林春鳳，熊清，寧瀟雨，洪文謙，林凡，張玉琴，鄭海音*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和膽汁淤積性肝病等病變長(zhǎng)期慢性刺激肝臟，引起損傷和修復(fù)反應(yīng)失調(diào)，使細(xì)胞外基質(zhì)的合成大于降解，沉積異常，最終改變肝臟結(jié)構(gòu)和/或功能［1］。肝纖維化會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致為肝硬化，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致肝癌和肝衰竭等。針對(duì)肝纖維化的有效治療可以預(yù)防和延緩其向肝硬化進(jìn)展，但是由于早期抗病毒治療效果較差、抗炎時(shí)間長(zhǎng)及戒酒難度大，晚期肝移植的供體來(lái)源困難及術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)等原因，臨床上亟須更有效的防治手段［2］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）是主要由三七、麝香、牛黃和蛇膽等組成的中成藥，具有解毒清熱、消腫散結(jié)、活血化瘀的作用，臨床上可用于抗炎［3］、抗自身免疫性疾?。?-5］、抗腦損傷［6］、保肝［7］、抗肝纖維化［8］及抗腫瘤［9-11］等。片仔癀的臨床研究已取得較大進(jìn)展，但其抗肝纖維化的藥理作用機(jī)制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在藥物、靶點(diǎn)以及疾病之間相互作用關(guān)系網(wǎng)基礎(chǔ)之上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體上去探索中藥的基本特征，觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響以及藥物之間的相互作用關(guān)系［12］，其在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨成熟。本研究在片仔癀前期工作的基礎(chǔ)上［8，13-14］，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探究片仔癀治療肝纖維化的作用靶點(diǎn)及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（http：//bidd.group/TCMID/）、Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中國(guó)知網(wǎng)（https：//www.cnki.net）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)片仔癀組方主要藥物三七、牛黃、蛇膽、麝香進(jìn)行活性成分檢索。通過(guò)口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）進(jìn)行篩選，選取同時(shí)滿足OB≥30%、DL≥0.18的化學(xué)成分作為候選活性成分，導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)基因名稱，獲得片仔癀活性成分的潛在靶點(diǎn)。將篩選出的活性成分及對(duì)應(yīng)潛在靶點(diǎn)上傳至Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 肝纖維化疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 以“l(fā)iver fibrosis”、“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)目。

1.3 片仔癀-肝纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 將片仔癀靶點(diǎn)與肝纖維化交集得到共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。隨后將共同靶點(diǎn)在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）中構(gòu)建PPI（Protein-Protein Interaction Networks）網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析獲得核心靶點(diǎn)。

1.4 GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析 將篩選得到的靶點(diǎn)，通過(guò)BioMart（http：//www.biomart.org）轉(zhuǎn)換成Gene Stable ID，再利用OmicShare（https：//www.omicshare.com）平臺(tái)進(jìn)行GO和KEGG動(dòng)態(tài)富集分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：FJTCM-IACUC-2022019）。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，貨號(hào)：Z35020243）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C009-2-1、C010-2-1）；EGFR一抗（英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab52894）；JAK1一抗（英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab133666）；STAT3一抗（美國(guó)CST公司，批號(hào)：D3Z2G）；p-JAK1一抗（美國(guó)CST公司，批號(hào)：D7N4Z）；p-STAT3一抗（英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab76315）；GAPDH一抗（美國(guó)CST公司，批號(hào)：D16H11）。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)儀器 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：5417R）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)：ECLIPSE511）；化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Universal Hood）；酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司，型號(hào)：352型）；石蠟包埋機(jī)（中國(guó)亞光醫(yī)用公司，型號(hào)YB-7LF）。

1.5.4 造模、給藥及取材 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、模型組和片仔癀組，每組8只。除正常對(duì)照組外，余均予CCl4∶花生油（1∶9）溶液5 mL/kg腹腔注射誘導(dǎo)HF模型［14］，每周2次，連續(xù)給藥4周，以肝組織病理形態(tài)具有炎癥浸潤(rùn)及纖維化特點(diǎn)為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。片仔癀溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成0.023 4 g/mL溶液。在造模同時(shí)，片仔癀干預(yù)組每日以0.234 g/kg片仔癀藥液灌胃。除正常對(duì)照組外，均予高脂飼料。取材前，每只小鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.5 mL/kg）麻醉后摘眼球取血，隨后取出肝臟，稱取肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)。

肝指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.5.5 肝組織HE染色及Masson染色 各小鼠肝大葉，切成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟至水，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色（操作步驟按試劑說(shuō)明書(shū)），中性樹(shù)膠封固鏡檢。

1.5.6 指標(biāo)檢測(cè) 用高速離心機(jī)離心后取上清即為血清，用ALT、AST檢測(cè)試劑盒參照使用手冊(cè)進(jìn)行測(cè)定。取小鼠肝組織，液氮研磨后加入裂解液，冰上靜置30 min，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，測(cè)定濃度后，4∶1加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min后，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST清洗3次×5 min，孵育一抗［EGFR（1∶1 000）；JAK1（1∶1 000）；STAT3（1∶1 000）；p-JAK1（1∶1 000）；p-STAT3（1∶1 000）；GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃搖床過(guò)夜；TBST清洗，孵育二抗（1∶10 000）1 h，TBST清洗，顯影液1∶1配置后顯影。

1.5.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 片仔癀的活性成分與藥物靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選，獲得片仔癀的有效化學(xué)成分共31種，刪去重復(fù)項(xiàng)后共24種，見(jiàn)表1。根據(jù)度值和中介中心性排序獲得主要活性成分有槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇等。篩選出片仔癀活性成分的不重復(fù)作用靶點(diǎn)共有217個(gè)。將中藥、化合物和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得片仔癀藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖1。

圖1 片仔癀藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 片仔癀主要化學(xué)成分表

2.2 藥物-疾病的共同靶點(diǎn) 通過(guò)GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)7 043個(gè)。將片仔癀的靶點(diǎn)與肝纖維化的靶點(diǎn)做韋恩圖取交集，得到共同靶點(diǎn)196個(gè)，即片仔癀治療肝纖維的潛在靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 片仔癀靶點(diǎn)和肝纖維化靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)分析 經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取片仔癀治療肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)的互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件分析篩選核心靶點(diǎn)。其中以中介中心性和度值聯(lián)合篩選出排名前20位的核心靶點(diǎn)分別為：Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL-1β、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3、HIF1A、MMP9、EGF、PPARG、FOS、CXCL8和CCND1。見(jiàn)圖3。

圖3 片仔癀治療肝纖維化的核心靶點(diǎn)

2.4 核心靶點(diǎn)GO和KEGG通路富集分析 對(duì)片仔癀-肝纖維化的196個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到7 651個(gè)條目，其中生物過(guò)程（BP）6 206條，細(xì)胞組成（CC）537條，分子功能（MF）908條，取各前10個(gè)條目。圖中藍(lán)色代表生物過(guò)程，橙色代表分子功能、綠色代表細(xì)胞組分，其中免疫系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞增殖、抗氧化活性與肝纖維化有關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 片仔癀治療肝纖維化靶點(diǎn)的GO富集分析

經(jīng)Omicshare網(wǎng)站進(jìn)行KEGG通路分析，獲得片仔癀-肝纖維化兩者共關(guān)聯(lián)信號(hào)通路175條（P＜0.05）。主要涉及到癌癥、糖代謝、乙型肝炎、細(xì)胞因子（TNF、IL-17）等信號(hào)通路，其中片仔癀治療肝纖維化的核心靶點(diǎn)中表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）均富集在癌癥信號(hào)通路上。見(jiàn)圖5。

圖5 片仔癀治療肝纖維化靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.5 3組小鼠肝組織形態(tài)比較 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組小鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，表面光滑；模型組小鼠肝臟略顯黃褐色，表面粗糙有顆粒感；片仔癀組小鼠與模型組相比，表面光滑，顏色較紅潤(rùn)。

病理組織切片HE染色結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)正常；模型組小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重水腫，胞漿疏松淡染，以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織大量增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；片仔癀組肝細(xì)胞脂肪變性明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

Masson染色結(jié)果顯示：模型組肝組織內(nèi)膠原纖維比正常對(duì)照組明顯增多（藍(lán)色區(qū)域），肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；片仔癀組小鼠肝纖維化程度明顯減輕。見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠肝及組織形態(tài)（HE染色、Masson染色，×200）

2.6 3組小鼠肝指數(shù)的影響 見(jiàn)圖7。

圖7 3組小鼠肝指數(shù)比較

2.7 3組小鼠血清ALT、AST的含量比較 見(jiàn)圖8。

圖8 3組小鼠血清ALT、AST含量比較

2.8 3組小鼠肝組織EGFR、JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3蛋白量表達(dá)的影響 見(jiàn)圖9。

圖9 3組小鼠肝組織EGFR、JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

肝纖維化表現(xiàn)出乏力納差、惡心嘔吐、腹脹不適、脅肋部隱痛等癥狀，該病歸屬為“肝積”“鼓脹”“黃疸”等［15］。大多數(shù)醫(yī)家均認(rèn)為由濕熱疫毒之邪侵?jǐn)_機(jī)體，正邪交爭(zhēng)而損傷機(jī)體，從而導(dǎo)致血瘀痰毒蘊(yùn)結(jié)，臟腑氣血陰陽(yáng)失調(diào)而發(fā)?。?6］。病位涉及肝、脾、腎三臟，可影響到氣、血、水的運(yùn)行。因此治療上需清熱解毒、活血化瘀［17］。片仔癀是主要由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、扶正祛邪的功效，其組方配伍與肝纖維化中醫(yī)辨證論治中清熱、化瘀、散結(jié)等治法相吻合。臨床上可用于多種原因所致急慢性肝炎、肝損傷等疾患。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，片仔癀抗肝纖維的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能為Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL1B、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3等。進(jìn)而通過(guò)GO、KEGG通路富集分析顯示，主要調(diào)控的信號(hào)通路有癌癥、糖代謝、乙型肝炎、TNF、IL-17等信號(hào)通路。其中，片仔癀與肝纖維化的核心靶點(diǎn)EGFR、STAT3富集在EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)軸上。

癌癥信號(hào)通路中的EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)軸參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等很多重要生物學(xué)過(guò)程。EGFR近膜端有能與非受體型酪氨酸蛋白激酶（JAKs）相互作用的區(qū)域，而其遠(yuǎn)膜端能被活化的JAK磷酸化。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化在控制JAK/STAT通路中起核心作用。此類受體是借助JAKs激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和STAT而最終作用于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，活化的EGFR可激活JAK/STAT信號(hào)發(fā)揮作用［18］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ和IL-6等炎癥因子可促進(jìn)JAK/STAT信號(hào)激活，進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)控功能。IL-6是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要炎癥介質(zhì)，IL-6結(jié)合受體后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活，最終調(diào)控炎癥反應(yīng)［19-20］。

肝纖維化是肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程，是慢性肝臟疾病向肝硬化甚至肝癌等病變的起因［21］。片仔癀臨床上可用于多種原因所致急慢性肝炎、肝損傷等疾患［22-23］。ALT、AST是反映肝臟正常代謝功能的重要生化指標(biāo)，當(dāng)肝臟受損時(shí)，ALT及AST含量將升高。與正常對(duì)照組比，模型組小鼠血液中ALT、AST含量升高，表明模型組小鼠的肝功能受損；經(jīng)片仔癀治療后，這2種指標(biāo)的含量均明顯降低，表示肝臟功能有明顯恢復(fù)。HE染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟病理切片出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)胞水腫和炎癥，纖維結(jié)締組織增生，相比模型組，片仔癀干預(yù)后均明顯減少；Masson染色結(jié)果顯示，模型組肝組織內(nèi)膠原纖維明顯比正常對(duì)照組增多，而片仔癀干預(yù)后肝纖維化程度明顯減輕。已有各種證據(jù)表明，JAK1/STAT3信號(hào)通路密切參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路，可抑制肝星狀細(xì)胞的活化和促進(jìn)其凋亡，從而起到抑制肝纖維化的作用［23-24］。本研究結(jié)果表明，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組，EGFR、JAK1和STAT3這3個(gè)蛋白水平表達(dá)均比正常對(duì)照組明顯升高，且JAK1和STAT3磷酸化水平升高；片仔癀干預(yù)組可明顯下調(diào)以上3種關(guān)鍵蛋白。提示經(jīng)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)展可能與EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)軸的激活有關(guān)，片仔癀能夠明顯減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化狀態(tài)，其抗肝纖維化作用機(jī)制可能與EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)軸有關(guān)。

綜上所述，片仔癀可以明顯降低肝損傷指標(biāo)的血清含量，改善肝臟纖維化的病理改變，并通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)軸起到抑制肝纖維化進(jìn)程的作用。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，闡述了片仔癀治療肝纖維化的相關(guān)機(jī)制，并進(jìn)行了一定的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這為該方治療肝纖維化的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持，可為后續(xù)深入研究提供線索。今后實(shí)驗(yàn)可應(yīng)用片仔癀作用于有關(guān)肝纖維化的細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞等的體外實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探索其機(jī)制。