仇碧茹 侯琳 張麗 牛婷婷 宋軍瑩

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)藥學(xué)院; 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科)

神經(jīng)母細胞瘤起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)［1-2］,常用的治療手段有化療、手術(shù)切除、高劑量化療聯(lián)合自體干細胞挽救(ASCR)等［3］。然而臨床常用的化學(xué)合成藥物具有毒副作用大、治療效果不佳且伴有明顯的骨髓抑制等缺點［4］,從而限制了這些化學(xué)合成藥物的臨床應(yīng)用。

吲哚-2,3-二酮(ISA)是天然存在于自然界的吲哚類化合物,是我國獨創(chuàng)Ⅰ類天然抗癌新藥靛玉紅的單體結(jié)構(gòu),具有抗病毒、抗腫瘤等作用［5-7］。Janus激酶(JAK)屬于酪氨酸激酶家族,由TYK2、JAK1、JAK2、JAK3 4個成員組成。JAK2作為多種生長因子和細胞因子激活信號通路的調(diào)節(jié)器,在多種細胞類型中高表達［8］。研究發(fā)現(xiàn),激活JAK2/STAT3信號通路可促進多種人類腫瘤如膠質(zhì)母細胞瘤、肺癌、肝癌等的發(fā)生和進展［9-10］,阻斷該通路可抑制細胞增殖,并誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡［11-13］。本研究通過探討ISA對神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞抗腫瘤的作用及機制,旨在為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供有益的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體

神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中科院上海細胞庫,ISA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;GAPDH抗體、p-JAK2抗體、p-STAT3抗體、Bax抗體、Bcl2抗體購買于英國Abcam公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒、PI染色液、牛血清白蛋白(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

使用DMEM高糖培養(yǎng)基+體積分數(shù)0.10的胎牛血清+青鏈霉素混合溶液(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)配置完全培養(yǎng)基,然后將SH-SY5Y細胞養(yǎng)于含有完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中,并置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞進入對數(shù)生長期后,進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板中,每孔1 000～2 000個細胞,向每孔中加入含不同濃度 (0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L) ISA的完全培養(yǎng)基,放入37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測量波長450 nm的各孔吸光度(A)值,計算不同濃度下細胞活力及半致死濃度(IC50值)。

1.4 平板克隆實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞克隆形成能力的影響

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于6孔板中,每孔約500個細胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周,孔中可見克隆形成時終止培養(yǎng)。甲醇固定細胞15 min,棄固定液,結(jié)晶紫染色細胞10 min,洗去染色液,自然風(fēng)干。肉眼計數(shù)克隆數(shù),計算克隆形成率。

1.5 劃痕實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞遷移能力的影響

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于內(nèi)含完全培養(yǎng)基的6孔板中,每孔約50 000個細胞,當(dāng)細胞融合度約為90%時,用200 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板進行劃痕。用PBS清洗細胞3次后,每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基,并分別加入含有0、50、100及200 μmol/L ISA(A～D組)無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于第0、12、24和48小時時顯微鏡下拍照,計算劃痕面積。

1.6 ISA對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞,接種于6孔板中,每孔約10 000個細胞,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組),培養(yǎng)48 h后。按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的操作要求,用流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測,并計算細胞凋亡率。

1.7 ISA對SH-SY5Y細胞周期的影響

將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組)的完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,按照PI染色試劑盒說明書對細胞進行處理,用流式細胞儀進行細胞周期的檢測,計算G1期細胞構(gòu)成比。

1.8 Western blot 實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白相對表達量的影響

收集終濃度為0、50、100、200 μmol/L ISA處理48 h后的SH-SY5Y細胞(A～D組),RIPA裂解液處理后提取總蛋白,BCA法測蛋白濃度后進行電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜后用封閉液室溫封閉2 h,TBST清洗3次,一抗孵育過夜,TBST清洗3次,二抗孵育1 h。按ECL發(fā)光液說明書孵育PVDF膜,成像儀顯影并拍照。以GAPDH的條帶結(jié)果為內(nèi)參照,將目的蛋白與內(nèi)參的條帶進行比較,以計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響及其IC50值

CCK-8實驗結(jié)果顯示,以終濃度為0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L的ISA處理SH-SY5Y細胞48 h以后,SH-SY5Y細胞的細胞活力分別為(100.00±0.73)%、(97.56±0.58)%、(95.10±0.55)%、(90.00±1.04)%、(86.62±0.39)%、(84.29±0.77)%、(80.26±0.93)%、(69.97±0.91)%、(62.71±1.04)%、(57.48±1.04)%、(40.33±1.04)%、(22.68±0.79)%,隨著ISA濃度的遞增,SH-SY5Y細胞的活力逐漸下降(F=1 632.62,P<0.05)。計算得到ISA作用SH-SY5Y細胞48 h后的IC50值為300 μmol/L,小于IC50值的濃度對細胞沒有毒性,故后續(xù)的實驗選用的ISA濃度為0、50、100、200 μmol/L。

2.2 各組SH-SY5Y細胞集落形成能力的比較

平板克隆實驗的結(jié)果顯示,A～D組的克隆形成率分別為(100.00±1.99)%、(79.88±1.32)%、(52.82±1.09)%、(25.75±1.08)%,隨著ISA濃度的增加,SH-SY5Y細胞的集落形成能力逐漸下降(F=1 038.21,P<0.05),各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=11.91～46.43,P<0.05)。

2.3 各組SH-SY5Y細胞遷移能力的比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示,組別、時間及組別和時間的交互作用對SH-SY5Y細胞遷移能力均具有明顯影響(F組別=379.00,F時間=291.00,F組別*時間=2.84,P<0.05);單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示,隨著時間的延長,A～D組SH-SY5Y細胞的遷移能力逐漸增強(F=94.83～153.77,P<0.05),同一組內(nèi)不同時間點兩兩比較差異均具有顯著性(t=5.90～23.14,P<0.05),不同時間點各組之間整體比較差異有顯著性(F=39.87～222.00,P<0.05),各組之間兩兩比較差異也具有顯著意義(t=3.57～34.28,P<0.05)。見表1。

表1 各組SH-SY5Y細胞遷移率比較

2.4 各組SH-SY5Y細胞凋亡率的比較

檢測結(jié)果顯示,A～D組的凋亡率分別為(4.29±0.17)%、(6.16±0.21)%、(8.74±0.34)%、(17.01±0.51)%,隨著ISA濃度的升高,細胞的凋亡率逐漸升高(F=557.71,P<0.05),各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=9.06～33.41,P<0.05)。

2.5 各組SH-SY5Y細胞中G1期細胞構(gòu)成比比較

檢測結(jié)果顯示,A～D組的G1期細胞構(gòu)成比分別為(35.33±1.17)%、(42.59±0.13)%、(54.04±0.21)%、(58.09±0.13)%,隨著ISA濃度的升高,SH-SY5Y細胞G1期細胞構(gòu)成比顯著性增高(F=632.38,P<0.05),各組間兩兩比較差異具有顯著性(t=8.67～123.68,P<0.05)。

2.6 各組SH-SY5Y細胞中Bax、Bcl2及p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量比較

實驗結(jié)果顯示,A～D組Bax的蛋白相對表達量隨ISA濃度的增高明顯升高(F=464.50,P<0.05),而p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白相對表達量隨ISA濃度的升高明顯降低(F=286.56～541.13,P<0.05),各組間兩兩比較,上述4種蛋白的表達差異均具有顯著性(t=5.75～50.46,P<0.05)。見表2。

表2 各組SH-SY5Y細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白的相對表達量比較

3 討 論

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個高度有序、非隨機、器官選擇性的過程,涉及一系列復(fù)雜的步驟［14］。神經(jīng)母細胞瘤的相關(guān)性死亡大多數(shù)發(fā)生于淋巴結(jié)和骨骼轉(zhuǎn)移［15］。因此,抑制癌細胞侵襲和遷移對于腫瘤的治療至關(guān)重要［16］。

隨著細胞生物學(xué)、腫瘤基因?qū)W研究的不斷深入,尋找作用效果好、毒副作用低、特異性強的新型抗腫瘤藥物已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研究的重要發(fā)展方向。近年來,全球的目光紛紛聚集于能夠直接靶向作用腫瘤細胞、對正常細胞損傷較小的天然小分子化合物類藥物(如長春堿、長春新堿等)的研究。ISA作為天然吲哚類化合物［16］,具有多種藥理學(xué)活性,如神經(jīng)保護、抗菌和抗病毒等活性［17］。既往研究發(fā)現(xiàn),ISA還具有促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用［18-20］。

JAK2是一種廣泛表達的非受體蛋白酪氨酸激酶,可作為多種生長因子(包括白細胞介素、干擾素、生長激素、促紅細胞生成素和瘦素)和細胞因子受體激活的信號通路的調(diào)節(jié)器。JAK2可由多種細胞因子(包括生長激素、干擾素γ)、生長因子(包括EGF和PDGF)和GPCR配體激活,并參與細胞的增殖與遷移。

JAK2激活STAT3后,被激活的STAT3轉(zhuǎn)移到細胞核中,進一步激活各種靶基因的轉(zhuǎn)錄［21-23］。STAT3作為眾多致癌信號通路的匯合點,在腫瘤形成中發(fā)揮著重要的作用。大量證據(jù)表明STAT3可參與細胞凋亡以及腫瘤細胞的增殖和侵襲［1］。既往的研究表明,在神經(jīng)母細胞瘤中,腫瘤細胞的遷移可能與p-STAT3的表達下降有關(guān)［24］。p-STAT3是STAT3的活化形式,異常的STAT3信號傳導(dǎo)是腫瘤惡性進展的關(guān)鍵過程,并由JAK2誘導(dǎo)［24］。

針對神經(jīng)母細胞瘤增殖能力強、易轉(zhuǎn)移的特性,本研究對ISA在神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中的抑制作用進行了深入探究。通過CCK-8實驗檢測不同濃度ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響,結(jié)果顯示隨著ISA濃度的升高,SH-SY5Y細胞活力逐漸下降,計算得出ISA作用于SH-SY5Y細胞48 h的IC50值為300 μmol/L,小于IC50值的濃度對細胞沒有毒性,因此選用0、50、100、200 μmol/L為后續(xù)實驗的濃度。本研究采用平板克隆實驗、劃痕實驗分別檢測ISA對SH-SY5Y細胞克隆形成能力和遷移能力的影響,結(jié)果顯示不同濃度的ISA處理SH-SY5Y細胞后,隨著ISA濃度的增加,細胞的克隆形成率和遷移率均明顯下降,這表明ISA顯著抑制了SH-SY5Y細胞的克隆形成能力和遷移能力。當(dāng)腫瘤細胞的凋亡機制被破壞,細胞生長不再受到限制時,腫瘤便會隨之發(fā)生和發(fā)展。若能夠重新激活腫瘤細胞的凋亡機制,就有望實現(xiàn)治療腫瘤的目標(biāo)。細胞周期在抗癌藥物篩選中是一個主要的關(guān)注點,細胞生長需要經(jīng)歷G1、S、G2與M期,細胞從G1進入S期為關(guān)鍵點,決定了細胞周期能否繼續(xù)。為了探究ISA對SH-SY5Y細胞的凋亡和細胞周期的影響,本研究采用Annexin V-FITC/PI試劑和PI染色流式細胞儀分別檢測ISA對SH-SY5Y細胞的凋亡和細胞周期的影響,結(jié)果顯示不同濃度的ISA作用于SH-SY5Y細胞后,隨著ISA濃度的增高,SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯升高,且G1期細胞構(gòu)成比顯著增高。Bax和Bcl2同屬于Bcl2家族,Bax為促細胞凋亡的因子,而Bcl2為抗細胞凋亡因子,均為參與細胞凋亡的重要生物學(xué)因子。JAK2、STAT3作為JAK2/STAT3通路的重要成員,p-JAK2以及p-STAT3的表達水平變化可反映ISA能否通過此信號通路發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用。本研究Western blot實驗結(jié)果表明,SH-SY5Y細胞中的Bax的蛋白相對表達量隨ISA濃度的增高明顯升高,而p-JAK2、p-STAT3和Bcl2蛋白相對表達量隨ISA濃度的升高明顯下降,表明ISA可以促進Bax蛋白表達,同時抑制p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白的表達。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,ISA對神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的增殖與遷移具有顯著的抑制作用,其抑制作用可能是通過JAK2/STAT3通路實現(xiàn)。ISA有望為神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療提供新的思路,具有樂觀的應(yīng)用前景。

作者聲明：仇碧茹、侯琳、張麗參與了研究設(shè)計;仇碧茹、牛婷婷、宋軍瑩參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。