張小雪，梁舒靜，王惠欣，王輝

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050015

氨基酸是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑之一，常用氨基酸類(lèi)蛋白質(zhì)保護(hù)劑有甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、肌氨酸等［1-3］。本公司重組蛋白制品在制備過(guò)程中加入了適量的甘氨酸和組氨酸。低濃度甘氨酸降低了蛋白質(zhì)藥物變性的風(fēng)險(xiǎn)［4-5］，可預(yù)防重組人生長(zhǎng)激素在凍干過(guò)程中聚集［6-8］。組氨酸為較常見(jiàn)賦形劑，其內(nèi)部咪唑基團(tuán)有助于發(fā)揮較好的pH 緩沖作用［9-11］。重組制品中的游離氨基酸含量對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義［12-13］，《中國(guó)藥典》三部（2020 版）生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制的要求中，曾明確提出了生物制品生產(chǎn)企業(yè)用于生物制品注射劑生產(chǎn)的藥用輔料應(yīng)檢測(cè)其含量［14-15］。本研究建立了重組蛋白制品中甘氨酸和組氨酸含量檢測(cè)的柱前衍生反相高效液相色譜法（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC），并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1供試品及對(duì)照品 重組蛋白藥物（批號(hào)：20211011）為本公司自制；α-氨基丁酸、甘氨酸、組氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2主要試劑及儀器 乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Honeywell 公司；AccQ·Fluor 氨基酸衍生試劑盒（waters WAT052880）、AccQ Tag Eluent A濃縮液（waters WAT-052890）、AccQ Tag氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm，Waters WAT052885）、高效液相色譜儀（2695）均購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；紫外檢測(cè)器（EVOLUTION 201）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；磺基水楊酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；超濾離心管（UFC5010BK）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3溶液配制

1.3.1流動(dòng)相A 取200 mL AccQTag Eluent A 液（配方為：140 mmol／L乙酸鈉，17 mmol／L三乙胺，1 mg／mL EDTA 二鈉鹽，0.5%NaN3，用濃磷酸調(diào)pH 至4.95 或5.05）與2 000 mL 超純水混勻，經(jīng)0.22μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，超聲振蕩5 min。

1.3.2流動(dòng)相B 取乙腈1 000 mL，經(jīng)0.22μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，超聲振蕩1 min。

1.3.3流動(dòng)相C 取100%超純水1 000 mL，超聲振蕩10 min。

1.3.41.5%磺基水楊酸 取磺基水楊酸1.5 g，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3.5.1α-氨基丁酸內(nèi)標(biāo)溶液取α-氨基丁酸40 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5.2甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 取甘氨酸對(duì)照品375.5 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5.3組氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 取組氨酸對(duì)照品375.5 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.6AccQ·Fluor 衍生劑溶液 將AccQ·Fluor 衍生劑粉末輕彈至瓶底，加1 mL AccQ·Fluor稀釋劑，振蕩10 s，55 ℃加熱9 min使粉末溶解。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、供試品、空白對(duì)照溶液的制備

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液 取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 mL，用組氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL，取0.9 mL，加1.5%磺基水楊酸8.1 mL，混勻，室溫靜置2 h；3 000×g離心10 min；分別取上清液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、1.0 mL，加超純水定容至1 mL，混勻。

1.4.2供試品及空白對(duì)照品溶液 每個(gè)重組制品平行制備3份供試品。分別取供試品和超純水0.1 mL，與0.9 mL 1.5%磺基水楊酸混勻，按1.4.1項(xiàng)靜置離心后，取0.3 mL上清液與0.7 mL超純水混勻。

1.5各溶液加內(nèi)標(biāo)溶液及衍生

1.5.1加內(nèi)標(biāo)溶液 分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液、空白對(duì)照品溶液各0.1 mL，加超純水0.4 mL，與α-氨基丁酸內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL混勻。

1.5.2衍生 分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液、空白對(duì)照品溶液各10μL，加硼酸緩沖液70μL，渦旋混合，瞬時(shí)離心后在渦旋狀態(tài)下加入AccQ·Fluor衍生劑溶液20μL，持續(xù)渦旋混合15 s。衍生后標(biāo)準(zhǔn)曲線中甘氨酸為2.25、4.51、6.76、7.89、9.01、11.27μg／mL，組氨酸為72.85、145.70、218.54、254.96、291.39、364.24μg／mL，即S1 ～S6溶液。

1.6檢測(cè)方法 將S1 ～S6溶液、供試品溶液、空白對(duì)照品溶液按表1 試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析。色譜條件：色譜柱為AccQ Tag-C18（3.9 mm × 150 mm，4 μm）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm；柱溫為37 ℃；上樣體積為10μL。進(jìn)樣前用流動(dòng)相A 平衡30 min，至基線平穩(wěn)。按照空白對(duì)照、S1 ～S6、系統(tǒng)適用性（S3）、供試品溶液依次進(jìn)樣，以S3 為系統(tǒng)適用性樣品，每3 ～6 個(gè)樣品后加入1針系統(tǒng)適用性樣品，依次循環(huán)。

表1 試驗(yàn)條件Tab.1 Experiment condition

1.7方法的驗(yàn)證

1.7.1專(zhuān)屬性 取不含甘氨酸、組氨酸的空白制劑溶液，用空白制劑溶液超濾換液后的重組蛋白溶液，按1.5項(xiàng)方法加入內(nèi)標(biāo)溶液和衍生后，按1.6項(xiàng)方法檢測(cè)甘氨酸、組氨酸與內(nèi)標(biāo)α-氨基丁酸的分離情況。

1.7.2線性 將S1 ～S6 溶液分別進(jìn)樣，以甘氨酸或組氨酸濃度為橫坐標(biāo)，甘氨酸或組氨酸峰面積／內(nèi)標(biāo)峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.7.3檢測(cè)限 按1.5 項(xiàng)衍生后制備甘氨酸、組氨酸分別為1.13、36.43μg／mL的SL1溶液和甘氨酸、組氨酸分別為0.56、18.21μg／mL的SL2溶液，進(jìn)樣分析各樣品信噪比。

1.7.4定量限 將組氨酸與甘氨酸對(duì)照品溶液按7∶1混合，平行制備6份。按1.5項(xiàng)衍生后制備甘氨酸、組氨酸分別為4.69、32.86μg／mL 的溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算甘氨酸或組氨酸峰面積／內(nèi)標(biāo)峰面積值的RSD。

1.7.5重復(fù)性 平行取6份重組蛋白制品（批號(hào)：2021-1011），按1.5和1.6項(xiàng)方法進(jìn)行衍生和液相分析，每份樣品進(jìn)樣1 次，檢測(cè)甘氨酸或組氨酸含量，并計(jì)算其峰面積／內(nèi)標(biāo)峰面積值的RSD。

1.7.6中間精密度 不同實(shí)驗(yàn)人員于不同日期對(duì)6份重組蛋白制品（批號(hào)：20211011）進(jìn)行衍生和液相分析，每份樣品進(jìn)樣1 針，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)人員不同日期檢測(cè)同一樣品的RSD。

1.7.7準(zhǔn)確度 將供試品和甘氨酸、組氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按1.4 項(xiàng)取上清液后，按低、中、高劑量（0.2、0.3、0.4 mL）加入經(jīng)1.4 項(xiàng)處理的0.15 mL 重組蛋白上清液中，用水定容至1 mL，每組平行制備3份，經(jīng)沉淀蛋白，按1.5和1.6項(xiàng)方法進(jìn)行衍生、液相分析，計(jì)算甘氨酸、組氨酸加樣回收率。

1.7.8溶液穩(wěn)定性 分別取1 份供試品、標(biāo)準(zhǔn)溶液S3，按1.4 項(xiàng)處理后，按1.5 和1.6 項(xiàng)方法進(jìn)行衍生、液相分析，將同一個(gè)樣品分別在0、12、18、24、30、48 h進(jìn)樣分析，計(jì)算甘氨酸或組氨酸峰面積／內(nèi)標(biāo)峰面積值的RSD。

1.8數(shù)據(jù)采集及分析 使用Waters Empower 3 色譜數(shù)據(jù)軟件采集和處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1專(zhuān)屬性 在甘氨酸、組氨酸出峰位置無(wú)可見(jiàn)干擾峰，符合專(zhuān)屬性驗(yàn)證要求。內(nèi)標(biāo)峰與甘氨酸、組氨酸峰充分分離。見(jiàn)圖1。

圖1 α-氨基丁酸與甘氨酸、組氨酸分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of Glycine and Histidine separated from α-aminobutyric

2.2線性 甘氨酸濃度在2.25 ～11.27μg／mL范圍內(nèi)，組氨酸濃度在72.85 ～364.24μg／mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2分別為0.997、0.999，均＞0.99，見(jiàn)圖2。

圖2 甘氨酸（A）、組氨酸（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Glycine（A），Histidine（B）

2.3檢測(cè)限 甘氨酸濃度為2.25 μg／mL 時(shí)，信噪比為2.5，為滿足供試品檢測(cè)要求，且信噪比接近3，因此確定甘氨酸檢測(cè)限為2.25 μg／mL；組氨酸濃度為18.21 μg／mL 時(shí)，信噪比為17，確定為組氨酸的檢測(cè)限為18.21μg／mL。

2.4定量限 甘氨酸濃度為4.69μg／mL、組氨酸濃度為32.86μg／mL時(shí)，兩者信噪比分別為5和20，將此作為定量限，均低于供試品經(jīng)衍生處理后甘氨酸（6.76μg／mL）和組氨酸（218.54μg／mL）理論含量。6 份定量限樣品甘氨酸和組氨酸峰面積／內(nèi)標(biāo)峰面積值的RSD分別為9.2%和2.5%，符合驗(yàn)證要求。

2.5重復(fù)性 6 份樣品甘氨酸濃度的RSD為4.6%，組氨酸濃度的RSD為5.0%，符合重復(fù)性驗(yàn)證要求。見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（μg／mL）Tab.2 Verification for reproducibility（μg／mL）

2.6中間精密度 不同實(shí)驗(yàn)員不同日期檢測(cè)甘氨酸濃度的RSD為6.9%，組氨酸濃度的RSD為2.0%，符合中間精密度驗(yàn)證要求。見(jiàn)表3。

表3 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果（μg／mL）Tab.3 Verification for intermediate precision（μg／mL）

2.7準(zhǔn)確度 甘氨酸低、中、高濃度的平均回收率分別為111.7%、108.7%、75.9%，各濃度回收率RSD分別為7.5%、2.8%、15.7%；組氨酸低、中、高濃度的回收率分別為97.3%、94.5%、88.9%，各濃度回收率RSD分別為0.8%、2.6%、9.7%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8溶液穩(wěn)定性 在0、12、18、24、30、48 h 內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品衍生樣品溶液甘氨酸濃度的RSD為4.3%，組氨酸濃度的RSD為3.4%；供試品衍生樣品溶液甘氨酸濃度的RSD為7.7%，組氨酸濃度的RSD為3.3%。見(jiàn)表4。表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 溶液穩(wěn)定性驗(yàn)證（μg／mL）Tab.4 Verification for solution stability（μg／mL）

3 討論

涉及到游離氨基酸含量檢測(cè)的方法目前有分光光度法、氨基酸分析儀法、HPLC 法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超臨界流體色譜法、多維液相色譜法等［16-18］，受檢測(cè)成本和應(yīng)用范圍的影響，在重組蛋白制品的測(cè)定中，HPLC 法為常用的測(cè)定方法［19-22］。但目前，RP-HPLC在針對(duì)重組蛋白檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中多是僅測(cè)定1種氨基酸，且測(cè)定含量相對(duì)較高［23-24］。本研究建立的方法可同時(shí)檢測(cè)兩種含量相差數(shù)倍的游離氨基酸，其中甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.25 ～11.27μg／mL范圍內(nèi)。注射液中甘氨酸含量接近定量限，易受干擾，在一定程度上增加了甘氨酸檢測(cè)難度，本研究為同時(shí)檢測(cè)蛋白制品中兩種含量相差數(shù)倍的游離氨基酸提供了思路。

本研究采用內(nèi)標(biāo)法，相比于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法可校正物理和化學(xué)損失，提高測(cè)定的準(zhǔn)確性［25-26］。α-氨基丁酸作為本研究?jī)?nèi)標(biāo)，性質(zhì)與甘氨酸、組氨酸相近，能完全溶解于供試品中，且能與待測(cè)氨基酸各峰充分分離，可滿足甘氨酸、組氨酸含量的測(cè)定需求［27-28］。

本研究以AccQ·Fluor氨基酸衍生試劑作為衍生劑，柱前衍生過(guò)程為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟［29-30］，經(jīng)優(yōu)化，將在硼酸環(huán)境中定量的游離氨基酸與過(guò)量AccQ 衍生劑迅速混合，衍生時(shí)采用水平圓周振蕩器IKA MS 3 basic，調(diào)整轉(zhuǎn)速至500 r／min，此時(shí)溶液形成渦流狀態(tài)，操作簡(jiǎn)單且衍生效果較好。各樣品分別用計(jì)時(shí)器單獨(dú)混勻15 s，快速操作，并保證衍生劑現(xiàn)用現(xiàn)配，以避免衍生劑與空氣接觸，經(jīng)衍生生成的氨基酸衍生物較穩(wěn)定。

本研究?jī)?yōu)化并明確了柱前衍生的操作，采用內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定出兩種氨基酸。該方法專(zhuān)屬性好，分離完全，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，適用性較強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可操作性強(qiáng)，可用于重組蛋白制品中甘氨酸、組氨酸含量的檢測(cè)。