張翌，吳志英

綜 述

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病的發(fā)病機(jī)制及治療研究進(jìn)展

張翌，吳志英

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，醫(yī)學(xué)遺傳科/罕見(jiàn)病診治中心，杭州 310009

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL)是成人最常見(jiàn)的遺傳性腦小血管病。自CADASIL的致病基因被鑒定以來(lái)，大量CADASIL病例被報(bào)道，但迄今仍缺乏有效的治療藥物。本文針對(duì)CADASIL的疾病模型和致病機(jī)制、對(duì)癥藥物治療及潛在治療方案研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)CADASIL發(fā)病機(jī)制和治療研究提供參考。

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈??；發(fā)病機(jī)制；治療進(jìn)展

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebral autosomal dominant arterio-pathy with subcortical infarcts and leukoencephalo-pathy，CADASIL)是成人最常見(jiàn)的遺傳性腦小血管病。目前CADASIL流行病學(xué)資料仍不完善，既往研究結(jié)果顯示其發(fā)病率至少為2/100,000～ 5/100,000[1]，男女發(fā)病無(wú)差異?；颊叨嘣?0～60歲發(fā)病，典型癥狀包括先兆性偏頭痛、短暫性腦缺血或缺血性卒中反復(fù)發(fā)作、認(rèn)知障礙及精神行為異常等[2]。其臨床表型在不同人種中存在異質(zhì)性，中國(guó)CADASIL患者通常在40歲后發(fā)病[3]，偏頭痛較為少見(jiàn)，而缺血性卒中發(fā)生率較高[4]。CADASIL患者可見(jiàn)典型的顱內(nèi)慢性小動(dòng)脈病變，例如彌漫性脫髓鞘和腔隙性梗死；鏡下可見(jiàn)小穿支動(dòng)脈和軟腦膜動(dòng)脈病變，表現(xiàn)為動(dòng)脈壁增厚所致的管腔狹窄和血管平滑肌的形態(tài)學(xué)變化等[2]。1993年，CADASIL致病基因被定位于人類19號(hào)染色體[5]。1996年，Joutel等[6]確認(rèn)為CADASIL的致病基因，成為診斷CADASIL的金標(biāo)準(zhǔn)。目前已有超過(guò)400種基因突變?cè)诓煌N族人群中被報(bào)道[3,4,7～9]。這些突變導(dǎo)致Notch3蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊，使細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在腦血管的平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞(統(tǒng)稱為壁細(xì)胞)上發(fā)生聚集，部分Notch3的配體以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白也會(huì)聚集在這些沉積物中，稱之為嗜鋨顆粒物質(zhì)(granular osmiophilic material，GOM)，這是CADASIL最重要的病理特征[10,11]。但迄今為止，仍未找到針對(duì)CADASIL病因或發(fā)病機(jī)制進(jìn)行干預(yù)的疾病修飾治療(disease modification therapy，DMT)藥物或方法。近年來(lái)，有關(guān)CADASIL的發(fā)病機(jī)制和治療研究取得了較大進(jìn)展。為此，本文針對(duì)CADASIL的疾病模型和致病機(jī)制、對(duì)癥藥物治療及潛在治療方案研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CADASIL的發(fā)病機(jī)制和疾病模型

1.1 NOTCH3基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能

基因由33個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)由2321個(gè)氨基酸組成的單次跨膜受體。該受體包含一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域、3個(gè)Notch/Lin12重復(fù)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由基因的2～24號(hào)外顯子編碼，包含34個(gè)上皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列(epidermal growth factor-like repeats，EGFR)。每個(gè)EGFR含有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3對(duì)二硫鍵以穩(wěn)定該受體的結(jié)構(gòu)。目前報(bào)道的絕大多數(shù)CADASIL患者的致病變異位于34個(gè)EGFR序列上，且涉及半胱氨酸個(gè)數(shù)的改變，使單個(gè)EGFR內(nèi)的半胱氨酸殘基個(gè)數(shù)由偶數(shù)變?yōu)槠鏀?shù)，即由正常的6個(gè)變?yōu)?個(gè)或5個(gè)，導(dǎo)致Notch3結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[2]。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列。

Notch3蛋白主要在血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞上表達(dá)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體進(jìn)行糖基化修飾并進(jìn)行S1剪切，最終定位于細(xì)胞膜表面。與其他NOTCH家族成員類似，Notch3在NOTCH信號(hào)通路中發(fā)揮作用。如圖1所示，與配體Jagged或Delta結(jié)合后，Notch3將發(fā)生S2和S3剪切，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被切割并進(jìn)入細(xì)胞核中，與CSL(core binding factor 1/suppresor of hairless/longevity assurance gene 1)和MAM(mastermind)共同形成轉(zhuǎn)錄激活因子復(fù)合物，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，并參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的成熟和分化[12]。

1.2 發(fā)病機(jī)制

目前CADASIL的發(fā)病機(jī)制仍未明晰，利用動(dòng)物模型進(jìn)行的研究結(jié)果提示，突變導(dǎo)致其編碼蛋白Notch3的異常是CADASIL發(fā)病的主要原因，主要表現(xiàn)為Notch3蛋白的聚集和NOTCH信號(hào)通路的異常，并且對(duì)血管平滑肌及血管神經(jīng)單元的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了影響。

1.2.1 Notch3蛋白聚集

發(fā)生在Notch3 EGFR區(qū)域內(nèi)半胱氨酸突變可使二硫鍵產(chǎn)生錯(cuò)配，導(dǎo)致Notch3蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊，其胞外結(jié)構(gòu)域在腦血管的平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞內(nèi)發(fā)生聚集，形成GOM顆粒，可在電鏡下被觀察到。部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與Notch3共同定位于GOM顆粒中，包括組織金屬蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3，TIMP-3)、玻連蛋白、內(nèi)皮抑素等[13]。突變的Notch3在細(xì)胞中的清除時(shí)間延長(zhǎng)，這可能與突變導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞自噬體和溶酶體融合缺陷有關(guān)，Notch3不能被正常清除從而發(fā)生聚集與沉積。隨著病程發(fā)展，這些聚集物的毒性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[14]。

盡管目前已知Notch3突變蛋白聚集物形成GOM顆粒與CADASIL發(fā)病密切相關(guān)，但聚集物中的蛋白是如何相互作用并引起細(xì)胞毒性的機(jī)制仍不清楚。此外，目前也沒(méi)有直接證據(jù)表明GOM顆粒數(shù)量與臨床表型的嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，對(duì)Notch3突變蛋白聚集物仍需進(jìn)一步研究。

圖1 Notch3信號(hào)通路

經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯得到的Notch3蛋白進(jìn)入高爾基體，發(fā)生糖基化修飾并被Furin進(jìn)行S1剪切。成熟的Notch3蛋白接著被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上，鄰近細(xì)胞膜上的配體Delta或Jagged能夠結(jié)合并激活Notch3信號(hào)通路。配體與受體的結(jié)合使得Notch3上的S2位點(diǎn)暴露出來(lái)，解整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)隨之進(jìn)行S2剪切，產(chǎn)生的片段繼續(xù)被γ-分泌酶進(jìn)行S3剪切，去除跨膜結(jié)構(gòu)域并釋放胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核與CSL和MAM共同形成轉(zhuǎn)錄激活因子復(fù)合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 NOTCH信號(hào)通路異常

利用小鼠模型進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，一般的突變并不會(huì)影響Notch3蛋白與配體的結(jié)合以及S2和S3剪切[15]。但位于Notch3配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的突變?nèi)鏑428S和C455R則會(huì)嚴(yán)重影響NOTCH信號(hào)通路。例如，在敲除小鼠模型中，表達(dá)正常人源Notch3蛋白能夠減少血管壁細(xì)胞的損失、挽救小鼠的卒中表型，但表達(dá)Notch3 C455R蛋白則無(wú)法挽救這些表型[16]。這些結(jié)果說(shuō)明突變是否會(huì)導(dǎo)致Notch3蛋白與配體的結(jié)合出現(xiàn)障礙與突變所在的EGFR區(qū)域有關(guān)。

最近的研究表明，在CADASIL患者來(lái)源的原代或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induce pluripotent stem cells，iPSCs)分化得到的血管平滑肌細(xì)胞中，NOTCH通路靶基因上調(diào)，提示了NOTCH通路活性的增強(qiáng)[17]?？紤]到非配體結(jié)合區(qū)域的突變并不影響下游通路，對(duì)于大多數(shù)突變而言，通路活性的上調(diào)可能才是CADASIL的發(fā)病機(jī)制之一。

1.2.3 血管平滑肌離子通道異常

研究發(fā)現(xiàn)，TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠腦實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的鉀離子電壓門控通道數(shù)量(KV)增加了約60%。因此在40 mmHg生理壓力下，小鼠血管平滑肌細(xì)胞的去極化程度減小，收縮能力即肌源性緊張度(myogenic tone)減弱。而在使用了KV1通道抑制劑4-氨基吡啶(4-aminopyridine)或表皮生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑肝素結(jié)合EGF(heparin binding epidermal growth factor，HB-EGF)后，能夠降低KV電流密度，從而在一定程度上恢復(fù)血管平滑肌的肌源性自身調(diào)節(jié)能力(myogenic response)[18]。此外，在TgNotch3R90C和TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠中，電生理結(jié)果顯示梗死灶周圍擴(kuò)散性去極化頻率增加，擴(kuò)散性去極化時(shí)細(xì)胞外鉀離子濃度升高[19]，這提示了細(xì)胞外鉀離子穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)異?？赡芘c離子通道也存在一定相關(guān)性。

進(jìn)一步研究認(rèn)為，KV數(shù)量的增加與GOM顆粒的形成相關(guān)。由于TIMP3在GOM中的沉積抑制了ADAM17，上調(diào)了電壓門控鉀離子通道的表達(dá)量，從而破壞了腦血管反應(yīng)性(cerebrovascular reactivity)和肌源性緊張度。在過(guò)表達(dá)人源TIMP3的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，也觀察到了類似CADASIL小鼠模型中出現(xiàn)的腦血管流量和肌源性自身調(diào)節(jié)的變化[20]。以上結(jié)果提示在CADASIL中，鉀離子通道的異?？赡苤苯佑绊懷芷交〉氖湛s，從而影響了血管的功能。但目前對(duì)于鉀離子通道及其他離子通道的研究尚缺乏，仍需未來(lái)進(jìn)一步探索。

1.2.4 血管平滑肌細(xì)胞骨架和增殖能力改變

血管平滑肌的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)能夠協(xié)調(diào)血管的收縮和舒張，異常的細(xì)胞骨架可能與CADASIL患者血管反應(yīng)性下降有關(guān)。在患者來(lái)源的iPSC分化得到的血管平滑肌細(xì)胞中，觀察到了細(xì)胞骨架的異常，表現(xiàn)為平行微絲聚集增多、不規(guī)則分布[17,21]。小鼠模型提示NOTCH信號(hào)通路的上調(diào)進(jìn)一步導(dǎo)致RhoA/Rho激酶通路蛋白活性升高，考慮到該蛋白在調(diào)控細(xì)胞骨架中發(fā)揮的作用，這可能是CADASIL血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞骨架異常的原因之一[22]。

目前對(duì)于CADASIL患者血管平滑肌的增殖能力改變?nèi)詿o(wú)定論。2018年有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自CADASIL患者臍帶、胎盤和大腦血管系統(tǒng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖率低于對(duì)照組，患者細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達(dá)的增加與血管平滑肌細(xì)胞增殖率的下降有關(guān)，添加TGF-β中和抗體后，血管平滑肌細(xì)胞增殖率顯著上升[23]。但后續(xù)研究結(jié)果顯示，患者來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞和iPSC分化得到的血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)[17,22]，因此需后續(xù)研究來(lái)獲得確切的結(jié)論。

1.2.5 血管神經(jīng)單元結(jié)構(gòu)和功能障礙

基因突變影響了周細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等血管神經(jīng)單元(neurovascular unit，NVU)的正常結(jié)構(gòu)和功能。Notch3突變體對(duì)周細(xì)胞產(chǎn)生的影響與血管平滑肌細(xì)胞類似。隨著TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠年齡增長(zhǎng)，其周細(xì)胞表面逐漸出現(xiàn)Notch3聚集，最終導(dǎo)致周細(xì)胞數(shù)量顯著減少，對(duì)毛細(xì)血管的覆蓋率降低[24]。

在患者來(lái)源iPSC分化得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞中并未觀察到CADASIL疾病相關(guān)表型[17]，但將患者來(lái)源的原代血管平滑肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力下降，這可能與TGF-β表達(dá)量上升有關(guān)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜離子通道失活也與CADASIL發(fā)病相關(guān)。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1能夠感知神經(jīng)元活動(dòng)并且傳播電信號(hào)，使得上游小動(dòng)脈擴(kuò)張并向活躍腦區(qū)供血，稱為功能性充血。而在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠中，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)的減少導(dǎo)致Kir2.1通道活性降低，進(jìn)而使得小鼠腦部功能性充血受阻，而全身注射可溶性PIP2則能夠迅速恢復(fù)小鼠的功能性充血[25]。在該小鼠模型中，還觀察到了內(nèi)皮細(xì)胞黏連蛋白表達(dá)減少、血漿蛋白滲漏等改變[24]。

對(duì)CADASIL患者腦組織切片的免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，且這些星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)腫脹和空泡化、遠(yuǎn)端突起的解體和近端突起的碎裂等病理特征，一些自噬標(biāo)記物如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein1 light chain 3，MAP1LC3)和p62也定位于這些星形膠質(zhì)細(xì)胞中，提示其正在經(jīng)歷自噬性死亡過(guò)程[26]。在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，也觀察到了腦微血管星形膠質(zhì)細(xì)胞終足覆蓋率降低的現(xiàn)象[24]。

1.3 疾病模型

1.3.1 細(xì)胞模型

研究人員最初使用CADASIL患者的原代細(xì)胞，例如平滑肌細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨著iPSC技術(shù)的進(jìn)展，研究人員已成功將CADASIL患者來(lái)源的外周血單核細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成iPSC，并進(jìn)一步分化形成血管平滑肌細(xì)胞。例如，來(lái)源于攜帶R1076C突變患者的皮膚成纖維細(xì)胞分化得到的血管平滑肌細(xì)胞，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)和功能異常，包括細(xì)胞增殖增加、平行微絲聚集成束。此外，該細(xì)胞模型還出現(xiàn)了NOTCH信號(hào)通路的上調(diào)和NF-κB信號(hào)通路的激活，提示炎癥反應(yīng)在CADASIL發(fā)病中具有一定作用[17]。另一項(xiàng)研究在R153C和C224T突變的iPSC及分化得到的壁細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β (platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ)表達(dá)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌減少，這可能與毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受損有關(guān)[27]。此后的研究在攜帶C106R、R141C、R182C突變患者來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞中觀察到了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集和細(xì)胞骨架的異常，但周細(xì)胞的標(biāo)志物PDGFRβ的表達(dá)水平高于對(duì)照組，不同于之前的結(jié)果，這可能與采用不同的細(xì)胞分化方案有關(guān)。此外，還觀察到細(xì)胞的遷移速度明顯增加，但細(xì)胞的增殖率在不同樣本間存在較大差異[21]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明細(xì)胞模型能夠?yàn)檠芯緾ADASIL的發(fā)病機(jī)制提供一些有益的幫助，但由于體外模型的不穩(wěn)定性，仍需要借助體內(nèi)模型來(lái)得到最終的結(jié)論。

1.3.2 動(dòng)物模型

近年來(lái)，為了闡明CADASIL致病機(jī)制并探討治療方案，研究人員建立了斑馬魚()、小鼠()等動(dòng)物模型(表1)。攜帶突變的斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型出現(xiàn)動(dòng)脈壁的損傷和Notch3下游基因表達(dá)的改變，這對(duì)于研究Notch3在血管發(fā)育中的作用有一定價(jià)值，但該模型并不能完全模擬CADASIL的表型，因此還需要其他模型的支持[28]。目前應(yīng)用最廣的是TgNotch3R90C和TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠模型，這兩種突變均為CADASIL患者的高頻突變，分別位于基因的3號(hào)和4號(hào)外顯子上[3]。

TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠是通過(guò)顯微注射線性化的cDNA片段構(gòu)建的，cDNA片段由平滑肌特異性啟動(dòng)子SM22α和人源R90C cDNA組成，因此可在血管平滑肌細(xì)胞中特異性表達(dá)突變的Notch3蛋白。該小鼠產(chǎn)生了血管平滑肌的退化，包括細(xì)胞骨架的改變、細(xì)胞外基質(zhì)錨定異常等表型，且這些變化在胞外結(jié)構(gòu)域沉積形成GOM顆粒之前即已發(fā)生[31]。血管平滑肌細(xì)胞的退化導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了腦血管反應(yīng)性損傷、線粒體損傷、自噬減弱等表型[37]。但是Notch3 R90C的蛋白活性沒(méi)有明顯變化，突變的受體仍然能夠與配體結(jié)合并啟動(dòng)下游信號(hào)通路[32]。這提示CADASIL的發(fā)病機(jī)制可能并不涉及信號(hào)通路的破壞，而是與突變蛋白的功能獲得(gain of function)相關(guān)。

表1 CADASIL動(dòng)物模型

TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠同樣通過(guò)顯微注射構(gòu)建，cDNA片段來(lái)源于從文庫(kù)中篩選得到的包含大鼠基因的克隆，通過(guò)PCR引入R169C點(diǎn)突變，再將其酶切為線性化片段，用于顯微注射。與TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠一樣，在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠的血管平滑肌細(xì)胞中也觀察到了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集體及形成的GOM顆粒，且更早出現(xiàn)。此外，還觀察到小鼠腦部的白質(zhì)損傷，在損傷區(qū)域和非損傷區(qū)域均出現(xiàn)了低灌注現(xiàn)象，這提示低灌注可能參與白質(zhì)損傷的過(guò)程[33]。因此，該模型已被廣泛用于研究CADASIL機(jī)制和治療。利用該模型，研究者已證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和RhoA/Rho激酶在CADASIL發(fā)病中的重要作用，通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物能夠挽救血管功能障礙[22]。由于該小鼠尚未出現(xiàn)腦梗死等表型，該模型可用來(lái)模擬CADASIL患者早期階段的表現(xiàn)。

除了以上兩種常用的小鼠模型，研究者還建立了其他CADASIL小鼠模型。例如，TgNotch3C428S和TgNotch3C455R轉(zhuǎn)基因小鼠所帶的突變位于Notch3的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，直接影響了蛋白正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這兩種小鼠均出現(xiàn)了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集和血管平滑肌的退化[35,36]；TgNotch3R182C和TgNotch3R1031C轉(zhuǎn)基因小鼠亦表現(xiàn)出CADASIL的典型病理特征，包括Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集體和GOM顆粒形成，除此之外，在TgNotch3R1031C轉(zhuǎn)基因小鼠中還觀察了到簇集素(clusterin)和內(nèi)皮抑素的聚集[34,36]。敲除小鼠盡管無(wú)明顯CADASIL表型，亦未觀察到血管中GOM顆粒的形成，但的敲除會(huì)影響血管的分化，包括血管平滑肌細(xì)胞的減少、血腦屏障滲漏、腦血管反應(yīng)性和肌源性緊張度的改變等，增加了小鼠發(fā)生缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)，這也為Notch3在腦血管成熟和穩(wěn)態(tài)中起重要作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[29,30]。

2 CADASIL的藥物治療

目前仍缺乏對(duì)CADASIL的特效治療藥物，其治療以對(duì)癥治療為主，同時(shí)輔以必要的預(yù)防措施[38]。

缺血性卒中的治療可依據(jù)常規(guī)的治療方案進(jìn)行?？寡“逅幬锟梢杂糜诜磸?fù)發(fā)生卒中的患者，但當(dāng)患者腦部已有大量微出血時(shí)，應(yīng)慎重選擇抗血小板藥物或抗凝藥物以免加重腦出血現(xiàn)象。鹽酸洛美嗪是治療偏頭痛的藥物，但2020年的一項(xiàng)研究結(jié)果提示該藥還能有效預(yù)防繼發(fā)性卒中[39]。除此之外，靜脈注射組織型纖溶酶原激活劑(intravenous tissue plasminogen activator，IV tPA)也被嘗試用于治療CADASIL患者急性卒中發(fā)作，但因有證據(jù)表明該藥增加了CADASIL患者腦出血的風(fēng)險(xiǎn)，其安全性仍存在爭(zhēng)議[40]。

CADASIL患者偏頭痛的治療與一般偏頭痛一致，乙酰唑胺對(duì)偏頭痛有一定療效，但應(yīng)盡量避免使用曲普坦類和麥角類血管收縮性藥物。

常規(guī)治療認(rèn)知損傷的藥物目前也被用于治療CADASIL患者的認(rèn)知障礙，但研究表明多奈哌齊對(duì)CADASIL患者的血管性癡呆量表評(píng)分無(wú)明顯改善，僅對(duì)一些認(rèn)知執(zhí)行次要指標(biāo)有一定效果[41]。

大多數(shù)用于非心源性栓塞的預(yù)防措施都可以用于CADASIL患者，控制高血壓等腦血管病的危險(xiǎn)因素可減緩疾病進(jìn)展。

3 潛在治療方案研究

3.1 生長(zhǎng)因子療法

干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是血細(xì)胞生成、骨髓干細(xì)胞存活及動(dòng)員所必需的造血生長(zhǎng)因子。為探究SCF和G-CSF是否對(duì)CADASIL小鼠具有神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，研究者對(duì)TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠反復(fù)皮下注射SCF和G-CSF，免疫熒光結(jié)果顯示小鼠小動(dòng)脈血管平滑肌的退化減輕，細(xì)胞凋亡減少，內(nèi)皮細(xì)胞損失被抑制，腦血管密度增加，水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示小鼠認(rèn)知功能明顯改善。在體外模型中，SCF聯(lián)合G-CSF能夠通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路和Caspase-3活性來(lái)減少血管平滑肌細(xì)胞凋亡[42]。之后，該研究小組通過(guò)骨髓移植示蹤骨髓源性細(xì)胞和共聚焦成像的方法，觀察到TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠的腦小血管和毛細(xì)血管中血栓形成，血栓內(nèi)部及周圍可見(jiàn)變性血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血栓形成區(qū)域及鄰近區(qū)域可見(jiàn)IgG外滲，而SCF聯(lián)合G-CSF干預(yù)能夠顯著減少毛細(xì)血管血栓形成和IgG外滲。進(jìn)一步給9月齡和10月齡小鼠皮下注射SCF和G-CSF，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)水平顯著上調(diào)，促進(jìn)了神經(jīng)元結(jié)構(gòu)再生，腦血管單元得到恢復(fù)。而使用VEGF-A的血管生成抑制劑阿瓦斯汀(avastin)預(yù)處理小鼠后，則完全阻礙了SCF聯(lián)合G-CSF發(fā)揮作用[43]。該研究圍繞SCF和G-CSF的作用效果和治療機(jī)制展開，為CADASIL的生長(zhǎng)因子療法提供了新視角(圖2A)。

3.2 免疫療法

2017年，Machuca-Parra等[16]在敲除小鼠中觀察到血管壁細(xì)胞的損失。利用Cre-LoxP系統(tǒng)，他們?cè)贙O小鼠中實(shí)現(xiàn)了條件性表達(dá)野生型(wild type，WT)或C455R突變的人源基因，C455R突變位于Notch3配體結(jié)構(gòu)域，嚴(yán)重破壞了Notch3信號(hào)通路。他們發(fā)現(xiàn)，WT基因能夠減少壁細(xì)胞的損失和血管滲漏，但C455R突變的基因不能挽救以上表型，這提示NOTCH3信號(hào)通路對(duì)于血管壁細(xì)胞的覆蓋率起到重要作用。之前的研究表明，Notch3的激動(dòng)劑A13抗體能夠使Notch3的負(fù)調(diào)控區(qū)域(包含Notch/Lin12重復(fù))變得不穩(wěn)定，從而激活Notch3。因此，他們利用TgNotch3C455R小鼠模型進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用A13能夠激活Notch3 C455R突變受體并啟動(dòng)下游信號(hào)通路，使得小鼠血管壁細(xì)胞損失減少[16]。該研究表明Notch3激動(dòng)劑抗體A13對(duì)攜帶配體結(jié)構(gòu)域突變的CADASIL患者具有潛在的治療作用(圖2B)。

2018年，Ghezali等[44]利用TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠探索5E1單克隆抗體的治療潛力，他們發(fā)現(xiàn)5E1能夠與該小鼠腦動(dòng)脈和毛細(xì)血管中沉積的Notch3蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。但長(zhǎng)期注射5E1抗體后，Notch3和GOM顆粒并沒(méi)有顯著減少，亦未阻止腦白質(zhì)的進(jìn)一步損害。5E1抗體無(wú)法清除GOM沉顆?？赡芘c小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞功能喪失有關(guān)。盡管如此，此治療方案改善了腦血流對(duì)血管擴(kuò)張劑的反應(yīng)性，并使動(dòng)脈肌源性緊張度正常化，從而發(fā)揮保護(hù)腦血管的功能(圖2B)。

2022年，Oliveira等[45]對(duì)TgN3R182C150轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了主動(dòng)免疫治療，自小鼠3月齡起，每2周向小鼠注射WT EGFR1～5和R133C EGFR1～5混合物，至7月齡止。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠大腦毛細(xì)血管的Notch3沉積明顯減少約38%～48%，小膠質(zhì)細(xì)胞激活增加，血清中Notch3胞外結(jié)構(gòu)域水平下降。此外，主動(dòng)免疫療法未影響小鼠體重、行為、血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量和完整性、神經(jīng)元存活率。該研究首次在小鼠模型中成功減少了Notch3的聚集，為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供了支撐(圖2B)。

近年來(lái)，人們利用CADASIL疾病小鼠模型檢驗(yàn)了多種免疫療法的效果，這些療法旨在清除Notch3蛋白沉積或激活Notch3信號(hào)通路，部分減輕了疾病小鼠模型的癥狀，顯示了免疫療法的治療潛力。對(duì)于被動(dòng)療法，研究者未來(lái)還需將抗體跨越血腦屏障的能力納入考慮；對(duì)于主動(dòng)療法，應(yīng)繼續(xù)探索其安全性以及在老年小鼠中的長(zhǎng)期療效。因此，CADASIL的免疫療法仍有待進(jìn)一步完善。

3.3 基因療法

由于Notch3毒性聚集體的產(chǎn)生來(lái)源于單個(gè)EGFR中半胱氨酸數(shù)量的改變，有研究者提出如下假說(shuō)：去除含有突變的EGFR可以減輕Notch3的聚集。為了驗(yàn)證這個(gè)假說(shuō)，Rutten等[46]將反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)外顯子跳躍技術(shù)應(yīng)用于CADASIL的治療研究。ASO是一類設(shè)計(jì)合成的小RNA或DNA，能夠與特定的mRNA前體配對(duì)，以調(diào)控mRNA前體的剪切或翻譯。ASO技術(shù)在多種遺傳病的臨床試驗(yàn)中都表現(xiàn)出良好的效果，例如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和脊髓性肌萎縮等。在調(diào)控剪切時(shí)，ASO與靶向的外顯子特異性結(jié)合，使得該外顯子無(wú)法與剪切原件正確結(jié)合，與兩端的內(nèi)含子一起被切除，最終無(wú)法進(jìn)入成熟的mRNA中。

Rutten等[46]的研究基于以下假設(shè)：由于Notch3含有34個(gè)EGFR，外顯子跳躍導(dǎo)致1個(gè)或2個(gè)EGFR的缺失并不影響Notch3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的功能。因此，根據(jù)以下原則以及軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)2～24號(hào)外顯子中有18個(gè)外顯子可以被跳躍：(1)外顯子跳躍后編碼區(qū)不發(fā)生移碼；(2)外顯子跳躍后形成新的EGFR符合保守序列特征(含有6個(gè)半胱氨酸殘基且空間位置正確)。研究人員選擇了高加索人群的外顯子(第2～6號(hào)外顯子)突變熱點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，他們首先構(gòu)建了模擬外顯子跳躍的cDNA，通過(guò)在HEK293T細(xì)胞和患者來(lái)源的成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了蛋白表達(dá)量、細(xì)胞定位、配體結(jié)合等功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確認(rèn)了經(jīng)外顯子跳躍后的受體能夠正確表達(dá)定位并正常發(fā)揮其在Notch3信號(hào)通路中的功能。接著，他們?cè)诨颊邅?lái)源的成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了單條或多條ASO，經(jīng)RT-PCR和qPCR驗(yàn)證，含有突變的外顯子被成功跳躍且沒(méi)有影響Notch3下游蛋白的表達(dá)。該研究為CADASIL的治療提供了新思路(圖2C)。

圖2 CADASIL潛在治療方案

A：生長(zhǎng)因子療法；B：免疫療法；C：基因療法。

2020年，該研究小組又報(bào)道了1例自然發(fā)生的9號(hào)外顯子跳躍病例[47]。該患者攜帶c.1492G>T (p.Gly498Cys)雜合突變，提取患者成纖維細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)含有突變的等位基因的轉(zhuǎn)錄本大多缺失了9號(hào)外顯子。該患者臨床癥狀相比于其他CADASIL患者輕，皮膚活檢的電鏡結(jié)果顯示，其血管壁附近的Notch3聚集體也較少。這項(xiàng)研究為CADASIL外顯子跳躍療法的有效性第一次提供了患者體內(nèi)證據(jù)。接著，他們?cè)谄交〖?xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了9號(hào)外顯子缺失的cDNA，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白能夠正確于定位于細(xì)胞表面，但由于9號(hào)外顯子編碼的部分EGFR 11參與Notch3配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EGFR 10和11)的組成，9號(hào)外顯子缺失的Notch3蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能減弱。最后，他們?cè)诨颊邅?lái)源的血管平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了靶向9號(hào)外顯子的ASO，并成功實(shí)現(xiàn)了9號(hào)外顯子的跳躍。雖然這些工作僅在細(xì)胞水平上進(jìn)行，但仍為CADASIL的基因療法提供了新視角。隨著基因編輯治療的發(fā)展[48]，利用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)校正突變來(lái)治療CADASIL也是未來(lái)的發(fā)展方向之一。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

自CADASIL的致病基因被鑒定以來(lái)，大量CADASIL病例被報(bào)道，對(duì)于該疾病的機(jī)制研究也不斷深入?，F(xiàn)有機(jī)制研究結(jié)果表明，Notch3突變蛋白能夠聚集于血管壁細(xì)胞表面，并和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白形成GOM，通過(guò)影響血管平滑肌信號(hào)通路、細(xì)胞骨架、膜離子通道及其他血管神經(jīng)單元結(jié)構(gòu)，損傷腦小血管的結(jié)構(gòu)和功能。

目前臨床上用于CADASIL患者的藥物均為對(duì)癥治療藥物，主要用于緩解偏頭痛、治療腦卒中、減輕認(rèn)知功能損傷等。此外，通過(guò)控制血壓、戒煙等方式可以在一定程度上起到預(yù)防作用，但迄今仍缺乏有效治療CADASIL的藥物。

基于CADASIL機(jī)制研究的進(jìn)展，近些年來(lái)對(duì)于CADASIL的生長(zhǎng)因子療法、免疫療法和基因療法的研究逐漸深入。生長(zhǎng)因子療法通過(guò)聯(lián)合補(bǔ)充SCF和G-CSF，改善了血管平滑肌及其他血管神經(jīng)單元的功能。免疫療法使用靶向Notch3蛋白不同結(jié)構(gòu)域的抗體，介導(dǎo)Notch3突變蛋白的清除或激活NOTCH信號(hào)通路，以改善腦血管反應(yīng)性?；虔煼ㄍㄟ^(guò)ASO介導(dǎo)外顯子跳躍，以獲得不含突變且能正常發(fā)揮功能的Notch3蛋白。不少研究具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

未來(lái)，仍需繼續(xù)深入研究CADASIL的發(fā)病機(jī)制，包括Notch3蛋白沉積的原因、血管平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的機(jī)制等。同時(shí)進(jìn)一步探索CADASIL的治療方案，例如，可探索不同生長(zhǎng)因子組合療法以更好地改善血管神經(jīng)單元功能，也可生產(chǎn)靶向Notch3不同結(jié)構(gòu)域的抗體以提高Notch3突變體的清除率。此外，CADASIL作為一種單基因遺傳病，基因治療的研究前景也十分廣闊，例如，可設(shè)計(jì)靶向突變mRNA的ASO，誘導(dǎo)此mRNA的降解，減少突變蛋白的生成，也可使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)直接修正致病突變。

總之，應(yīng)繼續(xù)推進(jìn)CADASIL發(fā)病機(jī)制研究，完善目前已有的潛在治療方案，促進(jìn)CADASIL特異性治療方案的研發(fā)，為患者提供更多有效的治療選擇。

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Pathogenesis and therapeutic advances of cerebral autosomal- dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy

Yi Zhang, Zhi-Ying Wu

Cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) is the most common hereditary cerebral small vessel disease in adults. Many CADASIL cases were reported afterwas identified as the causative gene of CADASIL. However, there is still no specific and effective therapies for CADASIL. In this review, we summarize recent research progress on disease models, symptomatic treatments and potential therapies for CADASIL, thereby providing a reference for follow-up CADASIL treatment research.

CADASIL; pathogenesis; therapeutic advances

2023-02-01;

2023-04-27;

2023-05-09

張翌，在讀博士研究生，專業(yè)方向：神經(jīng)遺傳病。E-mail: zhangyi_@zju.edu.cn

吳志英，博士，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)遺傳病和變性病。E-mail: zhiyingwu@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-023

(責(zé)任編委: 夏昆)