李棟 安毅

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,山東 青島 266003; 2 臨沂市人民醫(yī)院急診內(nèi)科)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是由多種因素參與的動脈血管的慢性炎癥性疾?。?］。巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。斑塊中的巨噬細(xì)胞可根據(jù)局部微環(huán)境的變化呈現(xiàn)不同的表型,其中M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎因子,加速斑塊進(jìn)展,并使斑塊不穩(wěn)定性增高;M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子,可抑制AS進(jìn)展［2］。因此,如何抑制巨噬細(xì)胞M1極化或促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化,對于減輕斑塊炎癥反應(yīng)、促進(jìn)斑塊穩(wěn)定意義重大。

普羅布考具有抗氧化和調(diào)血脂的作用,臨床上主要用于高脂血癥和AS治療［3］。另外普羅布考還具有減輕同型半胱氨酸引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、抑制血管彈性纖維降解、抑制白細(xì)胞黏附、抑制樹突狀細(xì)胞活化以及改善內(nèi)皮功能等作用［4-8］。但普羅布考能否調(diào)控動脈中巨噬細(xì)胞極化尚無研究報(bào)道。本研究通過構(gòu)建AS小鼠模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),旨在揭示普羅布考對AS進(jìn)展的影響,并從巨噬細(xì)胞極化角度探討普羅布考影響AS進(jìn)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級健康雄性ApoE-/-小鼠20只,8周齡,品系背景為C57BL/6J,健康雄性C57BL/6J小鼠10只,8周齡,均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,均于恒溫恒濕及晝夜交替環(huán)境中飼養(yǎng)。普羅布考購自美國Sigma公司,ELISA試劑盒購自美國RD公司,一抗α-SMA、CD86購自美國CST公司,MOMA-2購自美國Bio-Rad公司,iNOS、IL-1β購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 20只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對照組和普羅布考組,每組10只。兩組小鼠均以高脂飼料喂養(yǎng)12周后,普羅布考組小鼠隔日1次灌胃普羅布考(30 mg/kg),對照組隔日1次灌胃等劑量的生理鹽水,均灌胃12周。

1.2.2兩組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)檢測 灌胃12周后,腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉兩組小鼠,心尖取血,離心以后采用全自動生化檢測儀檢測血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、尿酸(UA)含量及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平,采用ELISA法檢測血清中炎性因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平,檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。頸椎脫臼法處死小鼠后開胸取主動脈血管(包括主動脈弓及分支部分),置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定。隨機(jī)取每組5只小鼠的主動脈血管,進(jìn)行油紅O染色,檢測斑塊面積,計(jì)算斑塊面積占血管壁總面積百分比。取每組另外5只小鼠的動脈血管,OCT包埋,制備5～6 μm厚冷凍切片,使用油紅O染色檢測主動脈根部切片中斑塊面積大小,以Masson染色法檢測斑塊穩(wěn)定性,采用組織免疫熒光方法檢測兩組小鼠動脈斑塊中的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、膠原纖維以及巨噬細(xì)胞M1極化情況,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測兩組小鼠主動脈斑塊中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平,檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.2.3小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞提取和分組 8周齡雄性C57BL/6J小鼠10只,頸椎脫臼法處死后,立即浸于含體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇中2 min。然后在小鼠腹部剪一小口,充分暴露腹膜,使用無菌注射器向腹腔注入約10 mL預(yù)冷的無菌PBS,使腹腔內(nèi)充滿PBS;反復(fù)抽打腹腔PBS后,以無菌注射器將腹腔懸液移至另一無菌管中,以800 r/min離心5 min;棄掉PBS,并使用含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞;置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長融合度約75%時(shí),PBS清洗1次,更換新鮮含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng),獲得小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞。

將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞分為兩組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,結(jié)果取平均值,其中對照組的巨噬細(xì)胞以LPS(100 μg/L)+INF-γ(20 μg/L)處理24 h;普羅布考組的巨噬細(xì)胞以普羅布考(10 μmol/L)+LPS(100 μg/L)+IFN-γ(20 μg/L)處理24 h。然后采用ELISA方法檢測兩組巨噬細(xì)胞中的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4RT-qPCR方法檢測各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、CD86和iNOSmRNA的相對表達(dá)水平分別取對照組、普羅布考組小鼠主動脈根部血管和巨噬細(xì)胞,后分別加入1 mL TRIzol試劑,根據(jù)試劑盒說明書要求提取總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,條件為42 ℃ 30 min,95 ℃ 2 min。根據(jù) SYBR GREEN 染料試劑盒說明書要求,以cDNA模板為底物進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系的總體積為 15 μL,其中引物1 μL,cDNA 模板1 μL,SYBR GREEN染料5.5 μL和去離子水7.5 μL。以β-actin為內(nèi)參照,根據(jù)2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司提供,引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 普羅布考對ApoE-/-小鼠血脂和肝腎功能的影響

與對照組小鼠相比較,普羅布考組小鼠血清中的TG、TC及LDL-C水平均明顯下降(t=2.445～4.024,P<0.05),其他指標(biāo)比較差異均無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠血清血脂和肝腎功能指標(biāo)比較

2.2 普羅布考對ApoE-/-小鼠AS斑塊面積和穩(wěn)定性的影響

主動脈血管油紅O染色顯示,對照組和普羅布考組小鼠的斑塊面積與血管壁總面積比值分別為(27.40±0.02)%和(17.40±0.02)%,兩組比較差異有顯著性(t=3.599,P<0.05)。主動脈根部切片油紅O染色顯示,對照組和普羅布考組小鼠斑塊面積分別為(35.40±4.18)、(21.80±1.93)mm2,兩組比較差異具有顯著性(t=2.954,P<0.05);與對照組相比,普羅布考組小鼠主動脈根部斑塊中脂質(zhì)明顯減少(圖1A、B)。Masson染色結(jié)果顯示,與對照組進(jìn)行比較,普羅布考組小鼠的主動脈根部斑塊中膠原纖維明顯增多(圖1C、D)。免疫熒光染色顯示,與對照組相比,普羅布考組小鼠的主動脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞(MAMO-2)明顯減少,斑塊纖維帽處平滑肌細(xì)胞(α-SMA)和膠原纖維均明顯增多(圖2),圖中紅色為巨噬細(xì)胞,綠色為平滑肌細(xì)胞以及膠原纖維。

A、B:主動脈根部切片油紅O染色(紅色表示脂質(zhì)含量),C、D:主動脈根部切片Masson染色(藍(lán)色表示膠原纖維含量),100倍

A、B:對照組,C:對照組融合圖,D、E:普羅布考組,F:普羅布考組融合圖;組織免疫熒光法,200倍

2.3 普羅布考對ApoE-/-小鼠血清和動脈斑塊中炎性因子的影響

與對照組相比,普羅布考組小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低(t=2.388～4.891,P<0.05);主動脈斑塊中IL-1β、IL-6以及TNF-α mRNA的表達(dá)水平亦明顯降低,差異具有顯著性(t=3.060～4.507,P<0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠動脈斑塊和血清炎性因子水平變化比較

2.4 普羅布考對小鼠巨噬細(xì)胞M1極化的影響

與對照組相比較,普羅布考組中MOMA-2+和iNOS+細(xì)胞數(shù)量及其比例明顯減少,見圖3。圖中綠色為MOMA-2,紅色為巨噬細(xì)胞M1極化標(biāo)志物iNOS。

A、B:對照組,C:對照組融合圖;D、E:普羅布考組,F:普羅布考組融合圖;組織免疫熒光法,400倍

ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,普羅布考組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯減低(t=4.238～9.580,P<0.05);RT-qPCR檢測結(jié)果也顯示,巨噬細(xì)胞的M1極化標(biāo)志物CD86、iNOS和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平亦均明顯降低(t=3.251～36.190,P<0.05)。見表4。

表4 小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞M1極化標(biāo)志物及上清炎性因子水平變化比較

3 討 論

AS是一種涉及多種細(xì)胞和多種生物學(xué)過程的復(fù)雜病變。當(dāng)各種因素誘導(dǎo)血管發(fā)生AS時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,白細(xì)胞黏附到受損處,進(jìn)而通過內(nèi)皮間隙浸潤至血管內(nèi)膜。內(nèi)膜中的單核細(xì)胞進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞,可吞噬修飾的低密度脂蛋白及凋亡細(xì)胞等,變成泡沫細(xì)胞［9］。泡沫細(xì)胞是AS的特征性細(xì)胞［10］。泡沫細(xì)胞后期發(fā)生凋亡壞死,釋放脂質(zhì)和各種抗原,構(gòu)成了斑塊的壞死核心,加劇斑塊的炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞或泡沫細(xì)胞可分泌大量的炎性因子、趨化因子和基質(zhì)金屬酶,一方面會招募更多的白細(xì)胞浸潤,另一方面會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和功能學(xué)改變,如內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換,此外基質(zhì)金屬酶會直接降解膠原纖維,導(dǎo)致斑塊纖維帽變薄,易于破裂。

巨噬細(xì)胞極化與AS發(fā)生關(guān)系密切。斑塊中的多種成分比如膽固醇結(jié)晶、氧化LDL-C、TNF-α以及微修飾LDL-C均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化［9-11］。M1型巨噬細(xì)胞與斑塊發(fā)生、發(fā)展及不穩(wěn)定有關(guān)。M1 型巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β一方面增加LDL跨內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜中,促進(jìn)了AS的進(jìn)展［11］;另一方面導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,內(nèi)皮一氧化氮合酶表達(dá)降低,引起內(nèi)皮功能紊亂,加速AS的進(jìn)展［11］。其次,M1 型巨噬細(xì)可引起平滑肌細(xì)胞凋亡,使動脈中膜變薄,血管重構(gòu)。最后,M1 型巨噬細(xì)胞大量分泌基質(zhì)金屬蛋白酶,降解膠原纖維,使纖維帽變薄,易于發(fā)生斑塊破裂［12］。

普羅布考具有多重藥理學(xué)效應(yīng),包括調(diào)脂、抗炎、抗氧化及改善血管內(nèi)皮功能等,在臨床上多用于AS性心血管疾病的防治［13-16］。近年來研究還發(fā)現(xiàn)了普羅布考的多種生物學(xué)作用,如普羅布考可逆轉(zhuǎn)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的單核細(xì)胞分化和氧化應(yīng)激［4］,抑制鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠CD11c+樹突狀細(xì)胞的免疫成熟［7］,抑制脂多糖誘導(dǎo)的白細(xì)胞黏附［6］,抑制血管彈性纖維降解等［5］。但是,普羅布考能否調(diào)控巨噬細(xì)胞極化尚不清楚。

本研究探討了普羅布考對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠AS的影響及對斑塊中巨噬細(xì)胞極化的影響。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該濃度的普羅布考干預(yù)未對小鼠的肝腎功造成損害,經(jīng)普羅布考治療能降低小鼠血脂水平,減小AS斑塊面積,使得斑塊更加穩(wěn)定,降低全身和斑塊中炎性因子水平;更重要的是,普羅布考抑制了斑塊中巨噬細(xì)胞M1極化,表現(xiàn)為多種M1極化標(biāo)志物例如CD86、iNOS、IL-1β的mRNA水平均明顯降低。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)一步驗(yàn)證了普羅布考對巨噬細(xì)胞M1極化的調(diào)控作用。由此,我們揭示了普羅布考通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)從而抑制AS的新機(jī)制。

本課題尚有一些局限性。首先,本研究雖然發(fā)現(xiàn)了普羅布考可抑制巨噬細(xì)胞M1極化,但沒有闡明普羅布考調(diào)控M1極化的分子機(jī)制。其次,普羅布考能否調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化尚不清楚。再者,普羅布考調(diào)控的巨噬細(xì)胞M1極化在多大程度上影響AS仍需研究。最后,在臨床上服用普羅布考能否減輕AS患者斑塊中巨噬細(xì)胞M1極化亦需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究探討了普羅布考對ApoE-/-小鼠AS的影響,結(jié)果顯示普羅布考可延緩小鼠AS進(jìn)展并促進(jìn)斑塊穩(wěn)定,其機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞M1極化、減輕斑塊炎癥反應(yīng)有關(guān)。

倫理批準(zhǔn)和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號AHQU-MAL20190510)。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理原則》的條例進(jìn)行。

作者聲明：李棟、安毅參與了研究設(shè)計(jì)和論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。