王秉政，張超，張佳麗，孫錦

研究報告

利用單轉(zhuǎn)錄本表達Cas9和sgRNA條件性編輯果蠅基因組

王秉政1，張超2，張佳麗2，孫錦1

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實驗動物學(xué)院(省實驗動物中心)，濟南 250024 2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)，濟南 250024

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)系統(tǒng)具有高效、簡單、易編輯等特性，在基因工程方面具有巨大潛能。在果蠅()基因功能研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也得到了廣泛應(yīng)用。然而利用傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯果蠅基因時，Cas9與sgRNA表達元件往往分別存在于不同果蠅中，需要通過復(fù)雜的遺傳雜交過程將Cas9與sgRNA整合到一個個體中，操作周期長且較為復(fù)雜。本研究在CRISPR/Cas9系統(tǒng)基礎(chǔ)上引入tRNA-sgRNA系統(tǒng)和triplex元件，利用triplex元件連接Cas9和tRNA-sgRNA基因，穩(wěn)定單轉(zhuǎn)錄本切割后Cas9 mRNA的末端，實現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄本可以同時表達Cas9蛋白和sgRNA，通過一次雜交即可得到相應(yīng)表型的后代，簡化了遺傳操作過程。本研究利用這一新的條件性基因編輯系統(tǒng)，分別對果蠅眼部()基因和翅成蟲盤()基因進行條件性敲除，觀察到與預(yù)期相符的對應(yīng)表型。因此，該條件性基因編輯系統(tǒng)在高效性、可擴展性和易操作性等方面是對現(xiàn)有CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行的重大改進。

CRISPR/Cas9；tRNA-sgRNA；triplex元件；條件性基因編輯；果蠅

基因編輯(genome editing，GE)是生物學(xué)研究中不可或缺的技術(shù)[1]，高效的基因編輯是通過斷裂目標染色體序列的DNA雙鏈從而誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)實現(xiàn)的。CRISPR/Cas9(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是一種對靶向基因進行特定DNA修飾的基因編輯技術(shù)，具有高效性、簡便性、準確性等優(yōu)勢，在基因編輯領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2～5]。CRISPR/Cas9技術(shù)利用一段與靶序列互補的gRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶對特異靶向DNA進行識別和切割，造成DNA的雙鏈斷裂，細胞會利用自身具備的兩種DNA修復(fù)機制對斷裂的DNA進行修復(fù)。細胞主要采取非同源末端連接機制(nonhomologous end joining，NHEJ)修復(fù)受損的DNA。但NHEJ修復(fù)錯誤率極高，易造成堿基的缺失或插入，導(dǎo)致移碼突變，使基因功能喪失[6]。

在常見的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，Cas9酶和sgRNA往往由不同的啟動子元件驅(qū)動表達，操作復(fù)雜，周期較長。tRNA-sgRNA系統(tǒng)利用果蠅體內(nèi)的tRNA加工機制，從單個RNA聚合酶II或III轉(zhuǎn)錄本中產(chǎn)生多個sgRNA，可以使一個啟動子同時表達包含Cas9酶和sgRNA陣列的單一轉(zhuǎn)錄本，顯著提高了果蠅中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率和特異性[7]。但在tRNA-sgRNA系統(tǒng)中，mRNA經(jīng)過加工釋放sgRNA后會缺失3′UTR的poly(A)結(jié)構(gòu)，易被細胞內(nèi)的3′→5′核酸外切酶識別并切割，不利于Cas9的表達。Wilusz等[8,9]在基因中發(fā)現(xiàn)，盡管缺乏poly(A)，但三螺旋結(jié)構(gòu)(triplex)的存在使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)能夠被有效翻譯。所以，triplex元件的引入能夠保證Cas9的正確表達。

果蠅眼睛顏色是由眼部色素細胞中的紅色素和褐色素合成、沉積形成的，由位于X染色體的()基因決定?；蛲蛔儗?dǎo)致眼部色素細胞中兩種眼色素缺乏，產(chǎn)生果蠅白眼突變表型，此突變表型易于觀察。翅成蟲盤是果蠅中經(jīng)典的基因表達模型，成對存在，可以分為前隔室(anterior compartment)和后隔室(posterior compartment)兩部分。()基因是翅成蟲盤中表達的重要基因之一，位于果蠅X染色體內(nèi)。

本研究以果蠅為材料，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)、tRNA-sgRNA系統(tǒng)以及triplex元件，構(gòu)建了一種條件性基因編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)單轉(zhuǎn)錄本同時表達Cas9和sgRNA。本研究利用該系統(tǒng)，對決定果蠅眼部顏色的基因和翅成蟲盤中表達的基因進行編輯，成功驗證了其高效性、便捷性。這一新的條件性基因編輯系統(tǒng)，為條件性編輯果蠅基因組提供了更多選擇。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系及飼養(yǎng)

本研究注射用果蠅基因型為y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos-phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40，在標準玉米粉/糖/瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為60%。en-Gal4品系果蠅、ey-Gal4品系果蠅、gRNA單獨表達系統(tǒng)品系果蠅均來自清華大學(xué)果蠅中心。果蠅注射由清華大學(xué)果蠅中心完成。

1.2 引物設(shè)計

按照本研究質(zhì)粒構(gòu)建思路，在Flybase數(shù)據(jù)庫中查詢基因、基因序列信息。依照CRISPR/Cas9靶點設(shè)計原則，引物序列見表1。

1.3 轉(zhuǎn)基因果蠅基因型鑒定

用CO2麻醉轉(zhuǎn)基因果蠅，取一只置于1.5 mL 離心管中，放于冰上。加入50 μL SB buffer和1 μL Proteinase K，研磨棒充分研磨。快速離心，37℃水浴鍋消化60 min。消化結(jié)束后，12,000 r/min 離心2 min，取10 μL上清液于PCR排管中。置于PCR儀中，設(shè)定程序95℃ 3 min。結(jié)束后配置反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系為：2×EsMasterMix(Dye) 25 μL，Dmt-Fs 1 μL，ftz 2 μL，果蠅基因組DNA 2 μL，加 ddH2O 至總體積為 50 μL。PCR程序設(shè)定循環(huán)次數(shù)為35次，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性 20 s，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min；最后再72℃延伸3 min。

1.4 翅成蟲盤免疫熒光染色

基因具有多種剪切產(chǎn)物，會產(chǎn)生對應(yīng)的多種蛋白。Br-C(美國DSHB公司，貨號：25E9.D7)是能夠識別所有基因相關(guān)蛋白產(chǎn)物的抗體，可用于翅成蟲盤免疫熒光染色。在1.5 mL離心管中加入1 mL含10% BSA的PBS溶液，置于冰上，解剖出3齡幼蟲晚期的一對翅成蟲盤及周邊非脂肪組織，放于離心管中。去掉上清，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，固定30 min。吸去上清，加1 mL含0.1% Triton-100的PBS溶液(以下簡稱為0.1%PBST)，搖床慢搖，15 min，重復(fù)4次。吸去上清，配制5%封閉液(950 μL 0.1%PBST + 50 μL山羊血清)，加入1 mL 5%封閉液，搖床慢搖1 h。吸去上清，加入200 μL一抗(Br-C，用0.1%PBST 1∶10稀釋)，錫箔紙包裹避光，4℃搖床過夜。吸去上清，加1 mL 0.1%PBST，搖床慢搖15 min，重復(fù)3次。吸去上清，加入300 μL二抗(594 anti-mouse，300 μL 0.1%PBST + 1滴)，用錫紙包裹，搖床慢搖2.5 h。直接加入DAPI，稀釋比例1∶1000，搖床慢搖10 min。吸去上清，加1 mL 0.1%PBST，搖床慢搖15 min，重復(fù)4次。將完整獨立的翅成蟲盤從組織中解剖出來，放入滴有Fluoromount? Aqueous Mounting的載玻片上，蓋上蓋玻片封固，完成樣品鋪片。

表1 引物序列信息

1.5 條件性敲除系統(tǒng)的構(gòu)建

以質(zhì)粒nos-cas9[10]為模板，通過PCR擴增得到Cas9蛋白編碼序列，其中所用的引物分別為cas9-F、cas9-R(序列見表1)。質(zhì)粒pNP[11]經(jīng)過I和I酶切回收，與PCR擴增得到的Cas9蛋白編碼序列通過同源重組的方式連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，測序正確的質(zhì)粒記為UAS-Cas9。triplex與tRNA-sgRNA序列由蘇州金唯智公司合成，具體序列見圖1。

利用引物Triplex-F、tRNA-sgRNA-R(序列見表1)，通過PCR擴增得到triplex與tRNA-sgRNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后與經(jīng)過I和II酶切回收的UAS-Cas9質(zhì)粒進行同源重組連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，測序正確的質(zhì)粒標記為UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA，含有以下表達元件(圖2)：triplex元件為一個穩(wěn)定的三級RNA結(jié)構(gòu)，位于Cas9蛋白表達元件下游；tRNA-sgRNA元件上含有1段果蠅tRNA編碼序列(深綠色)、1段帶有兩個I位點的間隔區(qū)(紅色)、gRNA骨架序列(紫色)和水稻tRNA編碼序列(黃色)，其位于triplex表達元件下游。

圖1 triplex與tRNA-sgRNA堿基序列

綠色標注區(qū)域為triplex序列，共110個堿基對；藍色標注區(qū)域為tRNA-sgRNA序列，共269個堿基對。triplex序列位于tRNA-sgRNA序列上游。

圖2 基因編輯系統(tǒng)元件示意圖

1.6 針對決定眼睛顏色w基因的轉(zhuǎn)基因果蠅構(gòu)建

將sgRNA設(shè)計在基因的第1個外顯子起始密碼子ATG的后面，在缺失1～2個堿基的情況下便會產(chǎn)生大量氨基酸編碼的錯位(移碼突變)，影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。所用到的引物為White-F和White-R (序列見表1)，將退火形成的雙鏈DNA產(chǎn)物插入到經(jīng)I酶切回收的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA質(zhì)粒中，得到UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA質(zhì)粒。通過顯微注射的方式分別將空質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒注射到基因型為y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos- phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40的果蠅胚胎中，25℃培養(yǎng)，并通過遺傳整合的方式最終得到純合的轉(zhuǎn)基因果蠅(分別標記為Cas9,sgRNA和Cas9,sgRNA)。

1.7 針對果蠅翅成蟲盤br基因的轉(zhuǎn)基因果蠅構(gòu)建

基因DNA序列編碼區(qū)全長為9822 bp，由7個外顯子和4個內(nèi)含子組成。sgRNA在基因位點上設(shè)計的位置是以第1外顯子作為突變區(qū)域設(shè)計靶點，在起始密碼子ATG后進行移碼突變，影響原有蛋白的生物學(xué)功能，得到基因的突變體?；蜣D(zhuǎn)錄本設(shè)計如圖3所示。

以br-sg-F、br-sg-R(序列見表1)為引物，以UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA為模板，將PCR回收產(chǎn)物插入到經(jīng)I酶切回收的UAS-Cas9- triplex-tRNA-sgRNA質(zhì)粒中，得到UAS-Cas9-triplex- tRNA-sgRNA質(zhì)粒。

圖3 sgRNA靶標位點示意圖

白色方框表示UTR；黑色線段表示內(nèi)含子；黑色方框表示外顯子；與豎線相連的黑色方框為基因轉(zhuǎn)錄本的第1外顯子，折線上方為第1個外顯子全部序列，ATG為起始密碼子，帶下劃線的大寫字母為sgRNA靶位點序列。

通過顯微注射的方式將上一步得到的UAS- Cas9-triplex-tRNA-sgRNA質(zhì)粒注射到基因型為y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos-phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40的果蠅胚胎中，25℃培養(yǎng)，并通過遺傳整合的方式最終得到純合的轉(zhuǎn)基因果蠅。隨機提取兩只轉(zhuǎn)基因果蠅DNA，以其為模板，用引物Dmt-Fs、ftz(序列見表1)進行基因型鑒定，目的條帶大小均應(yīng)為630 bp。利用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗?zāi)康臈l帶，大小與預(yù)期一致(圖4)。

2 結(jié)果與分析

2.1 針對w基因的條件性敲除

為驗證UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)的編輯效率，本研究以決定眼睛顏色的基因為例，構(gòu)建了條件性敲除基因的轉(zhuǎn)基因果蠅。用ey-Gal4果蠅作為母本與純合的轉(zhuǎn)基因果蠅雜交，25℃培養(yǎng)，使雜交后代在眼睛中特異性表達Cas9和sgRNA。取孵化后3～5天的子代雌性成蟲觀察表型，結(jié)果如圖5A所示。ey-Gal4果蠅與Cas9,sgRNA果蠅雜交得到的后代ey-Gal4>Cas9,sgRNA作為對照組，對照組雌性果蠅眼睛表型為野生型(wild type，WT)的深紅色。以ey-Gal4果蠅與條件性敲除基因果蠅雜交得到的后代ey-Gal4>Cas9,sgRNA為實驗組，共出現(xiàn)3種代表性表型，記為Class 1、Class 2、Class 3。雜交后代因不同數(shù)量的眼睛色素細胞中基因被編輯出現(xiàn)不同程度的眼睛顏色改變，當(dāng)基因只有一個拷貝被編輯時，色素細胞顏色會變淺為淺紅色，當(dāng)基因的兩個拷貝都被編輯時，色素細胞變?yōu)榘咨?。利用ImageJ軟件，對眼睛色塊面積進行統(tǒng)計：Class 1為整個眼睛全為白色的表型，說明整個眼睛所有色素細胞中基因的兩個拷貝都被有效編輯；Class 2為眼睛白色面積占比超過90% 且剩余部分為淺紅色的表型，說明絕大部分色素細胞中基因的兩個拷貝都被有效編輯，剩余的少部分色素細胞中基因的兩個拷貝至少有一個被編輯；Class 3為眼睛白色面積占比超過50% 且剩余部分為淺紅色的表型。從對照組和實驗組的雜交后代中各取34只雌性果蠅進行統(tǒng)計，Class 1所占比例為10.3%，Class 2所占比例為55.9%，Class 3所占比例為33.8% (圖5B)。Class 1和Class 2共占比例為66.2%，說明大部分雌性果蠅眼睛色素細胞中基因的兩個拷貝都被有效編輯。實驗組雌性果蠅的眼睛形態(tài)和對照組相比沒有明顯變化，只有眼睛顏色發(fā)生變化，表明眼睛發(fā)育沒有受到影響。結(jié)果證明了此系統(tǒng)不僅可以高效的條件性敲除基因，而且特異性強。

圖4 br轉(zhuǎn)基因果蠅鑒定

M：D15000+2000 marker；1、2：轉(zhuǎn)基因果蠅PCR擴增條帶。

為了比較UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)和傳統(tǒng)gRNA單獨表達系統(tǒng)的編輯效率，本研究同樣用ey-Gal4果蠅作為母本與gRNA單獨表達果蠅品系雜交，25℃培養(yǎng)。該gRNA單獨表達果蠅品系中，Cas9的表達同樣由UAS調(diào)控，但是sgRNA的表達由U6b啟動子控制，而且該sgRNA的序列與本研究使用的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)中的相同。同樣取3～5天子代雌性成蟲觀察表型，結(jié)果出現(xiàn)了與新系統(tǒng)不同的表型(圖5A)，新出現(xiàn)的兩種表型分別標記為Class 4和Class 5。Class 4為眼睛白色面積占比超過50%，而剩余部分為深紅色的表型，說明部分色素細胞中基因的兩個拷貝都未被有效編輯；Class 5為眼睛為深紅色面積比例超過85%的表型，說明近90%的色素細胞中基因的兩個拷貝都未被有效編輯。同樣從傳統(tǒng)gRNA單獨表達系統(tǒng)的實驗組雜交后代中取34只雌性果蠅進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖5B所示。Class 1所占比例為2.9%，Class 2所占比例為16.3%，Class 3所占比例為23.5%，Class 4所占比例為42.6%，Class 5所占比例為14.7%。其中Class 1和Class 2共占比例僅為19.2%，遠低于UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)超過60%的比例。而且UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)敲除基因后，白色部分以外的眼睛顏色多為淺紅色，如Class 2、Class 3，而在傳統(tǒng)gRNA單獨表達系統(tǒng)中，白色部分以外的眼睛顏色仍多為深紅色，說明這部分果蠅眼睛色素細胞中基因的兩個拷貝都未被編輯。以上結(jié)果表明，UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系統(tǒng)與傳統(tǒng)gRNA單獨表達系統(tǒng)相比，具有更高的基因編輯效率。

2.2 針對br基因的條件性敲除

本研究構(gòu)建的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA質(zhì)粒含有兩個sgRNA，即sgRNA 1和sgRNA 2，經(jīng)過測序，結(jié)果見圖6。

圖5 條件性敲除w基因的果蠅眼睛表型及統(tǒng)計圖

A：果蠅眼睛顏色表型圖。以ey-Gal4>Cas9,sgRNA果蠅作為對照組，眼睛表型顏色為野生型的深紅色(WT)。Class 1、Class 2、Class 3、Class 4、Class 5為實驗組中出現(xiàn)的5種雌性果蠅眼部表型。B：雌性果蠅眼睛不同表型統(tǒng)計與占比分析圖。

圖6 br基因sgRNA堿基序列測序圖

圖中藍色標注的區(qū)域為目標堿基序列，與其下方相對應(yīng)的是序列及峰圖。

除了對基因進行條件性編輯驗證這一系統(tǒng)的高效性外，本研究還對果蠅翅成蟲盤中基因進行條件性編輯，以此進一步驗證該系統(tǒng)的編輯效率。en-Gal4果蠅是特異性在翅成蟲盤后隔室表達的常用品系，前隔室的細胞可以作為后隔室的內(nèi)在對照。利用en-Gal4,UAS-GFP果蠅品系作為母本分別與野生型果蠅和條件性敲除基因果蠅品系進行雜交，以野生型雜交子代作為對照。從實驗組和對照組的雜交后代中分別隨機選取30只處于晚期的雄性3齡幼蟲，共60個翅成蟲盤，進行翅成蟲盤解剖和熒光染色，觀察Br蛋白在翅成蟲盤中表達情況(圖7)。a與a′為Br蛋白在對照翅成蟲盤中的熒光染色圖，結(jié)果顯示Br蛋白在整個翅成蟲盤都有分布，且在前隔室和后隔室細胞中的表達量相同。b與b′為基因在翅成蟲盤中被條件性敲除后的熒光染色圖。兩組染色結(jié)果的對比表明，基因被條件性編輯后，在翅成蟲盤中GFP綠色熒光區(qū)域沒有正常表達。所取的60個雄性翅成蟲盤中，基因被成功敲除的共44個，占比為73.33%，證明此系統(tǒng)可以高效的條件性敲除在翅成蟲盤中表達的基因。

3 討論

人類基因組計劃對科學(xué)的影響不可估量。從第一代DNA核酸酶編輯系統(tǒng)(zinc finger nuclease，ZFN)、第二代(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)到第三代CRISPR/Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高、成本也逐漸降低，應(yīng)用范圍不斷擴大[7]。條件性基因敲除(conditional knoc-kout，cKO)克服了基因完全敲除導(dǎo)致胚胎死亡或早亡的缺點[12]，可用于研究基因在特定發(fā)育階段或特定組織中的功能[13]。

果蠅作為經(jīng)典模式生物，具有清晰的遺傳背景和簡便的遺傳實驗操作，在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)等多個領(lǐng)域占有舉足輕重的地位。條件性敲除在果蠅中也得到了廣泛應(yīng)用，最初常用的條件性敲除方式為噬菌體Cre/loxP[14]和酵母FLP/FRT[15,16]位點特異性重組酶系統(tǒng)，均能在果蠅體內(nèi)發(fā)揮作用[17]。但Cre/loxP被證實在果蠅體內(nèi)效率較低[18]，且對果蠅有一定的毒性[19]。FLP/FRT雖然能在果蠅中高效介導(dǎo)基因重組[16]，但并不適用于胚胎早期階段[20,21]。

目前在果蠅中使用最普遍的基因編輯方法是Charpentier等[22]提出的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一個包含獨特間隔序列的CRISPR-RNA (crRNA)和一個CRISPR-Cas核酸酶組成。利用生殖細胞穩(wěn)定表達Cas9的轉(zhuǎn)基因果蠅品系，可實現(xiàn)高效可遺傳的DNA定點突變。但Cas9酶和sgRNA由不同的啟動子元件驅(qū)動，操作復(fù)雜并且周期較長。Ding等[23]報道了一種在水稻(L)中將gRNA融合進Cas9或Cpf1蛋白內(nèi)含子中的單轉(zhuǎn)錄本Cas系統(tǒng)，提高了基因組編輯的效率和能力。本研究所構(gòu)建的方法在果蠅中同樣實現(xiàn)了在單轉(zhuǎn)錄本同時表達Cas9與sgRNA。

圖7 在翅成蟲盤中高效敲除br基因

a圖為對照組翅成蟲盤中的分布，基因型為en-Gal4>UAS-GFP；a′為a的Br-C染色通道；b圖為實驗組基因被條件性敲除后雄性翅成蟲盤中的分布，基因型為en-Gal4>Cas9，sgRNA；b′為b的Br-C染色通道。GFP綠色熒光為Gal4的表達區(qū)域。標尺=50 μm。

本研究以果蠅為實驗材料，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)基礎(chǔ)上，引入tRNA-sgRNA系統(tǒng)以及triplex元件，構(gòu)建了高效的條件性基因編輯系統(tǒng)。首先針對果蠅眼部基因進行條件性敲除并觀察表型，其次運用UAS/Gal4系統(tǒng)對翅成蟲盤中基因進行條件性敲除，通過免疫熒光染色觀察蛋白表達。通過這兩項基因編輯實驗，驗證了該基因編輯系統(tǒng)的穩(wěn)定性、高效性和簡便性。

針對基因進行編輯的實驗結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的單轉(zhuǎn)錄本表達Cas9和sgRNA系統(tǒng)，比傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9條件性基因編輯系統(tǒng)效率更高。傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9條件性基因編輯系統(tǒng)中，Cas9由UAS調(diào)控轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的mRNA 3′端是Poly(A)結(jié)構(gòu)，sgRNA由U6b啟動子驅(qū)動表達。本研究新構(gòu)建的單轉(zhuǎn)錄本表達Cas9和sgRNA系統(tǒng)中，Cas9和sgRNA的表達是由同一個UAS元件調(diào)控，得到的Cas9 mRNA的3′端是triplex結(jié)構(gòu)。因此編輯效率的不同也許是由于Cas9蛋白或sgRNA表達量的不同導(dǎo)致的，未來可以針對這一方面進行深入探索。

綜上所述，利用單轉(zhuǎn)錄本表達Cas9和sgRNA條件性編輯果蠅基因組系統(tǒng)，為果蠅基因組的精確編輯提供了更多選擇。

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Conditional editing of thegenome using single transcripts expressing Cas9 and sgRNA

Bingzheng Wang1, Chao Zhang2, Jiali Zhang2, Jin Sun1

The CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR- associated protein 9) system, a highly efficient, simple, and easy genome editing technology, offers significant potential for genetic engineering and has been commonly applied in gene function studies in. However, when using CRISPR/Cas9 system to editgene, Cas9 and sgRNA expression elements exist in differentindividuals, and Cas9 and sgRNA must be integrated into an individual through a complex genetic hybridization process, which has a long and complex operation cycle In this study, on the basis of the CRISPR/Cas9 system, we introduced the tRNA-sgRNA system and triplex elements, used triplex elements to link Cas9 and tRNA-sgRNA genes, stabilized the end of Cas9 mRNA after single transcript cutting, and made the expression of both Cas9 protein and sgRNA with a single transcript a reality. And as we obtained the corresponding phenotypic progeny in one hybridization, genetic manipulation was simplified. We found that conditional knockout of thegene in theeye and thegene in the adult wing disc resulted in corresponding phenotypes that matched expectations using our new conditional gene editing system. So the significant advances in this new conditional gene editing system over the existing CRISPR/Cas9 system are that it is more efficient, extendable, and easy to use.

CRISPR/Cas9; tRNA-sgRNA; triplex elements; conditional gene editing;

2023-04-15;

2023-06-09 ;

2023-07-03

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31801079)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31801079)]

王秉政，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：果蠅干細胞發(fā)育。E-mail: 370756420@qq.com

孫錦，博士，副教授，研究方向：果蠅干細胞發(fā)育。E-mail: sunjin@sdfmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-099

(責(zé)任編委: 閻言)