張雁飛,蘇比娜·肖克來提,楊 磊,郝 慶,靳 娟,樊丁宇

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測實驗站,烏魯木齊 830091;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】棗(ZiziphusJujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZiziphusMill.)植物,原產(chǎn)中國[1]。棗具有良好的生態(tài)和經(jīng)濟效應(yīng),適應(yīng)性廣,已育成800多個棗樹品種[2]。但棗樹品種和類型命名較混亂,尤其是在同音異義詞和同義詞的使用上。鮮食棗品種冬棗有20多個不同的地方名稱。需要建立一套準確鮮食品種鑒定方法。【前人研究進展】農(nóng)作物的品種鑒定方法主要包括生化鑒定法、物理化學(xué)鑒定法、形態(tài)學(xué)鑒定法和DNA分子標記法[3]。前3種鑒定方法耗時長,且易受環(huán)境因素的影響;而運用DNA分子標記法來進行種質(zhì)和品種鑒定,具有快速、高效和準確的優(yōu)點[4]。SSR(Simple sequence repeat,簡單重復(fù)序列)廣泛分布于真核生物基因組中[5],因其高多態(tài)性、共顯性、穩(wěn)定性和適于自動化分析等特點,被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保護、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究、遺傳作圖、DNA指紋分析和分子標記輔助育種等領(lǐng)域[6]。麻麗穎等[7]利用從冬棗中開發(fā)的12對SSR引物,分析36份棗種質(zhì),構(gòu)建了36份棗品種的指紋圖譜,為棗樹分類、種質(zhì)鑒定和分子育種提供了重要的工具。原勤勤等[8]分析38份棗樹品種遺傳多樣性,其多態(tài)性比率為88.47%。殷曉等[9]利用SSR標記分析了陜北54份棗種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu),在分子水平上研究陜北棗品種群遺傳結(jié)構(gòu)表明,陜北棗屬于中度雜合,遺傳多樣性豐富,供試品種交流頻繁,遺傳多樣性與品種間親緣關(guān)系之間有密切的聯(lián)系。江錫兵[10]、艾呈祥[11]等利用SSR分子標記對栗雜交F1代進行了遺傳多樣性分析,多樣性指數(shù)為0.881 6～1.131 7,其子代均有豐富的遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】對各類棗樹鑒定的相關(guān)研究已有很多,但未有專為鮮食棗品種鑒定的方法總結(jié),需研究種質(zhì)為保存于新疆的26份鮮食棗種質(zhì)資源,通過該試驗來構(gòu)建棗品種DNA指紋圖譜?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究利用22對SSR引物構(gòu)建26份鮮食棗種質(zhì)資源指紋圖譜,分析其遺傳多樣性,為鮮食棗品種鑒定和遺傳多樣性分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

26份鮮食棗品種資源保存在新疆葉城果樹科學(xué)觀測實驗站棗資源圃。采集26個棗品種的幼嫩葉片,利用改良CTAB方法提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量分光光度計檢測質(zhì)量和濃度,并將樣液保存于-20℃冰箱待用。表1

表1 26份鮮食棗品種名稱及產(chǎn)地來源

22對SSR引物序列由北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室龐曉明課題組開發(fā)提供,由上海派森諾基因科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 SSR-PCR擴增體系

利用三引物法PCR(即在5′端加有M13 尾巴序列的特異正向引物、特異反向引物及帶有熒光標記的通用型M13 引物,利用毛細管電泳技術(shù)可以同時檢測不同熒光染料標記的多個SSR 位點)擴增SSR 位點。

SSR-PCR反應(yīng)為20 μL體系,包含1 μLDNA 模板,各1 μL 正反向引物,2 μL 10*Buffer,0.5 μL dNTP, 0.5 μLTaq酶,14 μL ddH2O。

PCR 擴增程序按以下步驟進行:首先95℃預(yù)變性5 min;其次95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)10次;隨后95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)25 次;最終72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物中加入LIZ 500與HiDi內(nèi)標,震蕩充分混勻,瞬離以除去管壁樣品;經(jīng)95℃變性4 min后迅速移至冰上冷卻,放置于ABI 3730 XL全自動DNA測序儀內(nèi)進行毛細管電泳檢測,用Gene-Marker軟件(Soft Genetics LLC,USA)進行數(shù)據(jù)分析。表2

表2 SSR引物信息

1.2.2 指紋圖譜構(gòu)建

參考麻麗穎等[7]方法構(gòu)建指紋圖譜。以所分析的SSR引物名稱為前綴,該標記在某樣品上擴增帶的分子量為后綴,得到每個品種在某個標記的帶型編號。按照固定的引物排序綜合不同引物分析結(jié)果,串聯(lián)各帶型編號,形成該品種的SSR指紋圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)凝膠結(jié)果同一位置有無條帶進行賦值,有條帶賦值記為“1”,無條帶則賦值記為“0”,根據(jù)賦值在Excel中建立26份材料的 “0-1”矩陣。計算不同群體的等位基因數(shù)(Allele number,Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of allele,Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)[12](Shannon’s information index,I)和觀察雜合度(Heterozygosity,Ho)等進行對比分析,計算引物多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content,PIC)[13]。通過NTSYS軟件進行遺傳相似性分析并計算遺傳相似系數(shù)(Genetic identity,GI)和遺傳距離(Genetic distance,GD)。采用UPGMA(非加權(quán)配對法)聚類分析,在樹狀圖中構(gòu)建26份棗品種之間基于遺傳相似性的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細管電泳結(jié)果

研究表明,利用22對SSR引物對26份棗品種進行多態(tài)性分析。22對SSR標記在26個品種中共擴增出130條等位片段,平均每對引物能擴增到5.909個,其中BFU1279和BFU0308擴增的等位基因數(shù)最多,為10個;BFU0263和BFU0614擴增的等位基因數(shù)最少,為2個。各引物的多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.237 7～0.855 6,平均為0.59。平均每個位點觀測等位基因數(shù)(Na)為5;有效等位基因數(shù)(Ne)為3.776;雜合度(Ho)為0.927;Shannon信息指數(shù)(I)為1.371。表3

表3 22對SSR引物多態(tài)性信息及其遺傳參數(shù)

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

研究表明,3對SSR引物組合(BFU00308、BFU1157和 BFU0547)就可以將26份棗品種完全區(qū)分開。其中引物 BFU0308和BFU1157的區(qū)分能力最強,多態(tài)位點數(shù)分別達10和9個,可以區(qū)分京滄6號、京滄8號、賽蜜酥1號和迎秋紅等26個品種。表4

表4 26個棗品種的SSR指紋圖譜

2.3 聚類分析

研究表明,26份棗品種的遺傳相似系數(shù)在0.65～1.00,平均相似系數(shù)為0.83。在遺傳相似系數(shù)0.65處可將26個品種分為兩大類。第一大類包括24個品種,其中秦820(8)與早冬1號(11)相似系數(shù)最大,2個品種之間有很近的親緣關(guān)系;依次親緣關(guān)系較近的迎秋紅(10)和京39(22),京滄8號(6)和阜帥(7)之間的遺傳相似系數(shù)為0.97;玉嬌(2)、懶漢冬棗(25)、圓鈴2號(20)和賽蜜酥1號(5)都與金絲小棗(S26)聚成了一個小類群;ZS9和雨帥也聚在了一個小類群內(nèi),遺傳相似系數(shù)達到0.86,2品種之間的親緣關(guān)系近;第二大類包括兩個品種,金芒果棗(15)和美蜜棗(24)與其它 24個品種的遺傳相似系數(shù)都比較低,在0.6左右,與其他品種具有較遠的親緣關(guān)系。圖1

圖1 26個紅棗品種的聚類

3 討 論

SSR(簡單重復(fù)序列)和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)已經(jīng)成為植物遺傳分析和標記輔助育種的主要標記[14-16]。然而,對于研究較少的植物,如棗樹,開發(fā)SNPs的成本很高,目前只有幾個SSR標記被報道為闡明遺傳多樣性的優(yōu)越分子工具[17-18]。SSR分子標記具有高多態(tài)性和重復(fù)性,共顯性遺傳等優(yōu)勢。研究所用的22對SSR分子標記是經(jīng)過篩選獲得的多態(tài)性引物,具有較強的區(qū)分能力,在各品種中均表現(xiàn)出清晰的多態(tài)性帶型,可用于基因型分析并構(gòu)建指紋圖譜。使用3個引物便可準確鑒別出26個棗品種,品種間遺傳相似系數(shù)在0.65～1.00。Li等[19]利用一組59個SSR標記對1 863個地方品種的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析。麻麗穎等[7]構(gòu)建了36份棗種質(zhì)的SSR指紋圖譜,為棗樹品種鑒定和分子育種提供了重要工具。張春梅等[20]利用5對SSR引物鑒定了黃河沿岸的50個不同酸棗樣品的遺傳相似性和群體結(jié)構(gòu),為酸棗種質(zhì)資源保存和利用提供了依據(jù)。殷曉等[21]對陜北不同區(qū)域8個品種群的54份種質(zhì)資源進行了SSR分子標記分析并研究了品種群間的遺傳關(guān)系,揭示了棗品種群分化及棗種質(zhì)在起源地的親緣關(guān)系。

DNA指紋圖譜技術(shù)在植物種質(zhì)鑒定方面具有重要的作用。研究通過毛細管電泳篩選出的22對核心引物對26份棗品種(系)進行了指紋圖譜的構(gòu)建和UPGMA聚類分析。根據(jù)各品種的特征譜帶數(shù)據(jù)其中的3對特定引物(BFU0308,BFU1157和BFU0574)可將26個品種完全區(qū)分開,通過SSR DNA分子標記可以構(gòu)建較理想的棗品種DNA指紋圖譜,在棗品種鑒定研究中具有重大意義。毛細管電泳畢其他電泳法相比具有成本低和減少排廢污染等優(yōu)點[22]。但有一些SSR標記應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳來驗證,避免檢測出一些非目標PCR擴增產(chǎn)物。

4 結(jié) 論

共擴增出130條等位片段,平均5.909個。多態(tài)信息含量(PIC)變化范圍為0.237 7～0.855 6,平均為0.59。22對SSR引物的雜合度介于0.500～1.000,平均為0.927。3對引物BFU0308,BFU1157和BFU0574組合能完全區(qū)分26個棗品種。26個品種遺傳相似系數(shù)在0.65～1.00,相似系數(shù)0.65處可將26個品種分為兩大類群。