李妮，朱文勇，宋紹輝，馬磊，高菁霞，廖國陽，李衛(wèi)東

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

季節(jié)性流感每年在全球造成300 萬～500 萬人患嚴(yán)重呼吸道疾病，29萬～65萬例死亡［1］，控制和預(yù)防流感病毒感染十分重要［2］，而接種疫苗是最有效的預(yù)防方法［3］。目前，季節(jié)性流感疫苗主要有三價(jià)和四價(jià)流感疫苗［4］，大多采用雞胚進(jìn)行生產(chǎn)，疫苗成品中含有一定量雞胚來源的雜蛋白。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）是雞胚中含量最高的蛋白，具有強(qiáng)過敏原性。每年接種流感疫苗可能導(dǎo)致對OVA的免疫從而增加不良反應(yīng)，降低疫苗的耐受性［5］。長期以來，雞蛋過敏人群禁止接種流感疫苗，但最近的一項(xiàng)研究表明［6］，大多數(shù)雞蛋過敏的患者可以安全接種OVA含量低的疫苗。《中國藥典》三部（2015版）規(guī)定，流感病毒裂解疫苗中OVA含量應(yīng)不高于500 ng／mL［7］。

以往對OVA 進(jìn)行定量檢測常采用反向被動血凝反應(yīng)（reversed passive hemagglutination，RPHA）［8］、單向免疫擴(kuò)散（single-redial immunodiffusion，SRID）、常規(guī)免疫電泳［9］以及對流免疫電泳法［10］，這些方法操作繁瑣且耗時(shí)長，誤差較大，靈敏度低，不能準(zhǔn)確定量。與上述方法相比，德國OVA定量檢測試劑盒Serazym?Ovalbumin 操作簡便，靈敏度高，可快速準(zhǔn)確定量，也是國內(nèi)外雞胚流感疫苗生產(chǎn)中廣泛使用的檢測方法，但該進(jìn)口試劑盒價(jià)格高昂，檢測成本高，不適宜大規(guī)模推廣，因此，建立一種精確、簡便、高效、低成本及高靈敏度的檢測方法對于流感疫苗中OVA的定量檢測至關(guān)重要。本研究以兔抗OVA多克隆抗體作為包被抗體，建立雙抗體夾心ELISA 檢測法，并進(jìn)行優(yōu)化及驗(yàn)證，以用于雞胚流感疫苗中殘留OVA的檢測。

1 材料與方法

1.1OVA 參考品原料 雞OVA 參考品原料（純度≥98%）購自美國Sigma公司（貨號：A5503-1G），溶解稀釋后用德國SERAMUN 公司酶聯(lián)卵清蛋白檢測試劑盒Serazym?Ovalbumin標(biāo)定濃度后分裝凍存。

1.2病毒液、細(xì)胞上清液、抗原、疫苗及蛋清 HAV病毒液、Vero 細(xì)胞上清液、Vero 細(xì)胞培養(yǎng)流感H3N2 病毒液、肺炎支原體抗原、雞蛋蛋清、鴨蛋蛋清、鵪鶉蛋蛋清、雞胚培養(yǎng)流感H3N2單價(jià)原液、雞胚培養(yǎng)H3N2尿囊液、流感病毒裂解疫苗半成品、Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感H1N1病毒液和SARS-CoV-2滅活病毒液均由本所提供。

1.3主要儀器及試劑 兔抗OVA 多克隆抗體和HRP標(biāo)記的兔抗OVA 多克隆抗體購自美國Thermo 公司（貨號：PA1-196；PA1-196-HRP）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、OVA干粉和TMB單組分顯色液均購自北京索萊寶生物科技有限公司；酪蛋白、氨基吡啉、proclin 300、甘油、蔗糖、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、十二水和磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雞OVA 標(biāo)準(zhǔn)品分別購自美國Sigma 公司和中國Solarbio 公司；Tween-20購自美國Sigma公司；新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；2%脫脂奶粉、0.01 mol／L PBS 和98%濃硫酸均由本所提供；Serazym?Ovalbumin OVA 定量檢測試劑盒購自德國SERAMUN 診斷試劑有限公司；96 孔酶標(biāo)板購自美國Corning 公司；酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。

1.4OVA 定量參考品的制備 采用稱重法將OVA

參考品原料配制成1μg／mL的儲液，用OVA定量檢測試劑盒對該參考品濃度進(jìn)行驗(yàn)證后再分別稀釋至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313 ng／mL。

1.5雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立 將兔抗OVA多克隆抗體用包被緩沖液（0.01 mol／L PBS，pH 7.2）稀釋，按1μg／mL濃度包被酶標(biāo)板，100μL／孔，4 ℃過夜；PBST洗板3次，加入封閉液，250μL／孔，37 ℃孵育2 h；PBST洗板3次，加入稀釋至20 ng／mL的OVA標(biāo)準(zhǔn)品抗原、陰性對照（0.01 mol／L PBS）以及待檢樣品，100μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗OVA 多克隆抗體（用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋），100μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗板5次，加入TMB，100μL／孔，37 ℃避光顯色15 min；加入2 mol／L硫酸終止反應(yīng)，50μL／孔，用酶標(biāo)儀測定A450值。

1.6方法的優(yōu)化

1.6.1包被抗體及酶標(biāo)抗體濃度的確定 采用棋盤滴定法。將兔抗OVA 多克隆抗體用包被緩沖液稀釋至2、1、0.5、0.25μg／mL，加入酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜；PBST 洗板3次，用1%BSA 于37 ℃封閉2 h；PBST洗板3次，加入20 ng／mL OVA標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，0.01 mol／L PBS作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗OVA多克隆抗體（用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋至濃度為0.5、0.25、0.125μg／mL），37 ℃孵育1 h；其余步驟同1.5 項(xiàng)。選擇陽性對照檢測值（P）與陰性對照檢測值（N）的比值（P／N）最大時(shí)對應(yīng)的抗體濃度作為最適工作濃度。

1.6.2封閉液的確定 包被抗體及酶標(biāo)抗體均采用1.6.1項(xiàng)確定的最適濃度，于4 ℃包被過夜；分別用不同封閉液（PBS稀釋的1%BSA、2%BSA，1%BSA+1%蔗糖，2%BSA+2%蔗糖，以未封閉為對照）于37 ℃封閉2 h，每種條件設(shè)置2個(gè)重復(fù)。以20 ng／mL OVA標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，0.01 mol／L PBS作為陰性對照，選擇P／N最大時(shí)對應(yīng)的封閉液配方作為最適封閉液。

1.6.3判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 采用優(yōu)化后體系檢測0.01mol／L PBS（11 份）、2%脫脂奶粉（5 份）、Vero 細(xì)胞上清液（5份）、1%BSA（5份）、Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感H3N2病毒液（10 份）、Vero 細(xì)胞培養(yǎng)流感H1N1 病毒液（10 份）和新生牛血清（5 份）共51 份陰性樣本，在要求99%（單側(cè)）可信度條件下，以吸光度均值+3SD作為陽性判斷值［11］，計(jì)算Cut-off值，作為陰陽性樣本的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7方法的驗(yàn)證

1.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及檢測下限的確定 將OVA標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010 ng／mL，采用優(yōu)化的方法進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)5 次。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2），驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。根據(jù)1.6.3 項(xiàng)確定的Cut-off值判斷該體系的檢測下限。

1.7.2特異性 用建立的方法分別對8 份陰性樣本（HAV 病毒液、Vero 細(xì)胞上清液、Vero 細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒液、SARS-CoV-2 病毒液、肺炎支原體抗原、脫脂奶粉、0.01 mol／L PBS、2%BSA）和8份陽性樣本［雞蛋蛋清、鴨蛋蛋清、鵪鶉蛋蛋清、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2 單價(jià)原液、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2 尿囊收獲液、Sigma雞OVA標(biāo)準(zhǔn)品、Solarbio雞OVA標(biāo)準(zhǔn)品、SERAMUN 試劑盒OVA 標(biāo)準(zhǔn)品（20 ng／mL）］進(jìn)行檢測，根據(jù)1.6.3項(xiàng)確定的Cut-off值驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7.3重復(fù)性

1.7.3.1板內(nèi)重復(fù)性 隨機(jī)選取陰性和陽性樣本各5 份，并設(shè)空白對照組和陰性對照組（PBS），每份樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，于同一塊酶標(biāo)板上采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測，計(jì)算同一份樣本檢測結(jié)果的板內(nèi)變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證該方法的板內(nèi)重復(fù)性。

1.7.3.2板間重復(fù)性 取3塊酶標(biāo)板，采用優(yōu)化后的方法對1.7.3.1項(xiàng)中的樣本進(jìn)行檢測，計(jì)算同一份樣本檢測結(jié)果的板間CV，驗(yàn)證該方法的板間重復(fù)性。

1.7.4準(zhǔn)確度 隨機(jī)選取4個(gè)批次的流感病毒裂解疫苗半成品，分別采用優(yōu)化后的方法和SERAMUN OVA定量檢測試劑盒進(jìn)行檢測，比較建立的方法與試劑盒檢測結(jié)果的符合率，評價(jià)建立的方法檢測樣本的準(zhǔn)確度。

1.8數(shù)據(jù)采集與分析 采用GraphPad prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果

2.1參考品濃度標(biāo)定 用德國SERAMUN 公司OVA定量檢測試劑盒標(biāo)定配制的參考品濃度為（876 ±26）ng／mL，與德國SERAMUN 公司試劑盒符合率為85%～90.2%。

2.2方法的優(yōu)化

2.2.1最適包被抗體和酶標(biāo)抗體濃度 包被抗體濃度為1μg／mL，酶標(biāo)抗體濃度為0.25μg／mL時(shí)，P／N值最大，為81.943，見表1。因此選擇包被抗體及酶標(biāo)抗體最適工作濃度分別為1和0.25μg／mL。

表1 包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化結(jié)果Tab.1 Optimization of working concentration for coating and enzyme-labeled antibody

2.2.2最適封閉液 以2% BSA+2%蔗糖作為封閉液時(shí)，P／N 值較大，為94.409，見表2。因此選擇2%BSA+2%蔗糖作為最適封閉液配方。

表2 封閉液優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimization of blocking reagent

2.2.3判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 51 份陰性樣本檢測結(jié)果平均值為0.032 67，標(biāo)準(zhǔn)差為0.006 33，經(jīng)計(jì)算，Cut-off值為0.051 66。因此，檢測結(jié)果＞0.052時(shí)判為陽性，≤0.052則判為陰性。

2.3方法的驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及檢測下限 5 次試驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，OVA 濃度在5 ～0.313 ng／mL范圍內(nèi)，A450值與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系，且R2均大于0.97，重復(fù)性好，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果的變異系數(shù)（CV）均小于6%，見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。檢測下限為0.078 ng／mL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

表3 5次標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測結(jié)果（ng／mL）Tab.3 Results of standard curves in 5 tests（ng／mL）

2.3.2特異性采用優(yōu)化的方法檢出雞蛋蛋清、鴨蛋蛋清、鵪鶉蛋蛋清、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2 單價(jià)原液、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2 尿囊收獲液、Sigma 雞OVA 標(biāo)準(zhǔn)品、Solarbio 雞OVA 標(biāo)準(zhǔn)品、SERAMUN 試劑盒OVA 標(biāo)準(zhǔn)品（20 ng／mL）陽性樣本8 份，其余樣本檢測結(jié)果均為陰性，與已知背景相符。表明該方法特異性較好。

2.3.3重復(fù)性 用優(yōu)化后的方法檢測陰性和陽性樣本各5份的板內(nèi)CV在2.562%～13.887%之間，板間CV在4.000%～16.497%之間，見表4。表明該方法重復(fù)性較好。

表4 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（ng／mL）Tab.4 Verification for repeatability（ng／mL）

2.3.4準(zhǔn)確度 建立的方法與SERAMUN OVA 定量檢測試劑盒檢測4 個(gè)批次流感病毒裂解疫苗半成品結(jié)果的符合率在93.79% ～107.05%之間，見表5。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果Tab.5 Verification for accuracy

3 討論

流感仍是全球主要的公共衛(wèi)生問題。WHO估計(jì)，每年季節(jié)性流感導(dǎo)致的呼吸道疾病可致290 000 ～650 000 人死亡［12］。接種疫苗仍是預(yù)防流感的最佳手段。大多數(shù)國家目前仍以接種流感亞單位疫苗和裂解滅活病毒疫苗為主［13］，而多數(shù)流感疫苗采用雞胚生產(chǎn)，疫苗中OVA 的存在可導(dǎo)致嚴(yán)重過敏，因此，有效降低OVA 含量對于疫苗生產(chǎn)至關(guān)重要［14］。研究表明，OVA可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞侵入呼吸道，引起雌性BALB／c 小鼠脂質(zhì)過氧化從而導(dǎo)致DNA 損傷［15］，以及誘導(dǎo)細(xì)胞完整性損傷導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙［16］。因此，降低流感疫苗中的OVA 含量對于提高疫苗的耐受性至關(guān)重要。

由于蛋白質(zhì)不能像核酸一樣通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量一直面臨挑戰(zhàn)［17］，而傳統(tǒng)檢測OVA的方法操作復(fù)雜且靈敏度低，不適于疫苗中OVA 定量檢測。因此，本研究建立了一種雙抗體夾心ELISA方法快速對OVA 進(jìn)行定量檢測，與間接ELISA 方法相比，雙抗體夾心ELISA 方法減少了孵育及洗滌次數(shù)，可減少操作時(shí)間，增加樣品檢出率，另外，直接將HRP標(biāo)記兔抗OVA多克隆抗體，避免了抗抗體結(jié)合的非特異性；與競爭ELISA方法相比，雙抗體夾心ELISA方法結(jié)果判讀更直觀，且檢測靈敏度更高。因此，本研究以兔抗OVA 多克隆抗體作為包被抗體，利用ELISA 方法抗原抗體特異性結(jié)合的原理建立雙抗體夾心法對OVA 進(jìn)行定量檢測。以德國SERAMUN 試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定參考品主要是由于目前并無國際統(tǒng)一或指定的標(biāo)準(zhǔn)或檢測試劑盒來精確定量OVA 含量，而本實(shí)驗(yàn)中使用的試劑盒在國內(nèi)外均被廣泛應(yīng)用，以其作為標(biāo)準(zhǔn)可保持監(jiān)測數(shù)據(jù)與往年的延續(xù)［18］。以購自美國Sigma 公司的OVA 作為參考品原料，采用稱重法配制的參考品經(jīng)進(jìn)口試劑盒標(biāo)定后濃度基本相符，可采用該方法制備參考品，且操作簡便，通用性強(qiáng)。本研究建立的方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，檢測靈敏度高，且操作簡便，與進(jìn)口試劑盒相比，準(zhǔn)確度不低于進(jìn)口試劑盒，且極大地降低了成本。多次重復(fù)試驗(yàn)證明，該方法的線性范圍穩(wěn)定且重復(fù)性好，在5 ～0.313 ng／mL范圍內(nèi)可對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量，有望在雞胚流感疫苗生產(chǎn)中用于OVA含量測定。

隨著對納米材料研究的深入，金納米顆粒在輔助免疫PCR 開發(fā)診斷試劑，如檢測試紙等［19-20］，以及在ELISA 檢測包括骨橋蛋白［21］、克羅諾桿菌［22］、萊克多巴胺［23］等生物標(biāo)志物和作為增強(qiáng)劑輔助PCR［24］等方面均發(fā)揮著重要作用，并可顯著提高反應(yīng)效率及增強(qiáng)檢測分析的靈敏度和特異性，引入金納米顆?；蚩砷_發(fā)出靈敏度和特異性更高的OVA定量檢測方法。