL 的DEPC 水，吸打混勻使RNA溶解；使用Nanadrop 2000 測量RNA濃度，并通過在1.2%瓊脂溴化乙錠染色凝膠電泳檢測其質量；經(jīng)檢驗合格的RNA 樣品存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

cDNA 合成：使用PrimeScript RT 試劑盒（中國大連Takara）從1.0 μg DNA 游離RNA 合成第1 鏈cDNA，操作方法詳見說明書。實時熒光定量PCR：以蘋果組織中穩(wěn)定表達的MdActin、MdUBI 作為內(nèi)參基因；從NCBI 中下載基因序列，利用Primer3 設計RT-qPCR 引物，引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成，引物序列見表1。

1.2.4 轉錄組測序將0、30、50、80 d 健康組織和80 d發(fā)病組織的果皮進行轉錄組測序，分別記為：0、30、50、80、80 d-B，每個樣品3次重復，共15個樣品進行轉錄組測序，轉錄組測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。使用NovaSeq 6000 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別（Base calling）分析轉化為原始測序序列Raw reads。通過Fast QC軟件對Raw reads 進行測序的質量控制（QC）來評估測序數(shù)據(jù)，得到Clean reads之后，將產(chǎn)生的RNA-seq數(shù)據(jù)比對到參考基因組Malus ×domestica GDDH13V1.1 genome上，對統(tǒng)計結果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 差異表達基因的篩選根據(jù)FPKM 值＞5的基因作聚類熱圖。將錯誤發(fā)生率（false discoveryrate）＜0.05 且差異倍數(shù)（Fold change）＞2 的基因定義為差異表達基因，進而篩選與虎皮病相關且30 d和50 d存在明顯差異的基因做進一步分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS 和Origin 2022 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并繪制圖表，利用TBtools 進行數(shù)據(jù)歸一化熱圖繪制[24]。

2 結果與分析

2.1 澳洲青蘋在貯藏過程中虎皮病的發(fā)生情況

2.1.1 澳洲青蘋在低溫貯藏過程中虎皮病的發(fā)生情況澳洲青蘋在低溫貯藏過程中，貯藏前60 d 均未發(fā)生虎皮??；在貯藏70 d 后，果實表面出現(xiàn)輕微的虎皮病癥狀，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為12.5%和0.031；貯藏85 d 時，發(fā)病率提高到93.5%，病情指數(shù)從3.13 升高到0.439（圖3）。綜上，澳洲青蘋蘋果虎皮病在冷庫貯藏中主要發(fā)生在低溫貯藏中后期。隨著貯藏期的延長，發(fā)病率、病情指數(shù)急劇升高。

2.1.2 澳洲青蘋在冷庫貯藏后貨架期虎皮病的發(fā)生情況澳洲青蘋在低溫貯藏前期（0～40 d），果實長期冷藏后置于貨架期10 d 無虎皮病發(fā)生。低溫貯藏至50 d 時，果實置于貨架期第2 天開始出現(xiàn)輕微發(fā)?。话l(fā)病率和病情指數(shù)分別為55%和0.163，貨架期貯藏10 d 后，發(fā)病率升至70%，病情指數(shù)從0.163 增加到0.213；低溫貯藏至60 d 時，果實置于貨架期第1 天開始出現(xiàn)輕微發(fā)??；發(fā)病率和病情指數(shù)分別為55%和0.156，貨架期貯藏10 d 后，發(fā)病率升至100%，病情指數(shù)從0.156 增加到0.681（圖4，圖5）；低溫貯藏至70 d 時，冷庫中的果實開始出現(xiàn)輕微的虎皮病癥狀，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為20%和0.05（圖3），貨架期貯藏10 d 后，發(fā)病率升至100%，病情指數(shù)從0.05 增加到0.881；低溫貯藏至80 d 時，冷庫中的果實出現(xiàn)大量的虎皮病癥狀，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為82.5%和0.325，貨架期貯藏10 d 后，發(fā)病率升至100%，病情指數(shù)從0.325 增加到0.975（圖4，圖5）；綜上，在低溫貯藏后期（50～80 d），果實冷藏后放置貨架期2 d 內(nèi)，虎皮病的發(fā)病率及病情指數(shù)都呈現(xiàn)急劇上升趨勢，2 d 后上升較為緩慢。由此可見，對于冷藏后期貨架期的蘋果果實虎皮病的發(fā)生速度很快，在貨架期前2 d 就大量發(fā)生。

2.2 澳洲青蘋在低溫貯藏過程中乙烯釋放量的變化

澳洲青蘋在低溫貯藏期間，乙烯釋放速率在前50 d 內(nèi)隨著貯藏時間的延長呈緩慢上升的趨勢；冷藏50 d 后，乙烯釋放速率急劇上升。此時果實冷藏后轉入貨架期也開始出現(xiàn)虎皮?。▓D5，圖6）。

2.3 澳洲青蘋在低溫貯藏過程中果皮色澤和色度的變化

澳洲青蘋在低溫貯藏期間，貯藏15 d 時，L*值為78.46，第40 天后開始明顯降低。貯藏50 d 后，L*值呈現(xiàn)輕微上升趨勢，基本保持在65 左右。a*值在貯藏期間變化相對穩(wěn)定。b*值在貯藏40 d 時相比冷藏30 d 出現(xiàn)明顯上升趨勢，貯藏40 d 后變化較為穩(wěn)定，基本保持在35左右（圖7）。

2.4 澳洲青蘋在低溫貯藏過程中與虎皮病相關基因的表達量分析

基于前人關于虎皮病發(fā)生機制的大量研究結果發(fā)現(xiàn)，LAC、ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）、α-法尼烯合酶（alfa-farnesene synthase，AFS）、CAT、綠原酸途徑相關基因，即PAL、C3H 和PPO 與蘋果虎皮病具有相關性[9-17]?；谔O果基因組數(shù)據(jù)庫，提取鑒定以上與虎皮病發(fā)生相關酶的基因，共計247 個基因（表2）。

以澳洲青蘋低溫貯藏階段果皮組織為材料進行轉錄組測序分析，對以上基因做出進一步篩選，其中對FPKM＞5 的基因（28 個）進行重點關注，并繪制熱圖同時進行聚類分析。結果表明，28 個基因根據(jù)表達趨勢可聚為3 組，Group Ⅰ的基因在健康果皮組織中，表達量隨貯藏時間延長呈下降趨勢且在常溫貯藏條件下的表達量顯著高于低溫貯藏。其中，基因MD17G1098300、MD06G1008700、MD10G1321200在健康果皮組織中表達量顯著高于病皮組織；相反，基因MD00G1112500、MD08G1242900、MD08G1243000在病皮組織中表達量顯著高于低溫貯藏條件下健康果皮組織。值得注意的是，基因MD10G1321200 在低溫貯藏30 d 時的表達量高于低溫貯藏50 d 時表達量3 倍以上。Group Ⅱ的基因在低溫貯藏期間，健康果皮組織中表達量較高，且在低溫貯藏30 d與50 d的差異較為顯著。Group Ⅲ的基因在低溫貯藏期間，大部分基因的病皮組織中表達量顯著高于健康果皮組織。其中，基因MD10G1298500 在低溫貯藏期間，表達量呈逐漸下降的趨勢且健康果皮組織高于病皮組織。值得注意的是，基因MD03G1059200在低溫貯藏30 d 時的表達量高于低溫貯藏50 d 時表達量44倍以上。綜上，MdAFS（MD10G1311000）、MdACO（MD10G1328100）、MdCAT1（MD06G1008600）、Md-CAT2（MD06G1009000）、MdPAL1（MD01G1106900）、MdPAL2（MD07G1172700）、MdC3H（MD15G143660-0）、MdPPO（MD10G1298200）以及MdPOD1（MD10-G1321200）、MdPOD2（MD03G1059200）可能與澳洲青蘋蘋果虎皮病預警存在相關性（圖8）。

在此基礎上，對澳洲青蘋蘋果進行更加細致的取樣，并采用實時熒光定量PCR技術對以上候選基因進行趨勢富集分析以及表達量分析。結果表明，該類基因大致可分為四種趨勢。在澳洲青蘋蘋果低溫貯藏期間，A組基因與D組中MdPPO基因的表達量一致，呈先下降后上升的趨勢，其中，MdPPO在貯藏60 d 后開始上升，MdPAL1 在貯藏50 d 后開始上升；MdPPO在貯藏80 d 時健康組織的表達量顯著高于病皮組織，而MdPAL1呈相反趨勢。B組中MdPOD1和MdPOD2的表達量在低溫貯藏期間始終呈下降趨勢，且在果實貯藏第40天時急劇下降，較30 d分別下降了2.41倍和8.5倍。相反，C組呈明顯上升趨勢；其中MdACO、MdPAL2在貯藏第80天時，病皮組織的表達量顯著高于健康組織。MdCAT2 表達量在貯藏前期呈上升趨勢，在貯藏70 d 時達到頂峰，貯藏80 d 時急劇下降；相比病皮組織，健康組織中MdCAT2 的表達量較高。因此以上基因并不能作為澳洲青蘋蘋果貯藏期虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。D組中MdAFS和MdC3H的表達量在貯藏40 d 時顯著上升，隨后呈下降趨勢；其中MdAFS 在40 d 的表達量是30 d 的1.94倍，MdC3H在40 d的表達量是30 d的5.29倍；且兩個基因在70 d 和80 d 健康組織的表達量均顯著高于病皮組織。MdCAT1 表達量在貯藏40 d 時急劇上升，貯藏50 d 時急劇下降，隨后又呈逐漸上升的趨勢，相比病皮組織，健康組織中的MdCAT1 的表達量較高。由此可見，該類基因可作為澳洲青蘋蘋果貯藏期虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因（圖9）。

3 討論

澳洲青蘋在低溫貯藏期間隨著果實的成熟和衰老，果皮顏色也會發(fā)生相應的變化，由綠色轉變?yōu)辄S綠色。色差中L*值和b*值分別代表果皮的亮度及由綠轉黃的程度[25]。在本研究中，伴隨著虎皮病的出現(xiàn)，澳洲青蘋果實色差L*值呈現(xiàn)下降的趨勢，表明果皮亮度隨著貯藏時間的延長，逐漸變暗；直到貯藏50 d 后，L*值保持穩(wěn)定，此時果實在冷庫中未發(fā)生虎皮病，但冷藏后貨架期果實開始出現(xiàn)虎皮病。b*值在冷藏40 d 時相比冷藏30 d 顯著上升，40 d 后變化較為穩(wěn)定，這與田雪婷等[26]關于澳洲青蘋貯藏特性的研究結果一致。b*值的由低轉高，表明澳洲青蘋蘋果果皮由綠到黃的轉變，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是果皮中葉綠素發(fā)生降解，使得果皮逐漸顯現(xiàn)出黃色[27]。

乙烯作為調(diào)控蘋果果實成熟衰老的重要激素，可以調(diào)控MdAFS基因表達，進而控制α-法尼烯的合成；而α-法尼烯進一步氧化為共軛三烯以及其他產(chǎn)物，三者之間相互作用，共同影響著虎皮病的發(fā)展[28-29]。邵淑君[11]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯處理能夠促進國光蘋果虎皮病的發(fā)生，同時提升α-法尼烯及α-法尼烯合成酶MdAFS1 的相對表達量，相反1-MCP作為乙烯作用抑制劑，對虎皮病的發(fā)生起到了抑制作用。Zhou 等[30]證實了1-MCP處理可以抑制五九香（Wujiuxiang）梨的乙烯釋放和α-法尼烯代謝，以及Martins等[31]對澳洲青蘋進行輻射處理，同樣抑制了乙烯釋放和α-法尼烯生物合成相關酶的基因表達，進而減緩了虎皮病的發(fā)生。Liu 等[32]用蘆薈凝膠對Starking蘋果進行處理，乙烯釋放量在貯藏后期顯著增加；MdACS1 的表達量在冷藏期間上調(diào)，促進了α-法尼烯的釋放和氧化；從而加重了Starking 蘋果虎皮病的風險。Lindo-garcía 等[33]的研究中也提到，乙烯和PcAFS1 基因具有標記Blanquilla 梨虎皮病易感性的潛力。在本研究中，隨著貯藏期延長，MdACO的表達量逐漸上升，尤其在貯藏后期（70～80 d），在病皮組織的表達量顯著高于健康組織。然而，由于該基因在40 d 與50 d 表達量相比無顯著差異，所以不能對蘋果虎皮病起到預警的作用。MdAFS 在40 d時表達量急劇升高，隨之10 d 后即貯藏50 d 時，澳洲青蘋蘋果拿到貨架期2 d 時便開始出現(xiàn)虎皮??；由此證明，MdAFS可作為低溫貯藏期澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。

有研究表明，多酚氧化酶與虎皮病的發(fā)生具有密切相關性[34]。然而，Lu等[14]進一步證實，在冷藏過程中，虎皮病癥狀的發(fā)展高度依賴于H2O2和MDA的積累，而PPO活性則不太重要。在本研究中，PPO相關基因多在病皮中高表達，進一步證實了PPO與蘋果虎皮病存在明顯的相關性。但由于該基因40 d和50 d 的表達量差異不顯著，所以并不能作為虎皮病預警的關鍵基因。此外，胡小松等[35]早期的研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠誘導蘋果果實虎皮病的發(fā)生，過氧化氫酶能夠使虎皮病明顯減少。Rao 等[15]認為，虎皮病的發(fā)生與H2O2和脂質過氧化產(chǎn)物的增加密切相關。劉少華[13]在研究中提到，過氧化物酶可將過氧化物還原為H2O2從而清除果實組織內(nèi)過量的過氧化氫，進而保護果實免受損傷，過氧化氫酶的作用與過氧化物酶類似。因此，對以上基因也進行了重點關注。其中MdPOD1 和MdPOD2 表達量在低溫貯藏期間始終呈下降趨勢，且后期差別較小，可能是由于伴隨著虎皮病的出現(xiàn)，果實抗氧化酶活性顯著降低。雖然在預警時期點（即40 d）兩個基因的表達量下降較為顯著，均達到2 倍以上，但能否作為預警基因，仍然存在爭議，后期將針對這兩個基因進一步驗證。然而MdCAT1在低溫貯藏40 d時，相比10 d前即貯藏30 d 的表達量有明顯的上升趨勢，因此，Md-CAT1 可以作為低溫貯藏期澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。

也有研究結果顯示，由于MdPAL 和MdC3H 的激活上調(diào)表達，綠原酸的積累同樣會引起虎皮病的發(fā)生[36-37]。Busatto 等[16]研究指出綠原酸途徑以及隨后被多酚氧化酶氧化的途徑，是導致虎皮病發(fā)生的主要因素。在本研究中，MdPAL1 和MdPAL2 在低溫貯藏期間，尤其在病皮組織中表達量較高，在健康果皮組織中無顯著差異；MdC3H在低溫貯藏40 d 時，較10 d 前即貯藏30 d 的表達量有明顯上升趨勢，達到5 倍以上。因此，MdC3H可以作為低溫貯藏期澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。

近年來，漆酶已在許多植物中被發(fā)現(xiàn)，在蘋果貯藏過程中，該酶可以通過催化表兒茶素的氧化反應，在果皮中呈棕色，可能與虎皮病的發(fā)生有關[17]。Fang 等[38]研究發(fā)現(xiàn)漆酶參與荔枝果皮組織褐變的形成。Wei 等[39]發(fā)現(xiàn)漆酶介導的類黃酮聚合物在果皮褐變過程中起著重要作用，并通過對Red Delicious和Cortland 蘋果中的漆酶基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過DPA和1-MCP處理可以顯著抑制漆酶基因的表達；而對照蘋果果皮漆酶蛋白的酶活性隨貯藏時間的延長而升高，進而推測蘋果虎皮病的發(fā)生可能是由漆酶引起的；并提出為進一步證明漆酶在虎皮病發(fā)生中發(fā)揮作用，鼓勵未來的研究可以對虎皮病高度敏感的品種如澳洲青蘋或不同的超低氧貯藏條件進行更多的研究。楊陽等[40]首次對蘋果MdLAC基因家族進行鑒定，共得到77 個家族成員。綜上，基于前人的期望，筆者在本研究中對漆酶相關基因表達進行重點關注。研究結果顯示，澳洲青蘋蘋果在低溫貯藏條件下，漆酶相關基因在虎皮病發(fā)病初期表達量較低，而在病皮中的表達量較高，該結果與多酚氧化酶基因的表達分析結果類似。由此可以初步證明，漆酶與蘋果虎皮病存在一定相關性，但對于澳洲青蘋蘋果虎皮病預警并不能發(fā)揮較好的作用。綜上所述，MdAFS、MdC3H 和MdCAT1 可作為澳洲青蘋蘋果貯藏期虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。但是，該結果仍需進一步研究，以驗證該類預警基因的穩(wěn)定性即評估該類基因在其他蘋果品種的適用性，如易發(fā)生虎皮病的富士、紅星、國光、元帥等蘋果品種[5]。此外，澳洲青蘋蘋果多被用作榨汁原料，在今后的實際生活中，可嘗試調(diào)查已發(fā)病的澳洲青蘋蘋果果實口味仍可繼續(xù)食用的接受范圍，進而減少采后損失，進一步促進蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 結論

澳洲青蘋蘋果果實虎皮病主要發(fā)生在低溫貯藏中后期，即貯藏至50 d 時，放置貨架期果實開始出現(xiàn)虎皮病；貯藏至70 d時，果實在冷庫中開始發(fā)病?；谇叭说难芯?，筆者在本研究中對可能參與虎皮病發(fā)生的相關酶基因（MdACO、MdAFS、MdCAT1、Md-CAT2、MdPAL1、MdPAL2、MdC3H、MdPPO、Md-POD1、MdPOD2）進行了基因組鑒定及表達分析。其中MdAFS、MdC3H和MdCAT1 的表達量在虎皮病發(fā)生前10 d，即貯藏第40 天急劇上升，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。綜上所述，MdAFS、MdC3H 和MdCAT1可作為澳洲青蘋蘋果貯藏期虎皮病發(fā)生的關鍵預警基因。以上基因具有很好的預測能力，可用于預測澳洲青蘋蘋果貯藏期間虎皮病的發(fā)生，從而指導蘋果采后貯藏，旨在蘋果果實虎皮病出現(xiàn)之前能出庫銷售。該研究為澳洲青蘋蘋果虎皮病發(fā)生預警研究提供了理論依據(jù)。

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