吳清蘭 鄧林 孫文靜 張麗 張金平 侯琳

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)藥學(xué)院;3 中國(guó)人民解放軍海軍第971醫(yī)院泌尿外科)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率正在逐年上升,嚴(yán)重威脅著女性的生命健康［1］。盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)步,但是乳腺癌患者的復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高［2］。因此,需要更全面地了解乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展的潛在機(jī)制,以確定乳腺癌特異性的生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn),改善乳腺癌的治療效果。核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)最早在酵母中被發(fā)現(xiàn),由203個(gè)氨基酸組成,也是真核生物的保守蛋白［3］。RRS1在核糖體生物發(fā)生中扮演重要的角色,此外,RRS1還與細(xì)胞有絲分裂、端粒聚集以及染色體重排密切相關(guān)［3］。RRS1基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致核糖體功能障礙,進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的合成。近幾年,多項(xiàng)研究表明RRS1在肝細(xì)胞癌［4］、結(jié)直腸癌［5］、宮頸癌［6］以及胃癌［7］等多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá),提示其可能作為癌基因促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RRS1在乳腺癌中高表達(dá),RRS1可以通過(guò)RPL11/MDM2/p53信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖［8-9］。另外有研究結(jié)果顯示,RRS1基因可以通過(guò)RPL11/c-Myc/SNAIL軸調(diào)節(jié)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。由此可見(jiàn),RRS1與乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān),但RRS1在乳腺癌中的作用及其機(jī)制尚不明確,相關(guān)方面的報(bào)道也甚少。本研究通過(guò)觀察敲降RRS1基因?qū)θ橄侔〣T549細(xì)胞增殖和遷移的影響,探討RRS1在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展中的潛在機(jī)制,以期能夠?yàn)槿橄侔┑脑\斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-10A、MDA-MB-468、BT-549和MCF-7均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(昆明)細(xì)胞庫(kù)。CCK8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,RRS1、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR抗體購(gòu)買(mǎi)于英國(guó)Abcam公司,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)以及GAPDH、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司,Trizoll Reagent、RNA定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,RRS1敲降慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7和MCF-10A細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清和青鏈霉素混合溶液(100 mg/L鏈霉素、100 mg/L青霉素)的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)換液傳代,培養(yǎng)兩代后,可進(jìn)行細(xì)胞凍存及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫熒光檢測(cè)RRS1在BT549細(xì)胞中的定位

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BT549細(xì)胞,接種于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中,待細(xì)胞貼壁且形態(tài)完全舒展時(shí),以40 g/L甲醛固定20 min,繼而以2 g/L的Triton X-100透化10 min,然后加入200 μL即用型山羊血清,室溫孵育30 min,PBST洗滌細(xì)胞3次。然后將細(xì)胞與RRS1(1∶200稀釋)一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,第2天,加入相應(yīng)種屬的熒光二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌細(xì)胞3次,后置于暗室室溫下用DAPI染色5 min,PBST洗滌3次,將爬片取出,用封片劑固定在載玻片上,在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.4 慢病毒感染BT549細(xì)胞

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BT549細(xì)胞,接種到6孔板(約1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)30%時(shí),分別感染陰性對(duì)照慢病毒(Con組)以及shRNA-RRS1慢病毒(sh-RRS1組),根據(jù)細(xì)胞的病毒感染復(fù)數(shù)值計(jì)算需要加入的病毒體積,將適量的病毒以及轉(zhuǎn)染試劑與1 mL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混勻,加入6孔板中,感染8～16 h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h以后,于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度,當(dāng)熒光強(qiáng)度達(dá)70%以上時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)量

當(dāng)穩(wěn)定生長(zhǎng)的MDA-MB-468、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231、MCF-10A細(xì)胞及慢病毒感染的兩組BT549細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%,吸棄原培養(yǎng)基,用PBS沖洗2次。加入含有10 g/L蛋白酶抑制劑和10 g/L磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液,在冰浴中裂解細(xì)胞30 min,收集細(xì)胞裂解液,用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將裂解得到的蛋白樣品加入適量的蛋白上樣緩沖液進(jìn)行蛋白變性,根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣體積。用含體積分?jǐn)?shù)0.10的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,恒壓80 V直至各孔樣本穿過(guò)濃縮膠,然后調(diào)整為恒壓120 V繼續(xù)電泳。直至指示劑遷移至凝膠底部,然后300 mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,并在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次,每次10 min,然后放置搖床上常溫孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入ELC顯色液顯影拍照。以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中RRS1 mRNA的表達(dá)

使用Trizol試劑提取穩(wěn)定感染的Con組和sh-RRS1組細(xì)胞總RNA,檢測(cè)并調(diào)整濃度,確保兩組濃度一致,每次反應(yīng)使用1 μg總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,按照試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行RT-qPCR,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,以2-△△CT法計(jì)算RRS1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物名稱(chēng)及其序列

1.7 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

將Con組和sh-RRS1組細(xì)胞,接種到96孔板(約2×103個(gè)細(xì)胞/孔)。分別于接種后第1、2、3、4、5天的10:00,將10 μL CCK8試劑與90 μL培養(yǎng)基混合,加入到有細(xì)胞的每個(gè)孔中,繼續(xù)孵育2 h,并使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值。

1.8 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

將Con組和sh-RRS1組細(xì)胞,分別接種于6孔板(約1×103個(gè)細(xì)胞/孔),每2～3 d根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行換液培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d或每個(gè)克隆均包含50個(gè)細(xì)胞以上時(shí),菌落用40 g/L甲醛固定,PBS沖洗2次,然后向每個(gè)孔中加入5 g/L的結(jié)晶紫500 μL染色30 min。用PBS洗凈后自然晾干,拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將Con組和sh-RRS1組細(xì)胞,分別接種于6孔板中(約2×105個(gè)細(xì)胞/孔),待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上且細(xì)胞為單層狀態(tài)后,使用200 μL移液器吸頭稍微刮擦單層, 形成均勻的無(wú)細(xì)胞傷口區(qū)域,向每孔中加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)第0、12、24 小時(shí)時(shí)用倒置顯微鏡拍照,計(jì)算第24小時(shí)時(shí)細(xì)胞遷移情況。

1.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

將Con組和sh-RRS1組細(xì)胞以每孔約2×105個(gè)細(xì)胞接種至小室中,加入含30 μL基質(zhì)凝膠(1∶8稀釋)的無(wú)血清培養(yǎng)基,并且確保小室的終體積為200 μL,下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)0.15血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24～48 h后,用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞,并將底部的侵襲細(xì)胞固定染色,用PBS清洗后自然晾干,在光學(xué)顯微鏡下成像并計(jì)數(shù)。

1.11 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中AKT-mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量

當(dāng)Con組和sh-RRS1組培養(yǎng)的細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí),吸棄原培養(yǎng)基,用PBS沖洗2次,用RIPA緩沖液裂解兩組細(xì)胞的總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。采用Western Blot方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中AKT、m-TOR、p-AKT、p-mTOR、VEGF以及HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)步驟同1.5。以GAPDH為內(nèi)參蛋白計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細(xì)胞系中RRS1表達(dá)量比較

Western Blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,正常MCF-10A與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468、MCF-7、MDA-MB-231、BT549細(xì)胞中的RRS1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.07、0.79±0.03、1.22±0.06、1.05±0.06、1.28±0.10。各組間比較差異有顯著性(F=48.92,P<0.05),其中4種乳腺癌細(xì)胞系中RRS1表達(dá)量顯著高于MCF-10A細(xì)胞系(P<0.05),4種乳腺癌細(xì)胞系之間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.2 RRS1在BT549細(xì)胞中的定位

免疫熒光染色顯示,RRS1主要在BT549細(xì)胞的細(xì)胞核和核仁表達(dá),細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)。見(jiàn)圖1。圖中綠色熒光染色的為RRS1。

圖1 RRS1在BT549細(xì)胞中的定位(免疫熒光染色,400倍)

2.3 慢病毒感染BT549細(xì)胞后RRS1表達(dá)量比較

Con組細(xì)胞中RRS1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.01、0.91±0.04,sh-RRS1組分別為0.27±0.04、0.51±0.02。兩組細(xì)胞中RRS1 mRNA和蛋白表達(dá)量比較差異均具有顯著性(t=32.04、15.09,P<0.05)。證明RRS1敲降成功。

2.4 RRS1對(duì)BT549細(xì)胞增殖能力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,時(shí)間、組別以及時(shí)間組別交互作用對(duì)細(xì)胞增殖能力均具有顯著影響(F時(shí)間=497.30,F組別=3 341.00,F交互=66.87,P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示,兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較差異具有顯著性(F=458.40、323.00,P<0.05),其中,與第1天相比,Con組和sh-RRS1組細(xì)胞其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)(P<0.05);與Con組相比,sh-RRS1組細(xì)胞在第4、5天的增殖能力明顯減弱(F=1 368.00、2 699.00,P<0.05),見(jiàn)表2。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Con組和sh-RRS1組集落形成數(shù)目分別為60.00±3.00、29.00±3.00,兩組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.86,P<0.05)。

表2 兩組細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力比較

2.5 RRS1對(duì)BT549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Con組和sh-RRS1組細(xì)胞從0 h至24 h的遷移率分別為0.48±0.05、0.19±0.02,兩組細(xì)胞的遷移能力比較差異具有顯著性(t=9.06,P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Con組和sh-RRS1組細(xì)胞遷移通過(guò)小室的數(shù)目分別為103.33±7.09、29.67±7.63,兩組細(xì)胞遷移通過(guò)小室的數(shù)目比較差異具有顯著性(t=12.24,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A:Con組,B:sh-RRS1組;結(jié)晶紫染色,200倍

2.6 RRS1對(duì)侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Con組相比,sh-RRS1組細(xì)胞中AKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)顯著性(P>0.05),p-AKT、p-mTOR、VEGF、HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均有顯著性(t=6.29～22.86,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組細(xì)胞中AKT-m-TOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量比較

3 討 論

近年來(lái),中國(guó)乳腺癌新發(fā)病例數(shù)呈不斷升高趨勢(shì)［11］,每年有超過(guò)16.9萬(wàn)女性患有乳腺癌［12］。盡管在治療干預(yù)方面取得了一定進(jìn)展,但大約有30%的早期乳腺癌患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移,5年相對(duì)生存率約為25%［13］。乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程極其復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。因此,更全面地了解乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展的潛在機(jī)制,尋找更有效的新的治療靶點(diǎn),對(duì)提高乳腺癌患者的生存率非常重要［14］。

RRS1是核糖體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)因子［3］。人類(lèi)RRS1基因位于染色體8q13.1上,僅包含一個(gè)外顯子［3］。RRS1在核糖體生物合成、赤道板染色體聚集和細(xì)胞周期端粒聚集中起重要作用［15-16］。RRS1通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在亨廷頓病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［17-18］。近幾年,RRS1基因在腫瘤中的作用逐漸受到關(guān)注。GAMBE等［15］發(fā)現(xiàn)RRS1蛋白有助于HeLa細(xì)胞的染色體聚集。WU等［5］發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,敲降RRS1基因通過(guò)阻滯G2/M期進(jìn)展和血管生成,進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。MA等［7］的研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中敲降RRS1基因可誘導(dǎo)凋亡并可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。YAN等［19］發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,敲降RRS1基因可通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。由此可以推測(cè),RRS1基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合高內(nèi)涵篩選技術(shù)篩選出與乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的RRS1基因,并首次報(bào)道了RRS1在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用［8-9］。但目前關(guān)于RRS1基因與乳腺癌相關(guān)研究仍較少。

為了探索RRS1在乳腺癌細(xì)胞中的潛在作用,本研究首先使用Western Blot實(shí)驗(yàn)分析比較RRS1在MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞系中的表達(dá)量,結(jié)果顯示這4種乳腺癌細(xì)胞系的RRS1蛋白表達(dá)量顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A。進(jìn)一步選擇RRS1高表達(dá)的BT549細(xì)胞以求明確RRS1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)位置。免疫熒光染色顯示,RRS1主要在BT549細(xì)胞的細(xì)胞核和核仁表達(dá),細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)。為進(jìn)一步探討RRS1基因在乳腺癌細(xì)胞中作用機(jī)制,本研究使用shRNA-RRS1慢病毒感染了BT549細(xì)胞,RT-qPCR以及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒對(duì)RRS1基因的敲降效果,結(jié)果顯示敲降RRS1基因顯著降低了BT549細(xì)胞RRS1 mRNA和蛋白的表達(dá)量。進(jìn)一步研究顯示,敲降RRS1抑制了BT549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果均提示RRS1在乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。

AKT/mTOR通路是一種經(jīng)典的信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞增殖、代謝和運(yùn)動(dòng)等調(diào)控至關(guān)重要［20］。AKT/mTOR通路在多種癌癥中處于異常的高激活狀態(tài),且與臨床的不良預(yù)后有關(guān),在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管新生等方面發(fā)揮有關(guān)鍵作用［21-22］,同時(shí)其異常激活還會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和糖酵解,干預(yù)該通路的激活對(duì)于乳腺癌治療提供了新的思路［23］。因此,本研究進(jìn)一步分析了RRS1對(duì)該通路的調(diào)控作用,敲降RRS1基因不影響AKT、mTOR的總蛋白水平,但可以明顯抑制BT549細(xì)胞AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平,提示RRS1基因很可能直接或間接激活A(yù)KT/mTOR相關(guān)信號(hào)通路。血管生成對(duì)于惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后均具有極其重要的意義［24］。HIF-1α是調(diào)節(jié)血管生成的重要因子,能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)［25］。由于Akt/mTOR通路是一種調(diào)節(jié)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的經(jīng)典通路,所以進(jìn)一步探討RRS1是否通過(guò)調(diào)控AKT/mTOR通路影響下游HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)敲降RRS1基因通過(guò)抑制AKT/mTOR的激活,抑制了下游HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制了BT549細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述,RRS1在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá),在細(xì)胞核和胞漿都有定位,敲降RRS1通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路及其下游蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此,RRS1可能是乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。然而,該研究?jī)H限于細(xì)胞水平,后續(xù)還需要對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更深入和更全面的探討。

作者聲明：吳清蘭、鄧林、張金平、侯琳、孫文靜和張麗參與了研究設(shè)計(jì);吳清蘭、侯琳和張金平參與了論文的寫(xiě)作及修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。