朱有福 李承威 沈娜娜 相宏飛 陳伯華 郭柱

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科,山東 青島 266035)

椎間盤退變(IDD)是下腰痛的最常見原因［1］,藥物及手術(shù)兩種方式雖能緩解患者疼痛,卻無法恢復(fù)椎間盤功能［2］。因此,椎間盤組織工程因其具有改善IDD、恢復(fù)髓核功能的特點(diǎn),逐漸成為IDD治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［3］。組織工程技術(shù)通過將材料學(xué)與干細(xì)胞及其衍生物結(jié)合發(fā)揮治療作用［4］,其中常用干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)［5］。然而MSC獲取困難,無法廣泛應(yīng)用［6］。人尿源干細(xì)胞(USC)來源廣泛,無倫理爭議,具有與MSC接近的生物學(xué)特性,獲取方式簡單無創(chuàng)［7-8］。研究證明,USC可被髓核細(xì)胞(NPC)誘導(dǎo)分化為髓核樣尿源干細(xì)胞(NP-USC)［9-10］。組織工程中干細(xì)胞需要同時發(fā)揮效應(yīng)細(xì)胞作用以及一定程度的增殖能力［11］,因此探究干細(xì)胞分化程度與增殖速率的關(guān)系顯得尤為重要［12］。本研究通過對不同時間下經(jīng)NPC誘導(dǎo)USC所獲得NP-USC的增殖速率、髓核樣細(xì)胞標(biāo)記基因和軟骨細(xì)胞特異性基因與其對應(yīng)蛋白的表達(dá)差異性進(jìn)行研究,旨在探討不同分化程度NP-USC的增殖速率及USC-EXO對其促增殖的作用,為椎間盤組織工程篩選合適的NP-USC提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

胎牛血清、無外泌體血清購自美國Gibco公司,USC成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)以及成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒均購自美國Cyagen公司,兔抗HIF-1α、抗GLUT1、抗COL2、抗ACAN以及抗β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG二抗購自美國Santa公司。

1.2 NPC的提取和培養(yǎng)

NPC培養(yǎng)基共50 mL,包含5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,剩余以DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)足。收集2022年4—6月我院脊柱外科10例L4～L5椎間盤突出患者手術(shù)切除的髓核組織樣本,無菌轉(zhuǎn)運(yùn)至超凈臺內(nèi),洗凈分離髓核組織并充分剪碎至直徑1 mm左右的組織塊。用磷酸緩沖鹽溶液PBS洗滌3次,轉(zhuǎn)入15 mL離心管中,加入10 mL髓核細(xì)胞培養(yǎng)基及2 mLⅡ型膠原酶,轉(zhuǎn)至恒溫?fù)u床中37 ℃下充分消化髓核組織。過濾后20 ℃下將濾液1 200 r/min離心5 min,棄去上清液保留細(xì)胞沉淀。以NPC培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,20 ℃下1 000 r/min離心5 min,棄上清液留細(xì)胞沉淀,添加NPC培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×108/L,接種到12孔板中,轉(zhuǎn)至37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的溫箱中培養(yǎng),3 d后篩選出可見少許NPC細(xì)胞團(tuán)簇的孔板,更換原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3 d換液,待細(xì)胞融合度達(dá)90%左右傳代,后續(xù)實(shí)驗取用第3代NPC。

1.3 USC的提取和培養(yǎng)

USC原代培養(yǎng)基共50 mL,包含5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,600 μL生長因子添加劑REGM SingleQuot,剩余體積則以DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)足。收集同期5名健康成年男性志愿者的潔凈中段尿,在超凈臺內(nèi)移入50 mL離心管中,室溫下1 500 r/min離心5 min,棄上清液至每管剩余0.2 mL。使用USC原代培養(yǎng)基重懸剩余液體,向0.1%明膠溶液包被過的24孔板內(nèi)每孔加入0.5 mL重懸液,轉(zhuǎn)至37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的溫箱中培養(yǎng),5 d后篩選出可見少許USC細(xì)胞團(tuán)簇的孔板,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3 d換液,待細(xì)胞融合達(dá)90%左右傳代,后續(xù)實(shí)驗取用第3代USC。

1.4 USC的鑒定

將第3代USC接種到6孔板中,按成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒說明書配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基,待USC融合度達(dá)80%左右,將細(xì)胞分為1、2、3組。1組進(jìn)行成骨誘導(dǎo),每孔加入2 mL USC成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基,每3 d換液,于第21天時加入4%多聚甲醛固定,茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察染色情況。2組進(jìn)行成脂誘導(dǎo),每孔先加入USC成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液,于3 d后再換為USC成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液,1 d后重新?lián)Q成A液,交替更換培養(yǎng)基14 d后,用4%多聚甲醛固定,油紅O染色后倒置顯微鏡觀察染色情況。3組進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),每孔加入0.5 mL USC成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基,每3 d更換一次培養(yǎng)基,在21 d后用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,以阿利辛藍(lán)染色后倒置顯微鏡下觀察染色情況。

取第3代USC,37 ℃下胰酶消化3 min,獲得細(xì)胞懸液,加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用移液管將USC的細(xì)胞懸液吸至15 mL離心管中。20 ℃下400 r/min離心5 min。離心后棄上清液,剩余約0.2 mL細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)至超凈臺,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS對USC洗滌3次。用移液槍取10 μL細(xì)胞懸液滴至計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),用移液槍分別取200 μL USC細(xì)胞懸液分裝至5支1.5 mL微型離心管中,每管均加入10 μL的CD29、CD44和CD73一抗,冰盒內(nèi)靜置,避光保存1 h。以4 ℃預(yù)冷離心機(jī)5 min,將上述微型離心(EP)管以1 500 r/min離心5 min,再次用含1% BSA的PBS溶液洗滌EP管內(nèi)USC 3次,以提純細(xì)胞。PBS重懸USC,上述微型離心管每管內(nèi)加入2.5 μL HRP標(biāo)記的兔抗人IgG二抗,于冰盒內(nèi)避光靜置保存20 min。以4 ℃預(yù)冷離心機(jī)10 min,然后將上述的EP管以1 500 r/min離心5 min,離心后使用含1% BSA的PBS洗滌EP管內(nèi)USC 1次。將USC重懸后置于流式細(xì)胞儀中檢測USC陽性標(biāo)記物CD29、CD44和CD73的表達(dá)。

1.5 USC-EXO的提取與鑒定

配置無外泌體USC培養(yǎng)基50 mL,包含5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1的無外泌體胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,以及600 μL生長因子添加劑REGM SingleQuot,剩余體積以DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)足。取第3代USC,加入無外泌體的USC培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的溫箱中培養(yǎng),72 h后,吸取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至50 mL離心管過濾,再轉(zhuǎn)入超速離心管,加熱封口,將上述超速離心管置于4 ℃下預(yù)冷超高速離心機(jī)以500 g離心10 min,吸取上清液以去除細(xì)胞。將上清液以2 000 g離心10 min,離心后吸取上清液以去除細(xì)胞碎片,之后將上清液以10 000 g離心10 min,離心以后吸取上清液以去除凋亡小體,再取上清液以12 000 g離心120 min。棄上清液,PBS重懸獲得USC-EXO懸液,使用100 μL EP管分裝,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

以37 ℃水浴加熱解凍USC-EXO懸液,吸取10 μL滴加至載樣銅網(wǎng),靜置5 min自然晾干,移液槍吸取10 μL濃度為3%的磷鎢酸溶液,滴加至載樣銅網(wǎng)后自然晾干,透射電鏡觀察USC-EXO并拍照記錄。移液槍另吸取10 μL USC-EXO懸液加入比色皿中,使用PBS補(bǔ)足懸液至比色皿體積2/3處,光面朝外置于粒徑分析儀中檢測粒徑分布情況。

1.6 NPC與USC共培養(yǎng)

取第3代NPC接種于24孔板底部,每孔加入200 μL NPC培養(yǎng)基,并放置于Transwell小室,向小室中接種第3代USC,加入150 μL USC完全培養(yǎng)基。將上述共培養(yǎng)細(xì)胞分為A、B、C組,A組細(xì)胞先共培養(yǎng)7 d,再將共培養(yǎng)獲得的NP-USC在無外泌體USC培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d;B組細(xì)胞先共培養(yǎng)14 d,再將共培養(yǎng)獲得的NP-USC在無外泌體USC培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d;C組細(xì)胞共培養(yǎng)21 d。小室內(nèi)外每天更換新的培養(yǎng)基。另將第3代USC及NPC分別在無外泌體USC培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d,設(shè)為USC組及NPC組。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測髓核樣細(xì)胞標(biāo)記基因及軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)

取1.6中5組細(xì)胞,分別在不加USC-EXO及添加USC-EXO的條件下培養(yǎng)28 d后,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,以GADPH作為內(nèi)參照,每個樣品分別設(shè)置3個復(fù)孔,實(shí)驗重復(fù)進(jìn)行3次。采用2-△△CT法計算樣本中HIF-1α、GLUT1、COL2及ACANmRNA的相對表達(dá)水平。引物名稱及其序列見表1。

表1 NPC相關(guān)基因引物序列

1.8 Western blot法檢測髓核樣細(xì)胞標(biāo)記蛋白及軟骨細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)

取1.6中5組細(xì)胞,將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸棄,4 ℃預(yù)冷PBS沖洗3次,加入3 mL含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min;使用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞,置入離心管中,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清液置于冰上備用,BCA法測蛋白濃度。將蛋白和蛋白上樣緩沖液混均后進(jìn)行變性,然后用SDS-PAGE分離樣品,再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。于含體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉的封閉液中封閉后,加入ACAN、GLUT1、COL2A1及HIF-1α一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜后加入HRP標(biāo)記的兔抗人二抗室溫孵育1 h,再使用ECL方法顯影,顯影后使用IPP6軟件測定上述5組細(xì)胞中ACAN、GLUT1、COL2及HIF-1α蛋白的灰度值。

1.9 CCK-8法檢測USC及NPC細(xì)胞增殖情況

取1.6中5組細(xì)胞,分別置于12孔板中,加入無外泌體USC培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組每孔均加入1.5中所提取的USC-EXO 200 μL。在培養(yǎng)至第7、14、21、28天時,對各組細(xì)胞各加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度值,并計算細(xì)胞活力以代表增殖速率。細(xì)胞活力=(吸光度測量值-吸光度空白值)/(吸光度對照值-吸光度空白值)×100%。實(shí)驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 USC鑒定結(jié)果

1組細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色后鏡下細(xì)胞內(nèi)滿布鈣結(jié)節(jié)(圖1A),2組細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后鏡下可見紅染的胞內(nèi)脂滴(圖1B),3組細(xì)胞經(jīng)阿利新藍(lán)染色后鏡下細(xì)胞內(nèi)藍(lán)染糖胺聚糖分布明顯(圖1C)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,USC中CD29(99.11%)、CD44(98.85%)和CD73(94.27%)均高表達(dá)。

A:成骨分化誘導(dǎo)后茜素紅染色結(jié)果,B:成軟骨分化誘導(dǎo)后阿利新藍(lán)染色結(jié)果,C:成脂分化誘導(dǎo)后油紅O染色結(jié)果

2.2 USC-EXO鑒定結(jié)果

使用透射電鏡觀察USC-EXO直徑、數(shù)量及大小,納米粒徑分析外泌體直徑分布情況。在透射電鏡下觀察載樣銅網(wǎng)上的USC-EXO懸液,可看到多個大小不一的圓形囊泡及部分不規(guī)則形囊泡,直徑介于50～150 nm;經(jīng)粒徑分析發(fā)現(xiàn),外泌體直徑分布接近于正態(tài)分布,直徑主要在120 nm左右,與透射電鏡觀察結(jié)果相同。

2.3 倒置顯微鏡觀察NPC與USC共培養(yǎng)結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,A組NP-USC增殖至占據(jù)全部視野的40%～50%,其形態(tài)介于紡錘形和短梭形間;B組NP-USC增殖達(dá)到接觸融合,其形態(tài)均為規(guī)則梭形或多角形;C組NP-USC細(xì)胞形態(tài)與B組無明顯差異,形態(tài)呈規(guī)則梭形或多角形;NPC、USC組細(xì)胞分別呈規(guī)則梭形和紡錘形。

2.4 A、B、C、USC、NPC組細(xì)胞HIF-1α、GLUT1、ACAN、COL2 mRNA相對表達(dá)量比較

RT-qPCR結(jié)果顯示,未添加USC-EXO以及添加USC-EXO時,5組細(xì)胞間的HIF-1α、GLUT1、ACAN及COL2 mRNA相對表達(dá)量均有顯著差異(F=982.09～1 488.54,P<0.01);其中USC、A、B、C組的HIF-1α、GLUT1、COL2、ACANmRNA相對表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(t=53.36～371.86,P<0.01),但C組與NPC組4種基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05),加入USC-EXO前后比較各組細(xì)胞中4種基因的相對表達(dá)量亦無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組ACAN、COL2、GLUT1、HIF-1α mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 A、B、C、USC、NPC組細(xì)胞HIF-1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白相對表達(dá)量比較

Western blot方法檢測結(jié)果顯示,5組細(xì)胞的HIF1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白相對表達(dá)量比較有顯著性差異(F=95.72～190.44,P<0.01),其中USC、A、B、C組4種蛋白的相對表達(dá)量分別依次升高(t=65.21～185.51,P<0.01),但C組與NPC組4種蛋白相對表達(dá)量無顯著差異。見圖2、表3。

圖2 Western blot方法檢測5組細(xì)胞HIF1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞ACAN、COL2、GLUT1、HIF-1α蛋白相對表達(dá)量比較

2.6 A、B、C、USC及NPC組細(xì)胞增殖能力比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示,時間、組別對細(xì)胞活力均有顯著的影響(F時間=767.74,F組別=327.55,P<0.05),時間與組別交互作用對細(xì)胞活力無顯著性影響(P>0.05)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示,在各時間點(diǎn)USC、A、B、C組細(xì)胞活力依次下降(F=3.77～103.58,P<0.05),但C組與NPC組無顯著性差異(P>0.05)。5組中每組細(xì)胞在第7、14、21、28天時,細(xì)胞活力均依次升高(F=9.96～121.68,P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞在第7、14、21及28天時細(xì)胞活力比較

3 討 論

隨著全球老齡化人口的增加,IDD正逐漸演變成一個難以忽視的健康問題［13］。IDD是一種涉及衰老、壓力、過負(fù)荷［14］、遺傳［15］等因素的自然進(jìn)程,能引發(fā)椎間盤突出、椎管狹窄,使患者活動受限,影響其生活質(zhì)量。IDD的治療選擇包括保守治療和手術(shù)治療［16］,但這些方法均不能改善IDD。在美國等發(fā)達(dá)國家中,與IDD治療有關(guān)的直接和間接成本估計每年超過100億至200億美元［17］。組織工程作為椎間盤再生治療的熱門研究方向之一［18］,可能從源頭解決NPC老化凋亡問題。組織工程實(shí)驗中需要的干細(xì)胞應(yīng)同時具有干細(xì)胞的增殖潛力及效應(yīng)細(xì)胞的作用,換言之,誘導(dǎo)分化程度過高或過低的干細(xì)胞均不適合用于組織工程實(shí)驗。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn),NPC可通過共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)人USC分化為NP-USC,但尚不了解不同誘導(dǎo)程度下NP-USC分化程度及增殖能力［10］。

誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為髓核樣細(xì)胞是現(xiàn)今椎間盤組織工程的研究重點(diǎn)方向［19］。確認(rèn)分化為髓核樣細(xì)胞的關(guān)鍵在于檢測NPC標(biāo)記基因HIF-1α與GLUT1以及軟骨細(xì)胞特異性基因COL2以及ACAN的表達(dá)情況［20-23］。HIF-1α基因在纖維環(huán)和軟骨終板中均不表達(dá),僅在氧分壓正常條件下的NPC中特異性表達(dá),可以用于檢測髓核樣細(xì)胞中。GLUT1基因同樣僅僅表達(dá)于髓核細(xì)胞中。COL2、ACAN基因主要由軟骨細(xì)胞表達(dá),其中COL2蛋白是椎間盤中最主要成分［24］,ACAN是椎間盤的主要非膠原成分。HIF-1α與GLUT1為NPC細(xì)胞標(biāo)記基因,僅在NPC細(xì)胞中大量表達(dá)［25］,USC中不表達(dá)或少量表達(dá)。ACAN與COL2基因在軟骨細(xì)胞中具有不同程度的表達(dá),可區(qū)分干細(xì)胞是否向軟骨樣細(xì)胞分化,但無法區(qū)分其是否為髓核樣細(xì)胞。本研究通過對HIF-1α、GLUT1、COL2、ACAN基因及其蛋白的檢測可區(qū)分NP-USC分化程度。

本研究顯示,HIF-1α、GLUT1、COL2、ACAN在C組高表達(dá),且表達(dá)量與NPC組相近,在USC、A、B組間表達(dá)量呈遞增的趨勢;添加USC-EXO與未添加USC-EXO以后,NP-USC均表達(dá)HIF-1α、GLUT1等NPC標(biāo)記基因及COL2、ACAN等軟骨特異性基因,且其表達(dá)量無明顯差異性。根據(jù)上述結(jié)果可推斷,NPC誘導(dǎo)USC時間越長,所形成的NP-USC分化程度越高,且是否添加USC-EXO不影響NP-USC的分化程度,即USC-EXO可能不具有促進(jìn)NP-USC進(jìn)一步分化的能力。RT-qPCR和Western blot法檢測結(jié)果表明,USC在與NPC共培養(yǎng)的過程中逐漸向髓核樣細(xì)胞分化,USC與NPC共培養(yǎng)第14天時獲得的NP-USC既具有介于USC與NPC之間的增殖潛力,又能夠大量表達(dá)COL2、ACAN,更適合應(yīng)用于椎間盤組織工程。而CCK-8法檢測結(jié)果提示,USC-EXO可促進(jìn)USC、A組及B組細(xì)胞的增殖,但對NPC組與C組細(xì)胞增殖無促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果顯示,NPC誘導(dǎo)USC的時間越長,所形成的NP-USC分化程度越高,增殖速率越低。USC-EXO具有促NP-USC增殖的能力,但其不具有促分化的能力;NP-USC分化程度越高,USC-EXO的促增殖能力越低。本研究仍存在一定的局限性,例如雖已發(fā)現(xiàn)隨著NP-USC分化時間的延長,USC逐漸向髓核樣細(xì)胞分化,但對于植入椎間盤后如何控制NP-USC的分化趨勢及增殖速率,仍需后續(xù)實(shí)驗進(jìn)一步研究確定。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QYFYWZLL25665)。所有試驗過程均遵照《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：朱有福、李承威、沈娜娜參與了研究設(shè)計;朱有福、相宏飛、陳伯華、郭柱參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。