李怡歆,陳 勇,劉曉祿,艾尼江·爾斯?jié)M,徐李娟,4,劉倩倩,包曉瑋,宋素琴

(1.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室,烏魯木齊 830091;2.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院,烏魯木齊 830052;3.新疆農業(yè)科學院土壤肥料與農業(yè)節(jié)水研究所,烏魯木齊 830091;4.新疆農業(yè)大學農學院,烏魯木齊 830052;5.新疆生產建設兵團第十三師農業(yè)科學研究所,新疆額敏 839000)

0 引 言

【研究意義】極端環(huán)境包括高壓、高堿、高酸、高溫、高鹽和高輻射等[1]。極端環(huán)境的微生物因其生存的極端環(huán)境決定其生長繁殖以及代謝路徑等[2]。且代謝產物能抵抗外界對自身的傷害[3]。鹽湖因蘊含豐富的氯化鈉,是一種咸水化水體。新疆是我國內陸鹽類主要產地之一,例如羅布泊鹽湖、艾比鹽湖、巴里坤鹽湖、達坂城鹽湖和烏爾禾鹽湖等?！厩叭搜芯窟M展】從達坂城鹽湖分離到的微生物大多屬于Firmicutes和γ-proteobacteria兩大類群,包括鹽單胞菌屬(Halomonas)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬 (Halobacillus)、鹽水球菌屬 (Salinicoccus)、Ornithinibacillus、Oceanobacillus、Thalassobacillus和Salimicrobium[4];以及中度嗜鹽菌Moderatelyhalophilicbacteria[5]、嗜鹽古菌Natrialba、Haloarcula、Haloterrigena、Halorubrum等[6]?！颈狙芯壳腥朦c】從普通環(huán)境例如土壤及植物體內分離出的活性菌株及其活性代謝產物的種類具有極高的重復率。目前,對新疆達坂城鹽湖嗜鹽細菌的研究較少,需要進一步挖掘達坂城鹽湖的嗜鹽菌資源。【擬解決的關鍵問題】采集達坂城鹽湖湖邊淤泥,選用不同的分離培養(yǎng)基對其進行嗜鹽細菌的分離培養(yǎng),根據(jù)形態(tài)進行分離,結合16S rRNA 基因序列,對部分放線菌開展活性研究,為研究新疆達坂鹽湖地區(qū)嗜鹽細菌物種基因資源的多樣性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

于新疆達坂城鹽湖(88°03′53″～88°12′15″E, 43°21′00″～43°25′25″N),湖水邊緣,用采集器采集15～20 cm深處的淤泥樣品,分裝于無菌密封袋,置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

M-2(海藻糖-脯氨酸)培養(yǎng)基:Trehalose 6g,Proline 1 g,KNO30.5 g,Na2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl20.5 g,agar15 g,H2O 1 L,pH 7.2

MM瓊脂培養(yǎng)基[7]:glucose 0.5 g, yeast extract 0.5 g,K2HPO40.3 g,NaCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,CaCO30.1 g,MnCl·4H2O 0.02 g,ZnSO40.07 g,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基:Glycerol 10.0 g,Asparagine 1 g,K2HPO41 g,微量鹽1 ml,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

M-1(TWYE):Yeast 0.25 g, K2HPO40.5 g,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

每種培養(yǎng)基滅菌前均添加終濃度為25 mg/L的萘啶酮酸和50 mg/L的制霉菌素。

拮抗植物病原菌采用PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑

NaOH、NaCl、MgSO4、MnCl2等均為化學純。

1.1.4 植物病原菌

西瓜枯萎(尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum)、水稻惡苗(串珠鐮孢菌Fusariummoliniforme)、棉花枯萎(尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum)、核桃腐爛病(殼囊孢Cycosporasp.)、蘋果樹腐爛病(殼囊孢Valsamalivar.mali)。以上病原菌由中國農業(yè)大學種子健康中心提供。

腫瘤細胞:腫瘤細胞采用人肝癌細胞HepG2,由浙江大學海洋學院提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離和純化

稱取6 g土樣,在干燥箱中進行70℃烘干處理2 h[8],之后從中稱取2 g加人盛有18 mL無菌水的三角燒瓶中,振蕩1 h后吸取1 mL土壤懸浮液到含9 mL無菌水的試管中,制成10-2的土壤懸液,按10倍法依次稀釋至10-4。吸取10-2和10-4濃度的稀釋液各0.2 mL,分別接于上述平板培養(yǎng)基上,每個稀釋度2個重復,用涂布棒均勻涂布后置于30和37℃恒溫下倒置培養(yǎng),并采用劃線分離法對菌株進一步的純化分離,4℃斜面保存,根據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)特征對放線菌進行鑒定[9]。

1.2.2 相關模式菌株

構建系統(tǒng)進化樹外源菌:Bacillussubtilis(AS1.1849)。

1.2.3 16S rRNA序列的測定

1.2.3.1 細菌總DNA的提取

在滅菌的2 mL/1.5mL的離心管中加入20 μL 無菌水,用槍頭挑取適量菌體,混勻并標記。100℃沸水浴沸騰5 min,放入-20℃冷凍5 min,此步驟重復2次,28℃,5 000 r/min,離心3 min。

1.2.3.2 16S rRNA序列的PCR擴增

采用細菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`)擴增菌株16S rRNA 序列。PCR擴增程序:95℃預變性5 min,主循環(huán)(94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,30 s),循環(huán)30次,終延伸72℃,7 min,4℃保存。擴增中利用水代替 DNA 模板作為空白對照。PCR擴增產物采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性產物送至北京鼎國昌盛生物技術責任股份有限公司進行純化測序,測序結果與 GenBank 的序列進行BLAST比對。

1.2.4 基于16S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育學

用MEGA 7.0的 Neighbor-Joining 法構建16S rRNA 相似序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建。

1.2.5 菌株發(fā)酵液以及粗提物的制備

在超凈工作臺內,用10 μL的槍頭挑取放線菌菌落,轉接于甘油-天門冬酰胺液體培養(yǎng)基,30℃,180 r/min,恒溫震蕩培養(yǎng)5～7 d。待發(fā)酵完成后,用乙酸乙酯等體積混合震蕩萃取發(fā)酵液3次,回收濃縮得發(fā)酵液粗提物。

1.2.6 拮抗菌株篩選

1.2.6.1 抗菌活性

采用平板對峙法測定所分離到的放線菌對植物病原菌的抑菌效果。在超凈臺內,用5 mm打孔器將PDA平板打孔,每個平板打四個孔,打孔位置距離培養(yǎng)皿中心距離相等,用滅菌竹簽挑取植物病原菌的新鮮孢子接于平板中心,再用槍頭吸取100 μL離心后的菌株發(fā)酵液上清液,注入孔內,以不接發(fā)酵液的平板為對照,28℃培養(yǎng), 5～7 d后觀察記錄有無抑菌圈產生。

1.2.6.2 抗腫瘤活性篩選

選用人源細胞株HepG2(人肝癌細胞株)為檢測對象,采用磺酰羅丹明B(SRB)方法[10]檢測菌株發(fā)酵液粗提物對HepG2細胞增殖的抑制作用,菌株粗提物用DMSO配成10 mg/ml得濃度。

收集對數(shù)生長期HepG2細胞并以8×103細胞/孔的密度種于96孔板內,過夜培養(yǎng)后加藥,以阿霉素為陽性藥,設置3個重復,繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后取出96孔板,棄去培養(yǎng)基后每孔加入100 μL 10%的三氯乙酸水溶液,4℃冰箱中固定至少2 h。然后取出96孔板,棄去三氯乙酸溶液,并用緩慢流動的水沖洗至少4遍并烘干,再加入80 μL 1%醋酸配制的0.4% SRB溶液染色20 min,期間配置1%醋酸水溶液,染色結束后用1%醋酸水溶液沖洗4遍以去除未結合的染料,再次烘干至完全干燥后每孔加入100 μL 10 mM Tris溶液,并震蕩使與蛋白結合的染料完全溶解,再置于酶標儀中于515 nm處檢測吸光度。

抑制率=(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值×100%。

2 結果與分析

2.1 達坂城鹽湖嗜鹽細菌的分離鑒定

研究表明,共獲得14個屬18株嗜鹽細菌,其中 M-7培養(yǎng)基(甘油-天門冬酰胺) 共分離到 11個屬 13個不同種的嗜鹽細菌。表1,圖1

表1 不同培養(yǎng)基分離到的嗜鹽細菌種屬

注:a:菌株DBC23;b:菌株DBC30;c:菌株DBC31;d:菌株DBC5;e:菌株DBC9;f:菌株DBC10

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育學

研究表明,菌株18位于Bacillus的屬中,和眾多Bacillus在同一個分支上,菌株18與其親緣關系較近,同源性為95.93%。菌株23屬于Nocardioides屬,且單獨位于一個較長分支上,同源性為97.43%。圖2,圖3

圖2 菌株18基于 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株23基于 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 放線菌發(fā)酵液的抗菌活性

研究表明,DBC26、DBC31和DBC5對病原菌具有潛在的抗菌活性,其中DBC26和DBC31有拮抗棉花枯萎病菌活性,為Tsukamurellasinensis和Nocardiopsiscrassaminis,DBC5有抗水稻惡苗病菌活性,是Streptomyceslongispororuber。表3

表3 達坂城鹽湖嗜鹽放線菌抗菌活性

2.4 放線菌粗提物抗腫瘤活性

研究表明,菌株DBC5對HepG2細胞增殖的抑制率最高,達到了96.4%;其次是菌株DBC9,抑制率為91.8%;菌株DBC10和菌株DBC26的抑制率分別為87.8%和83.2%;菌株DBC24的抑制活性較弱,抑制率僅為16.7%,而菌株DBC3對HepG2細胞增殖沒有抑制率。表4

3 討 論

3.1研究共獲得14個屬18株嗜鹽細菌,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)和鏈霉菌屬(Streptomyces)為優(yōu)勢菌屬,且放線菌大多為稀有放線菌。其中 M-7培養(yǎng)基(甘油-天門冬酰胺) 共分離到 11個屬 13個不同種的嗜鹽細菌,分離效果好于其他3種培養(yǎng)基, 認為M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基分離鹽湖可以得到較多種類的嗜鹽細菌。可能是因為甘油碳源,能適當?shù)恼{節(jié)培養(yǎng)基滲透壓;而L-天門冬酰胺可能是鹽湖微生物賴以生存的一種有機酸,滿足了高鹽環(huán)境嗜鹽細菌的生理和特殊的營養(yǎng)需求。用M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基分離死海嗜鹽放線菌[11]。

表4 鹽湖放線菌發(fā)酵液粗提物對HepG2細胞的抑制作用

3.2極端環(huán)境生長的放線菌所需的營養(yǎng)條件不同于普通環(huán)境的放線菌,鹽湖環(huán)境除了高鹽的特性,還存在著豐富的化學離子,如Na+、K+、Mg2+、SO42-等,李二陽[12]和唐蜀昆[13]等研究發(fā)現(xiàn)當湖水化學成分出現(xiàn)差異,會導致菌群結構特異演化。離子成分對鹽湖微生物的生長起著驅動作用,為培養(yǎng)基成分的選擇提供了參考。因此,在分離鹽湖環(huán)境的菌株時,應充分考慮分離條件和培養(yǎng)基的設計。分離出較多放線菌的M-7培養(yǎng)基中,成分包括了除Na+外的K+、Mg2+。此外,試驗設置了30和37℃2個溫度梯度,發(fā)現(xiàn)37℃條件下分離放線菌的效果優(yōu)于30℃,冢村氏菌(Tsukamurella)是從達坂城鹽湖分離出的稀有放線菌,放線菌的分離存在著溫度效應[14]。

3.3菌株DBC23和菌株DBC18的16S rRNA序列與已知的菌株 16S rRNA序列相似度分別在97.43%和95.53%,為潛在新種,需要進一步研究。抑菌實驗中篩選到3株具有拮抗活性的放線菌,進行了初步的拮抗活性篩選,其中具有拮抗活性的放線菌3株,屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)冢村氏菌屬(Tsukamurella)。而關于冢村氏菌的活性報道較少,放線菌(DBC26)值得進一步研究。

4 結 論

從新疆達坂城鹽湖湖邊15-20cm深的淤泥樣品中分離出了18株菌,鑒定為14個屬,是Bacillus(2株)、Pseudoxanthomonas(1株)、Rhodococcus(1株)、Micromonospora(1株)、Streptomyces(2株)、Brevibacterium(1株)、Tsukamurella(2株)、Planococcus(1株)、Nocardiodes(1株)、Metabacillus(1株)、Paenibacillus(1株)、Microbacterium(1株)、Micrococcus(1株)、Nocardiopsis(2株)。其中冢村氏菌(Tsukamurella)是從達坂城鹽湖中分離出。對放線菌進行了抗植物病原菌測試,其中DBC5、DBC26和DBC31分別對水稻惡苗和棉花枯萎具有初步的抑制效果,DBC5、DBC9的細胞增殖抑制率均在90%以上。