于興艷 綜述，李濤，楊毅 審校

1.江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西南昌 330004；2.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇南通 226133；3.百奧賽圖（北京）醫(yī)藥科技股份有限公司，北京102609

自1986 年鼠源單克隆抗體藥物莫羅莫那單抗（muromonab-CD3）成功研發(fā)以來，由于抗體藥物具有高活性、高特異性及副作用低等優(yōu)點，已成為生物制品領域的研究熱點之一。目前，全球已有超過100個抗體藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準上市，另有數(shù)百種抗體藥物處于不同的臨床研發(fā)階段［1-2］，美國FDA 批準上市的主要治療性抗體相關信息見表1?？贵w藥物在腫瘤、代謝性疾病和自身免疫疾病等領域取得了理想的治療效果，同時也豐富了疾病的治療手段，使患者的治療向精準化、個性化方向發(fā)展。

表1 1986—2021年美國FDA批準上市的主要治療性抗體Tab.1 Major therapeutic antibodies approved by FDA from 1986 to 2021

盡管治療性抗體在臨床上獲得了理想效果，但抗體藥物的免疫原性可能引發(fā)機體抗藥物免疫反應，從而誘導抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）的產(chǎn)生［3-5］。ADA 可通過中和／非中和藥物活性，影響藥物的清除和生物利用度，改變藥物藥代動力學和藥效學特性。在臨床中，ADA 可干擾或阻斷藥物的治療效果，并可能導致不同程度的不良反應；在臨床前研究中，ADA 可干擾候選分子的有效性評價和分子篩選。本文就影響治療性抗體免疫原性的因素、ADA 的類型及形成機制、ADA 的檢測方法、降低免疫原性的方法及針對高免疫原性藥物的臨床前動物模型研發(fā)等作一綜述，以期為抗體藥物的研發(fā)提供參考。

1 影響治療性抗體免疫原性的因素

治療性抗體免疫原性受多種因素的影響，總體可歸納為患者和藥物相關因素兩個方面。

1.1患者相關因素 患者相關因素主要包括患者的遺傳背景、疾病類型、患病狀態(tài)等?；颊叩倪z傳背景如人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的多態(tài)性，可通過T 細胞依賴性（T cell dependent，Td）途徑響應程度影響ADA 的產(chǎn)生，攜帶HLADRb-11、HLA-DQ-03及HLA-DQ-05 等位基因的患者在接受抗體治療后形成ADA 的風險較高［6］。不同類型疾病及患者的疾病狀態(tài)存在顯著的個體差異，對ADA產(chǎn)生的風險具有較大影響。相較于患有惡性腫瘤等存在免疫系統(tǒng)功能缺陷或接受免疫抑制劑治療的患者，自身免疫疾病患者由于機體過度活躍的免疫系統(tǒng)，更易產(chǎn)生ADA［7-9］。

1.2藥物相關因素 藥物相關因素主要包括藥物的內源性因素（如異源氨基酸序列、分子大小、結構及產(chǎn)品純度等）及外源性因素（如給藥劑量、給藥途徑、給藥頻率、藥物配方、雜質及儲存條件等）［10］。由于人鼠之間的種屬差異較大，鼠源抗體存在較大比例的異源氨基酸序列，導致早期鼠源抗體更易誘導ADA的形成，如在接受莫羅莫那單抗治療的患者中，免疫原性反應發(fā)生率達25%［11］。一般來說，相對分子質量大于10 000或分子結構復雜的藥物通常顯示出較高的免疫原性，天然抗體結構及納米抗體具有較小的相對分子質量，可大幅降低免疫原性；非天然存在的雙抗／多抗則具有較為復雜的結構，免疫原性更高［12-14］。不同的給藥方式影響抗原遞呈細胞對抗原的提呈能力，進而影響免疫反應的發(fā)生，如皮下注射后產(chǎn)生ADA 的風險高于靜脈注射［15］。同時，高劑量、高頻次的給藥往往更易誘導產(chǎn)生ADA［5］。另外，配方不合理、雜質殘留、儲存條件及糖基化模式等的改變，均可能引起治療性抗體的聚集或變形，導致發(fā)生免疫原性反應的風險增加［16］。因此，提高藥物的穩(wěn)定性，降低藥物聚集幾率，也是降低藥物免疫原性的主要途徑之一。

2 ADA的形成機制及類型

2.1ADA的形成機制 抗體可通過Td及T細胞非依賴性（T cell independent，Ti）途徑誘導產(chǎn)生ADA［17-18］。在Td 途徑中，治療性抗體作為抗原，經(jīng)抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs）攝取并內化后，通過其表面的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）與T細胞受體相互作用，并將抗體表位提呈給輔助性T 細胞（helper T cells，Th），Th 與B 細胞接觸并分泌相關細胞因子誘導B 細胞向漿細胞增殖和分化，形成的漿細胞能夠合成并分泌針對該治療性抗體的特異性ADA。另外，機體也可通過Ti 途徑誘導ADA，具有多個抗原表位的治療性抗體可直接與B 細胞受體（B cell receptor，BCR）相互作用，最終刺激漿細胞合成ADA［5］。

2.2ADA 的類型 ADA 可分為中和抗藥抗體（neutralizing anti-drug antibodies，NADAs）及非中和抗藥抗體（non-neutralizing anti-drug antibodies，non-NADAs）兩種類型［17,19］。NADAs 具有與治療性抗體相同的抗原結合表位，直接阻斷或干擾藥物與靶標的結合，從而影響藥物的生物活性及藥效；non-NADAs 不具有與治療性抗體相同的抗原結合表位，因此不影響藥物與對應靶點的結合，但non-NADAs 可結合治療性抗體的其他區(qū)域，促進抗體免疫復合物的產(chǎn)生，加速體內藥物的清除速率，進而影響藥物治療效果［19］。

3 ADA的檢測方法

在治療性抗體的研發(fā)過程中，免疫原性及ADA的檢測和評估至關重要。針對治療性抗體的免疫原性檢測，美國FDA 于2019 年發(fā)布了《治療性蛋白產(chǎn)品的免疫原性檢測——開發(fā)和驗證抗藥性抗體的檢測方法》指導原則［20］，為ADA 分析方法的建立及驗證提供了依據(jù)。目前，針對ADA 檢測方法的研究主要基于ELISA 法，即通過連接不同標記的特異性抗體分子來檢測ADA，還可采用電化學發(fā)光法、表面等離子體共振法及放射免疫沉淀法等檢測ADA［12］。在臨床前研究中，由于物種差異，藥物在動物中的免疫原性不能真實反映在人體中的效果。開展HLA結合試驗、T 細胞刺激試驗、外周血單核細胞刺激試驗等基于人源組織或細胞的檢測方法［18，21］，可為下一步臨床試驗中ADA 發(fā)生率的預測提供更加真實可靠的依據(jù)。另外，基于蛋白質組學研究構建的MHC-Ⅱ多肽表位文庫，也為藥物免疫原性的預測奠定了基礎［22］。在Ⅰ期臨床試驗中，當抗體首次在人體中使用時，應仔細分析ADA 的形成與藥物藥代動力學、藥效學及毒理學之間的關系，以便更好地規(guī)避ADA可能帶來的風險［5］。

4 降低治療性抗體免疫原性的方法

4.1制備人源化抗體 ADA 的產(chǎn)生限制了鼠源單克隆抗體在臨床上的進一步應用。為能獲得安全有效的治療性抗體，研究者通過提高抗體序列中人源氨基酸序列的比例，以降低鼠源單克隆抗體的強免疫原性。1984 年，MORRISON 等［23］通過基因重組技術將鼠源單克隆抗體的可變區(qū)基因與人抗體的恒定區(qū)基因連接構建了第一代人-鼠嵌合抗體，不僅保留了鼠源單克隆抗體與抗原特異性結合的能力，同時也降低了鼠源單克隆抗體的免疫原性，如利妥昔單抗（Rituximab）。由于嵌合抗體序列中仍保留約30%鼠源可變區(qū)基因，還可能誘導ADA，通過互補決定區(qū)（complementary determining region，CDR）移植等技術［24］，將非人源抗體CDR 移植至人抗體的骨架區(qū)（framework regions，F(xiàn)R），從而構建出人源化抗體，抗體人源化程度可達90%以上，免疫原性得到進一步降低。噬菌體展示技術及全人源抗體轉基因小鼠等新技術的出現(xiàn)也促進了全人源抗體藥物的開發(fā)［25-26］。噬菌體展示技術主要是用目標蛋白對構建的人抗體噬菌體文庫進行高效篩選，一般可在較短的周期內獲得與目標蛋白特異性結合的抗體；而人源抗體轉基因動物則是將人抗體序列通過轉基因技術，隨機或原位插入動物基因組中，動物機體受到抗原刺激后，能夠分泌針對該抗原的人鼠嵌合抗體或全人源抗體。目前，全球已有多家醫(yī)藥公司開發(fā)出人源抗體轉基因動物平臺［27］（見表2）。相比于噬菌體展示技術，從人源抗體轉基因動物中獲得的抗體不僅更加符合抗體自然產(chǎn)生過程，如抗體類型的轉換、克隆選擇及親和成熟等，且抗體的成藥性及安全性等均得到顯著提升［26］。人源抗體轉基因動物平臺已成為人-鼠嵌合抗體／全人源抗體藥物的主要研發(fā)手段，約70%已獲批上市的人源抗體的研發(fā)源于該技術平臺，如納武單抗（Nivolumab）、伊匹木單抗（Ipilimumab）及奧法妥木單抗（Ofatumumab）等。

表2 主要的人源抗體轉基因動物平臺Tab.2 Major humanized antibody transgenic animal platforms

與鼠源單克隆抗體比較，通過抗體工程技術或人源抗體轉基因小鼠平臺開發(fā)的全人源抗體可顯著降低治療性抗體的免疫原性，從而推動抗體藥物的研發(fā)及應用，但實際臨床應用中，仍存在發(fā)生ADA的風險。

4.2去免疫化 免疫原性的主要驅動因素之一是治療性抗體中存在的人T 細胞表位［18］?？贵w藥物的T細胞表位在抗原遞呈細胞中暴露后，將與MHC 形成復合物，并提呈給Th 細胞，隨后激活一系列免疫反應，促進機體持續(xù)產(chǎn)生中和抗體，影響抗體藥物的治療效果［28］。MAZOR 等［29］研究證實，通過去除抗間皮素免疫毒素SS1P 中的人T 細胞表位而獲得的免疫毒素LMB-T20 在小鼠體內不會誘導ADA 的產(chǎn)生；ETTINGER 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，當凝血第八因子（FⅧ）中的免疫顯性表位DRB1*01：01 被去除后，F(xiàn)Ⅷ蛋白的免疫原性顯著降低且蛋白活性保持不變。因此，通過基因工程技術去除抗體序列中潛在的T細胞表位（即去免疫化）是降低治療性抗體免疫原性的一種有效方法。一般來說，抗體藥物首先經(jīng)過抗原表位檢測，通過人MHC 多樣性庫篩選后確定主要的T 細胞表位，并將這些T 細胞表位進行突變，從而降低或消除抗體藥物的免疫原性［18，31］。去免疫化的實質是阻斷抗原與抗體的識別，因此，也可通過聚乙二醇化、糖基化、還原甲基化及蛋白融合等技術屏蔽治療性抗體的免疫原性表位［32］，從而阻斷抗原與抗體的識別，進而改善藥物的免疫原性。

4.3制備納米抗體 1993年，HAMERS-CASTERMAN等［33］首次發(fā)現(xiàn)，在駱駝血清中大量存在著一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體，與傳統(tǒng)的IgG抗體不同，該重鏈抗體僅含有1個重鏈可變區(qū)和2個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)。通過分子生物學技術克隆并重組表達重鏈可變區(qū)，可獲得僅含有1條重鏈可變區(qū)的單域抗體，其相對分子質量僅有12 000～15 000，分子高度與直徑均為納米級，因此也被稱為納米抗體［13］。納米抗體的低免疫原性與其相對分子質量和分子結構密切相關。一方面，由于相對分子質量小，納米抗體在體內可被快速代謝，避免毒性的積聚；另一方面，納米抗體的VHH結構域與人抗體VH結構域具有高度同源性［34］，能夠有效避免機體免疫反應的發(fā)生。近年，納米抗體憑借免疫原性低、腫瘤組織滲透性強及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，在影像學診斷和疾病治療等領域受到越來越多的關注［35-36］。

5 治療性抗體免疫原性研究的適用動物模型

藥物候選分子在進入臨床試驗前，通常需要在動物體內進行安全性及有效性測試。隨著全人源抗體及其他形式藥物的出現(xiàn)，導致藥物候選分子在動物模型中具有較高的免疫原性，這可能會導致原本有潛力的候選分子在臨床前動物模型篩選階段得到不真實的藥效及毒性結果，如默克公司研發(fā)的雙功能融合蛋白Bintrafuspalfa（M7824）被證實在免疫功能正常的小鼠中能夠產(chǎn)生強烈的ADA，從而減弱該藥的抗腫瘤作用，但在B 細胞缺陷小鼠中其免疫原性能夠被避免，同時顯示M7824具有較好的抗腫瘤效果［37］。因此，開發(fā)能夠真實反映候選分子藥效，且不發(fā)生較高免疫原性的動物模型，對于新藥研發(fā)尤為重要。

B 細胞在抗體合成中發(fā)揮重要作用，通過清除小鼠體內的B 細胞以避免機體形成ADA，將有效促進藥物候選分子的篩選。目前主要可通過抗CD20／CD19抗體及Igh基因修飾兩種方式清除B細胞。

5.1抗CD20／CD19抗體清除B細胞 CD20、CD19是特異性表達在B細胞表面的重要抗原分子，抗CD20／CD19抗體通過抗體的可結晶片段參與抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用及補體依賴的細胞毒性作用等生物學效應，誘導B 細胞耗竭［38-39］。WATANABE 等［40］對肺移植（lung transplantation，LT）小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在使用CD20抗體清除小鼠體內的B細胞后，LT小鼠的缺血再灌注損傷后的慢性排斥反應（chronic rejection reaction，CR）及纖維化癥狀均得到改善。

5.2Igh 基因修飾 抗體清除B 細胞是目前構建B 細胞缺陷小鼠的常用方法之一，但該方法只能暫時、不徹底地耗竭B細胞［8］，且抗體半衰期短，需反復給藥，實驗成本較高。BCR 對于B 細胞的成熟和分化至關重要，其形成依賴于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的重排與組裝。在重排過程中，Ig 重鏈基因的組裝和表達先于輕鏈基因，即DH與JH基因片段連接，隨后VH與DJH 復合物重排。通過輕、重鏈的重排和組裝，BCR 可表達于B 細胞表面，介導B 細胞的發(fā)育及分化［41］。CHEN等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細胞（embryonal stem cell，ES）中通過基因靶向技術刪除JH基因片段后，由于DH至JH的重排中斷，導致Ig基因重排受阻，使B 細胞的分化停止于前B 細胞階段，從而阻斷了B 細胞進一步成熟和分化。LAN 等［37］借助此類小鼠模型，有效地避免了M7824免疫原性的干擾，同時顯示出M7824 具有較好的抗腫瘤活性。因此，通過基因編輯技術構建Igh基因修飾的B 細胞缺陷小鼠，可用于高免疫原性藥物候選分子的前期篩選及體內藥效評價研究。

6 小結與展望

治療性抗體的免疫原性不僅會影響藥物在臨床使用時的安全性和有效性，還可能干擾臨床前候選分子的篩選，導致原本具有應用價值的藥物被遺漏。藥物的免疫原性受宿主和藥物相互作用的影響，且免疫原性檢測的結果與檢測方法及檢測標準密切相關，因此藥物免疫原性評估仍面臨一定挑戰(zhàn)。加強對治療性抗體免疫原性的監(jiān)管，開發(fā)準確性高、適用性強的定量檢測技術，建立高效合理的藥效篩選動物模型及深入研究ADA 形成的分子機制等，不僅會在最大程度上減少免疫原性帶來的不利影響，還可在降低藥物研發(fā)成本及規(guī)避風險的同時，加快新藥研發(fā)進程，最終為患者提供更加安全有效的抗體治療藥物。