陳乙煌,邢 利,東珍珍,馬小梅,黃建軍,羅曉霞

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300,2.新疆阿拉爾市十三團(tuán)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】放線菌是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中防治病蟲害的重要微生物資源[1-2]。塔里木盆地在干旱極端環(huán)境下孕育著具有耐旱抗鹽的荒漠植物。檉柳是新疆植被中的主要物種之一,主要分布在塔里木盆地,挖掘檉柳土壤微生物資源,對于新疆主要農(nóng)牧業(yè)病害的防控及保護(hù)和利用新疆極端環(huán)境放線菌資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】張金輝等[3]從阿勒泰福?？h周邊檉柳根際土樣中分離得到的噬鹽糖多孢菌A-064對番茄早疫病菌等具有較強(qiáng)抑制作用。【本研究切入點(diǎn)】以檉柳根際土壤為材料,分離檉柳根際放線菌[4-5],以細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylohydrolytic)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi),以及植物病原真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)、鏈格孢(Alternariatenuissima)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)為靶標(biāo)菌進(jìn)行拮抗活性放線菌生物篩選?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇新疆南疆地區(qū)10種檉柳根際土壤的放線菌資源,采用四種培養(yǎng)基,研究新疆塔里木盆地放線菌資源代謝產(chǎn)物的多樣性,為農(nóng)牧業(yè)病害防治提供更多藥物先導(dǎo)化合物的生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品

采集新疆南疆地區(qū)10種不同地點(diǎn)的檉柳根際土壤樣品于無菌樣品盒子中,置于4℃保存,備用。表1

表1 土壤樣品信息

1.1.2 供試靶標(biāo)菌

以革蘭陽性細(xì)菌代表種S.aureus,E.coli,P.aeruginosa,K.pneumonia,E.amylohydrolytic,S.typhi,C.albicans,A.tenuissima,V.dahliae,F.oxysporum為靶標(biāo)菌保存于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)高氏一號培養(yǎng)基[6];(2)5號培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,酵母提取物1 g,檸檬酸鐵0.1 g,NaCl 19.45 g,MgCl25.9 g,Na2SO43.24 g,CaCl21.8 g,KCl 0.55 g,NaHCO30.16 g,KBr 0.08 g,SrCl234 mg,H3BO322mg,硅酸鈉 4 mg,NaF 2.4 mg,NH4NO31.6 mg,Na2HPO48 mg,瓊脂16 g,蒸餾水1 L,pH 7.0～7.5;(3)8號培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g,燕麥片10 g,(NH4)2SO42 g,K2HPO41 g,MgSO41 g,NaCl 1 g,CaCO32 g,微量元素溶液 1 mL,瓊脂 16 g,蒸餾水 1 L,pH 7.2;(4)甘油精氨酸培養(yǎng)基[7];(5)TSB液體培養(yǎng)基[8];(6)MHA(MHB)培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)和拮抗活性篩選[9];采用SDA(SDB)培養(yǎng)基用于白色念珠菌的培養(yǎng)和拮抗活性篩選[9];(7)OA(OB)培養(yǎng)基用于鏈格孢的培養(yǎng)和拮抗活性篩選[10];(8)PDA(PDB)培養(yǎng)基用于棉花枯黃萎病菌的培養(yǎng)和拮抗活性篩選[11]。

1.1.4 主要儀器

PCR 儀:SENSO,德國;凝膠成像儀器ChemDoc XRS+:伯樂公司,美國;超凈工作臺SW-CJ-2F:博迅,上海;電泳儀DYCZ-26C:六一儀器廠,中國;電熱恒溫水浴鍋DHP-9272:一恒,上海;離心機(jī)Centrifuge 5415 D:Eppendorf,德國。

1.2 方 法

1.2.1 根際土壤放線菌的分離

稱取1 g土壤樣品置于9 mL無菌的生理鹽水,充分振蕩混勻,即為10-1土壤懸濁液;依次稀釋10倍,采用倍性稀釋法分別配置成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6土壤懸濁液。以不同區(qū)域樣品為材料,采用iChip[12]技術(shù),選取高氏一號培養(yǎng)基,5號培養(yǎng)基,8號培養(yǎng)基,甘油精氨酸培養(yǎng)基進(jìn)行放線菌的分離培養(yǎng)[13-17],以上培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀,放線菌酮,萘啶酮酸和制霉菌素以抑制細(xì)菌和霉菌的生長,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～20 d,分離到的放線菌[13-14]經(jīng)純化培養(yǎng),收集于20%甘油中,在-80℃冷凍保存。

1.2.2 檉柳根際土壤菌株的鑒定

采用CTAB法提取放線菌的基因組DNA,以基因組DNA為模板,以27F和1 492R為引物,引物序列27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR擴(kuò)增,送樣測序。將測序后的16S rDNA序列提交到EzBiocloud(http://www.ezbiocloud.net),對16S rDNA 進(jìn)行相似性比對搜索,判斷菌株種類。選取相似序列,到NCBI的blast(Basic Local Alignment Search Tool,序列對比工具) 工具比對,分析菌株的相似性,使用MEGA 7.0[18],選擇GenBank中與之同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列,以塔里木大學(xué)菌株排序?yàn)榫幪枠?gòu)建菌株 Neighbor- Joining系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 拮抗活性篩選

分離的放線菌劃線培養(yǎng)制成菌餅備用。(1)細(xì)菌活性篩選:將靶標(biāo)菌接種至MHB液體培養(yǎng)基中,37℃,180 r/min搖床培養(yǎng)8 h,吸取菌液加入到 MHA培養(yǎng)基中,混勻倒板。將分離的放線菌菌餅分別接入,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(2)真菌活性篩選:靶標(biāo)菌為白色念珠菌,棉花黃萎,鏈格孢時(shí)分別用SDA,PDA,OA培養(yǎng)基培養(yǎng),分別接種至液體培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min搖床培養(yǎng)72 h,將靶標(biāo)菌菌懸液涂布培養(yǎng),接入菌餅,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。觀察其抑菌活性及計(jì)算抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 檉柳根際土壤菌株的分離

研究表明,共分離獲得放線菌294株,不同地點(diǎn)的檉柳根際土壤樣品分離的放線菌數(shù)量有明顯不同,HT51檉柳根際土壤樣品分離的菌株最多,共有118株;HT49檉柳根際土壤樣品次之,共有89株;HT53檉柳根際土壤樣品和HT65檉柳根際土壤樣品最少,0株。

甘油精氨酸培養(yǎng)基分離出的菌株最多,共有119株;其次是高氏一號培養(yǎng)基,共有80株;5號培養(yǎng)基最少,共有33株。甘油精氨酸培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基較適合分離其根際土壤放線菌。圖1

注:A:不同土壤樣品分離的菌株數(shù)量;B:不同培養(yǎng)基分離的菌株數(shù)量

2.2 檉柳根際土壤菌株的鑒定

研究表明,檉柳根際土壤菌株分屬于7個綱12個目16科24個屬,24個屬分別是鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單胞菌屬(Micromonospora)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、微桿菌屬 (Microbacterium)、無色桿菌屬(Achromobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes)、副根瘤菌 (Paramesorhizobium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、沙門氏菌 (Salmonellaenterica)、從毛單胞菌屬(Comamonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、新根瘤菌(Neorhizobium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、香味菌屬(Myroides)、博代氏桿菌屬(Bordetella)、葉狀桿菌屬(Phyllobacterium)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、居海綿粉色桿狀菌(Roseivirga)、劍菌屬(Ensifer)。除鏈霉菌以外的稀有放線菌包括小單孢菌,微桿菌和纖維菌屬。圖2

注:A:16S rDNA電泳圖 B:16S rDNA序列擴(kuò)增電泳圖(M:為maker,P為陽性,N為陰性)

鑒定的150株菌株中,有9株相似度小于98.65%,為潛在新物種。將9個潛在新物種歸屬于3個屬,分別是Paramesorhizobium,Streptomyces,Pseudonocardia等3個屬的潛在新物種。其中TRM 76038與ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性98.26%,為Paramesorhizobium;TRM 76037與StreptomycescoeruleorubidusISP 5145相似性98.06%,為Streptomyces;TRM 76012與ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性97.89%,為Paramesorhizobium;TRM 76006與StreptomycesalbogriseolusNRRL B-1305相似性98.59%,為Streptomyces;TRM 76011與StreptomycesgossypiisoliTRM 44567相似性97.43%,為Streptomyces;TRM 76023與StreptomyceslongispororuberNBRC 13488相似性98.64%,為Streptomyces;TRM 76246與Pseudonocardiazijingensis6330相似性98.65%,為Pseudonocardia;TRM 76249與StreptomycesasenjoniiKNN 35.1b相似性98.26%,為Streptomyces;TRM 76070與StreptomycesniveoruberNBRC 15428相似性98.51%,為Streptomyces。圖3

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建檉柳根際

2.3 檉柳根際土壤放線菌的拮抗活性篩選

研究表明,對E.coli有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對E.coli的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到17 mm;對S.aureus有拮抗活性菌株有8株,TRM 76185和TRM 76130對S.aureus病原菌的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到18 mm;對P.aeruginosa有拮抗活性菌株有11株,TRM 76072對P.aeruginosa的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到20 mm;對K.pneumonia有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對K.pneumonia的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到16 mm;對E.amylohydrolytic有拮抗活性菌株有9株,TRM 76187對E.amylohydrolytic的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到16 mm;對S.typhi有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對S.typhi的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到16 mm;對C.albicans有拮抗活性菌株13株,TRM 76101對C.albicans的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到22 mm;對A.tenuissima有拮抗活性菌株有47株,TRM 76177對A.tenuissima的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到25 mm;對V.dahliae有拮抗活性菌株有16株,TRM 76156對V.dahliae的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)到30 mm;對F.oxysporu有拮抗活性菌株有12株,TRM 76159對F.oxysporu的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈20 mm。篩選的150株檉柳根際土壤放線菌中,具有抗菌活性的放線菌有68株,約占鑒定總數(shù)的46%。表2

3 討 論

3.1對分離的294株菌株經(jīng)初步排重后,篩選后鏈霉菌為優(yōu)勢類群,與夏占峰等[19]潘文娟等[20]所得的結(jié)果相符。選用了V.dahliae等為靶標(biāo)菌,可以運(yùn)用當(dāng)?shù)匚⑸镔Y源去解決當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物生產(chǎn)過程中所遇到的植物真菌感染問題。

3.2對于不同靶標(biāo)菌的抑制,檉柳根際土壤的放線菌對A.tenuissima有抑制作用的數(shù)量最多,對V.dahliae病原菌有抑制作用的放線菌數(shù)量其次。菌株來源不同,對病原菌的抑制作用也會有不同,表現(xiàn)出土壤樣品種類和地域方面的差異,與王婧等[21]所得結(jié)果相符合。TRM 76063和TRM 76033雖然16S rDNA基因序列相似性都是99.56%,但是其抑菌活性差異又很大,在拮抗活性篩選時(shí),不同土壤樣品的同一物種的菌株,活性也會不同,即為同一物種的菌株活性有差異。

4 結(jié) 論

從采集的的檉柳根際土壤樣品中分離并鑒定出150株土壤放線菌,其屬于7個綱12個目16科24個屬,另有9個潛在新種,以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,大腸桿菌,肺炎克雷伯菌,解淀粉歐文氏菌,傷寒沙門氏菌,白色念珠菌,鏈格孢菌,棉花黃萎病菌,棉花枯萎病菌為靶標(biāo)菌,篩選出68株活性放線菌。