劉穎 尹園緣 鄒巍瑩 黃靜雯 程揚 賓東華 詹敏

〔摘要〕 目的 探討象皮生肌膏對肛瘺術(shù)后模型大鼠創(chuàng)面凋亡因子胱天蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease， Caspase）的影響。方法 36只SD大鼠建立肛瘺模型后，隨機選取27只肛瘺大鼠構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型，隨機分為象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組，每組9只，剩余9只肛瘺大鼠為假手術(shù)組。象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組使用生理鹽水沖洗創(chuàng)面后外敷相應(yīng)藥物，模型組僅使用生理鹽水沖洗創(chuàng)面，假手術(shù)組無特殊處理，每日1次，連續(xù)干預(yù)10 d。造模后3、5、7、10 d，觀察創(chuàng)面愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率。藥物干預(yù)10 d后，從各組取創(chuàng)面組織，HE染色觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)變化，TUNEL法檢測創(chuàng)面組織中細胞凋亡數(shù)目，免疫組織化學(xué)法檢測創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白的表達。結(jié)果 與模型組相比，象皮生肌膏組在干預(yù)后3、5、7、10 d時創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P<0.05，P<0.01），濕潤燒傷膏組在干預(yù)后5、7、10 d時創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P<0.05，P<0.01），而象皮生肌膏組創(chuàng)面愈合率在干預(yù)后7、10 d均明顯高于濕潤燒傷膏組（P<0.01）。與假手術(shù)組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組細胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平均顯著下降（P<0.01）;與濕潤燒傷膏組比較，象皮生肌膏組細胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平均顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 象皮生肌膏能通過抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織細胞凋亡，抑制凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12的表達，促進創(chuàng)面愈合。

〔關(guān)鍵詞〕 肛瘺;象皮生肌膏;創(chuàng)面;細胞凋亡;胱天蛋白酶;濕潤燒傷膏

〔中圖分類號〕R269? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.003

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Xiangpi Shengji Ointment （XPSJO） on cysteine aspartic acid-specific protease （Caspase） in wound surface of model rats after anal fistula operation. Methods After establishing the anal fistula models in 36 SD rats， 27 anal fistula rats were randomly selected to construct wound models after anal fistula operation， then they were randomly divided into XPSJO group， Moisture Exposed Burn Ointment （MEBO） group and model group， with 9 rats in each group. The remaining 9 ones were taken as sham operation group. The XPSJO group and MEBO group were applied with corresponding drugs externally after wound irrigation with normal saline. Wound irrigation with normal saline was performed on model group， while there was no special treatment for the rats in sham operation group. All the above interventions were performed once a day， for 10 consecutive days. On the 3rd， 5th， 7th， and 10th day after modeling， the wound healing was observed and the wound healing rate was calculated. After 10 days of drug intervention， wound tissue were taken from each group. The histopathological changes of wound tissue were observed by HE staining， the number of cell apoptosis in wound tissue was determined by TUNEL method， and the expressions of Caspase-3， Caspase-7， Caspase-9 and Caspase-12 proteins in wound tissue were measured by immunohistochemistry. Results Compared with model group， the wound healing rate of XPSJO group was higher on the 3rd， 5th， 7th， and 10th day after intervention （P<0.05， P<0.01）， and that of MEBO group was significantly higher on the 5th， 7th and 10th day after intervention （P<0.05， P<0.01）. Moreover， the wound healing rate of XPSJO group was significantly higher than that of the MEBO group on the 7th and 10th day after drug intervention （P<0.01）. Compared with sham operation group， the apoptosis rate and expression levels of Caspase-3， Caspase-7， Caspase-9， and Caspase-12 proteins in wound tissue of XPSJO， MEBO and model groups were significant higher （P<0.01， P<0.01）. Compared with model group， the apoptosis rate and expression levels of Caspase-3， Caspase-7， Caspase-9， and Caspase-12 proteins in XPSJO group and MEBO group were significantly lower （P<0.0， P<0.01）. Compared with MEBO group， the apoptosis rate and expression levels of Caspase-3， Caspase-7， Caspase-9， and Caspase-12 proteins in XPSJO group were significantly lower （P<0.01， P<0.01）. Conclusion XPSJO can promote wound healing by inhibiting the apoptosis of wound tissue after anal fistula operation as well as the expressions of apoptosis-related factors， including Caspase-3， Caspase-7， Caspase-9， and Caspase-12.

〔Keywords〕 anal fistula; Xiangpi Shengji Ointment; wound surface; apoptosis; cysteine aspartic acid specific protease; Moisture Exposed Burn Ointment

肛瘺又稱肛管直腸瘺，是指因感染、損傷等因素所形成的與肛周皮膚相通的病理性通道，是臨床最常見的肛門直腸疾病之一，80%以上因肛門直腸周圍膿腫破潰或切開引流后所導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為肛周腫痛、流膿、瘙癢等，具有反復(fù)發(fā)作及難以自愈的特點[1]。手術(shù)是治療肛瘺的首選方法，但由于部位的特殊性，肛瘺術(shù)后切口多不縫合，創(chuàng)面易受污染，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合緩慢，對患者的生理、心理、經(jīng)濟等均帶來了負擔[2]。因此，如何促進肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合是肛腸外科亟待解決的重點問題。細胞凋亡是人體的一種重要生理現(xiàn)象，與組織細胞再生關(guān)系密切[3-4]。已有證據(jù)表明，細胞凋亡參與到傷口愈合的調(diào)節(jié)，在各個階段均發(fā)揮重要作用，在傷口愈合過程中，細胞凋亡通過平衡細胞增殖，清除已發(fā)揮作用的炎癥細胞、成纖維細胞等各類細胞，使得肉芽組織逐漸演變?yōu)轳：劢M織，以使傷口愈合[5-6]。細胞凋亡不僅決定著創(chuàng)面愈合的快慢，在創(chuàng)面異常愈合中也具有重要意義[7]。

象皮生肌膏最早見于《瘍科綱要》，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在其基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代工藝，進一步化裁，制作成中醫(yī)外科常用膏劑，具有清熱解毒、活血化瘀、祛腐生肌之功效。本課題組前期研究[8-11]已證實，象皮生肌膏能減輕肛瘺患者術(shù)后疼痛、水腫等，明顯縮短創(chuàng)面修復(fù)時間，生肌效果顯著。本研究以細胞凋亡為切入點，探討象皮生肌膏對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面及凋亡因子胱天蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease， Caspase）的影響，分析相關(guān)作用機制，為象皮生肌膏促傷口愈合提供實驗證據(jù)。

1 材料

1.1? 藥物

象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，批號：20211212）;濕潤燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司，批號：2107403G）。

1.2? 動物

36只SPF級健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。所有動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。本研究方案獲湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：ZYFY20211104-04）。

1.3? 主要試劑

Caspase-3抗體、Caspase-7抗體、Caspase-9抗體、Caspase-12抗體（湖南豐暉生物科技有限公司，批號分別為Fab1924、Fab1932、Fab1945、Fab1915）;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG、山羊抗小鼠二抗、DAB顯色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GB23303、GB23302、G1214-100UL、G1212-200T）;TUNEL試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1090）;HE染色液（廣州維格斯生物科技有限公司，批號：3201121）。

1.4? 主要儀器

生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JK-6）;生化培養(yǎng)箱（上海一恒儀器公司，型號：LRH）;石蠟切片機（德國萊卡公司，型號：RM2235）;全自動病理切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司，型號分別為Pannoramic MIDI Ⅱ）。

2 方法

2.1? 肛瘺模型的建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，36只SD大鼠參照RS等[12]的造模方法，加以改進，進行肛瘺的造模。造模前禁食、禁水24 h，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，使用脫毛膏將每只大鼠肛周毛發(fā)脫除，后使用0.1%強力碘溶液消毒肛周手術(shù)區(qū)域。大鼠以俯臥位，采用時鐘定位法（以大鼠尾根部為12點位，會陰部為6點位）造模，將50 mL注射器針頭由大鼠肛門內(nèi)進入，穿過肛門括約肌，從肛門9點位距肛緣約1 cm皮膚穿出，隨后退出針頭，將直徑2 mm的鋼絲沿針頭所致的通道穿入，將鋼絲兩端扭轉(zhuǎn)固定，放置30 d，期間自由飲食。30 d后麻醉下取出大鼠肛周鋼絲，于鋼絲貫通位置可觸及條索樣物，證明造模成功。

2.2? 肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型的建立

觀察30 d后隨機選取27只肛瘺模型大鼠，術(shù)前24 h禁食、禁水，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，使用0.1%強力碘溶液消毒肛周手術(shù)區(qū)域，沿鋼絲進行“瘺管切除術(shù)”，術(shù)后使用無菌棉球壓迫止血10 min，創(chuàng)面不縫合，保持開放，將大鼠放回籠子，自由飲食。剩余9只肛瘺模型大鼠不予以特殊處理。

2.3? 分組及給藥

將27只肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型SD大鼠隨機分為3組：象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組，每組9只;剩余9只肛瘺模型大鼠為假手術(shù)組。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型建立24 h后開始創(chuàng)面換藥，每組給藥前均使用生理鹽水沖洗創(chuàng)面，象皮生肌膏組及濕潤燒傷膏組分別使用象皮生肌膏、濕潤燒傷膏外敷后蓋上醫(yī)用無菌敷料加以固定，模型組僅沖洗后蓋上醫(yī)用無菌敷料，假手術(shù)組無特殊處理。每日換藥1次，連續(xù)干預(yù)10 d。

2.4? 創(chuàng)面愈合率

造模后3、5、7、10 d，使用數(shù)碼相機拍攝創(chuàng)面情況，采用0.5 cm×0.5 cm透明方格面積測量器測定創(chuàng)面面積，與造模后初始創(chuàng)面面積進行比較，獲得各組創(chuàng)面動態(tài)愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-造模后n天的面積）/初始創(chuàng)面面積×100%[10]。

2.5? 動物取材

藥物干預(yù)10 d后，次日在麻醉下從象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組取創(chuàng)面組織，假手術(shù)組行“瘺管切除術(shù)”后取瘺管下組織，均用4%多聚甲醛固定。

2.6? HE染色檢測創(chuàng)面組織病理變化

取固定的創(chuàng)面組織制作石蠟切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇水化，用蘇木素和伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，使用病理切片掃描儀對玻片進行掃描，Case Viewer軟件查看玻片并采集圖片，觀察組織病理變化。

2.7? TUNEL法檢測創(chuàng)面組織中細胞凋亡數(shù)目

將創(chuàng)面組織制作成的石蠟切片用二甲苯進行脫蠟，乙醇水化，滴加蛋白酶K，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3次，滴加配制好的50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌3次，含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片。使用病理切片掃描儀、Case Viewer軟件對玻片進行掃描、觀察并采集圖片，采用Image J軟件，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%。

2.8? 免疫組織化學(xué)法檢測創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白的表達

將創(chuàng)面組織制作成的石蠟切片使用二甲苯脫蠟至水、乙醇脫水，經(jīng)過熱修復(fù)抗原后，加入3% H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次。滴加5%羊血清，置于濕盒中室溫孵育20 min，PBS洗滌3次。滴加稀釋的一抗，4 ℃過夜，37 ℃溫箱復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次。滴加顯色劑DAB工作液，室溫孵育5 min，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染3 min，蒸餾水沖洗，PBS洗滌返藍，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。經(jīng)掃描儀掃描后，在Case Viewer軟件進行觀察及圖像采集，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像的積分光密度（integrated optical density， IOD）平均值。

2.9? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 9.3軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖，符合正態(tài)分布及方差齊性的計量資料以“x±s”表示。組間比較采用單因素ANOVA檢驗，方差齊采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 造模情況

肛瘺造模期間各組大鼠未見死亡，造模大鼠均造模成功。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型造模期間各組大鼠未見死亡，故實驗結(jié)束時每組大鼠均為9只。

3.2? 各組創(chuàng)面愈合情況比較

與模型組相比，象皮生肌膏組在干預(yù)后3、5、7、10 d時傷口愈合率均升高（P<0.05，P<0.01），濕潤燒傷膏組在干預(yù)后5、7、10 d時愈合率顯著升高（P<0.05，P<0.01）;在藥物干預(yù)后7、10 d，象皮生肌膏組創(chuàng)面愈合率明顯高于濕潤燒傷膏組（P<0.01）。詳見圖1、表1。

3.3? 各組傷口組織病理學(xué)變化比較

模型組創(chuàng)面可見明顯組織出血、血管擴張及炎性細胞浸潤。象皮生肌膏組創(chuàng)面組織炎性細胞少，可見較成熟血管，膠原纖維和成纖維細胞排列較整齊，致密。濕潤燒傷膏組大鼠創(chuàng)面組織較多炎性細胞浸潤，新生肉芽組織形成。詳見圖2。

3.4? 各組創(chuàng)面組織中細胞凋亡數(shù)目比較

與假手術(shù)組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01）;與濕潤燒傷膏組比較，象皮生肌膏組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01）。詳見圖3—4。

3.5? 各組創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白的表達水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）;與濕潤燒傷膏組比較，象皮生肌膏組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）。詳見圖5—6。

4 討論

肛瘺是結(jié)直腸外科的常見病、多發(fā)病，且隨著生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)等的改變，發(fā)病率呈上升趨勢[13]。手術(shù)是治療肛瘺的首選方案，但因術(shù)后切口為開放性污染傷口，術(shù)后愈合緩慢，疼痛明顯，嚴重影響患者生活。中醫(yī)藥促創(chuàng)面修復(fù)歷史悠久，具有清熱解毒、止痛化瘀、化腐生肌、調(diào)和氣血等作用，有效促進術(shù)后創(chuàng)面愈合[14]?，F(xiàn)代研究證實，中醫(yī)藥在臨床創(chuàng)面修復(fù)中占據(jù)著獨特優(yōu)勢，其作用的機制包括調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)、促進生長因子分泌、調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成等[15-16]。

象皮生肌膏出自清末醫(yī)家張山雷的名方象皮膏，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在其基礎(chǔ)上制成院內(nèi)制劑，將其用于急、慢性創(chuàng)面等多種創(chuàng)面修復(fù)，臨床療效顯著[17-20]。象皮生肌膏主要組成包括象皮粉、生地黃、血余炭、當歸、爐甘石、醋龜甲、生石膏等，其中，象皮粉斂瘡止血;生地黃養(yǎng)陰生津、涼血止血;血余炭消瘀收斂止血;當歸補血活血、生肌止痛;爐甘石解毒收濕斂瘡;龜甲滋陰潛陽、益腎養(yǎng)血;生石膏清熱解毒。諸藥合用，共奏活血止痛、祛腐生肌之功效。本研究通過鋼絲掛線留置及手術(shù)的方法構(gòu)建肛瘺術(shù)后大鼠模型，采用象皮生肌膏或濕潤燒傷膏外用10 d，觀察其對創(chuàng)面愈合及凋亡調(diào)控因子的影響。本次研究顯示，象皮生肌膏組在各個時間點創(chuàng)面愈合率均顯著高于模型組（P<0.05，P<0.01），而濕潤燒傷膏組在藥物干預(yù)后5、7、10 d時創(chuàng)面愈合率較模型組顯著升高（P<0.05，P<0.01），象皮生肌膏組在干預(yù)后7、10 d時創(chuàng)面愈合率明顯高于濕潤燒傷膏組（P<0.01），表明象皮生肌膏能顯著促進肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面修復(fù)是個復(fù)雜而有序的生理過程，涉及止血、炎癥、增殖、重塑等階段，而各階段均有凋亡機制的參與[21]。在止血及炎癥期，血小板、炎癥細胞等大量聚集，通過消除微生物控制感染，隨后炎癥細胞通過凋亡被清除，避免損傷正常細胞與組織而引發(fā)進一步的炎癥，進而進入關(guān)鍵的增殖期及組織重塑期[22]。成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞等各種細胞群迅速增殖，膠原蛋白開始沉積，細胞外基質(zhì)合成，新生肉芽組織形成，傷口逐漸填平，最終通過調(diào)控細胞的清除，導(dǎo)致形成相對無細胞的瘢痕組織[23]。研究表明，創(chuàng)面愈合緩慢與創(chuàng)面細胞過度凋亡相關(guān)，而瘢痕疙瘩的形成與細胞凋亡減少關(guān)系密切[24-26]。由此可見，細胞凋亡影響著創(chuàng)面修復(fù)的進展及預(yù)后。

凋亡的調(diào)節(jié)涉及復(fù)雜的級聯(lián)反映，其發(fā)生及發(fā)展包括起始期、整合期及執(zhí)行期3個階段，Caspase在執(zhí)行期發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是細胞凋亡的核心調(diào)節(jié)因子[27-28]。Caspase分子起初以無活性的酶原形式存在，在受到外部或內(nèi)部的刺激下，凋亡啟動子Caspase-9、Caspase-12被激活，進而蛋白水解剪切并激活效應(yīng)子Caspase-3、Caspase-7，效應(yīng)子Caspase進而作用于底物，導(dǎo)致細胞形態(tài)等發(fā)生變化，導(dǎo)致細胞凋亡[29-30]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)10 d后，與假手術(shù)組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組、模型組創(chuàng)面組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.01），Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01），Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）;與濕潤燒傷膏組比較，象皮生肌膏組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01），Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達水平顯著下降（P<0.01），表明象皮生肌膏能顯著抑制創(chuàng)面肉芽組織細胞凋亡，從而促進傷口愈合，該作用效果可能與抑制創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白的表達相關(guān)。

綜上所述，本研究證實象皮生肌膏能通過抑制肉芽組織細胞凋亡，從而顯著促進創(chuàng)面愈合，其作用機制可能與抑制創(chuàng)面組織中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12蛋白的表達相關(guān)。但本研究僅對凋亡相關(guān)因子進行研究，其涉及的凋亡相關(guān)通路有待后續(xù)更進一步的研究。

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