劉笑蓉 李碩夫 劉湘丹 王志輝 曾娟 周日寶

〔摘要〕 目的 本研究旨在探討鬧羊花毒素Ⅲ調(diào)控TLR4、MyD88和NF-κB的機制，以及鬧羊花毒素Ⅲ對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）的影響。方法 RA大鼠模型通過Ⅱ型膠原誘導(dǎo)構(gòu)建。隨機將Wistar大鼠分成6組（n=8）：假手術(shù)組（Sham組）、RA模型組（Model組）、陽性藥物雷公藤組[TWG組，50 mg·（kg·d）-1]、鬧羊花毒素Ⅲ低劑量組[R-Ⅲ Lo組，0.06 mg·（kg·d）-1]、中劑量[R-Ⅲ Mi組，0.12 mg·（kg·d）-1]和高劑量組[R-Ⅲ Hi組，0.24 mg·（kg·d）-1]。測定各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index， AI）;采用HE染色、ELISA、Western blot和RT-qPCR檢測鬧羊花毒素Ⅲ對TLR4/MyD88/NF-κB信號軸及RA的影響。結(jié)果 與Model組比較，鬧羊花毒素Ⅲ處理顯著降低了RA大鼠的AI評分（P<0.05）。鬧羊花毒素Ⅲ對滑膜組織的惡性增生和炎癥細胞浸潤有明顯的抑制作用。與Model組比，鬧羊花毒素Ⅲ各劑量組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子的水平降低且呈濃度依賴性（P<0.05）。與TWG組比，R-Ⅲ Lo和R-Ⅲ Mi組的。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子的水平升高（P<0.05），而R-Ⅲ Hi組無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論 鬧羊花毒素Ⅲ可以通過下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB因子的表達水平來改善RA。本研究為利用鬧羊花毒素Ⅲ治療RA提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 鬧羊花毒素Ⅲ;TLR4/MyD88/NF-κB信號軸;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;羊躑躅;炎癥;血管生成

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of rhodojaponin Ⅲ on rheumatoid arthritis （RA） by regulating toll-likereceptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， and nuclear factor-kappa-B （NF-κB）. Methods Type Ⅱ collagen was used to construct the RA rat model. Wistar rats were randomly divided into 6 groups， with 8 rats in each group： normal feeding group （sham group）， RA model group （Model group）， positive drug tripterygium wilfordii group [TWG group， 50 mg·（kg·d）-1]， low-dose Rhodojaponin Ⅲ group [R-Ⅲ Lo group， 0.06 mg·（kg·d）-1]， medium-dose group [R-Ⅲ Mi group， 0.12 mg·（kg·d）-1]， and high-dose group [Rhodojaponin Ⅲ Hi group， 0.24 mg·（kg·d）-1]. The arthritis index （AI） of the rats was scored. Meanwhile， HE ELISA， Western blot， and real-time quantitative PCR （RT-qPCR） were used to detect the effects of Rhodojaponin Ⅲ on TLR4/MyD88/NF-κB signal axis and RA. Results Rhodojaponin Ⅲ significantly reduced the AI scores of RA rats compared with model group （P<0.05） and it effectively inhibited the development of malignant hyperplasia and inflammatory cell infiltration into synovial tissue. Meanwhile， compared with model group， the expresson levels of the tumor necrosis facor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-17 （IL-17）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metallopeptidase-2 （MMP-2）， matrix metallopeptidase-9 （MMP-9）， TLR4， MyD88， and phosphor-nuclear factor-kappa-B （p-NF-κB）/NF-κB were reduced in R-Ⅲ Lo， Mi， and Hi groups （P<0.05）. Compared with the TWG group， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-17， VEGF， MMP-2， MMP-9， TLR4， MyD88， p-NF-κB/NF-κB factors increased in the R-Ⅲ Lo and R-Ⅲ Mi groups （P<0.05）， while no significant differences were observed in the R-Ⅲ Hi group （P>0.05）. Conclusion Rhodojaponin Ⅲ can improve RA by down-regulating the expression levels of TLR4， MyD88， and NF-κB. This paper offered a solid experimental foundation for the use of Rhodojaponin Ⅲ in the treatment of RA.

〔Keywords〕 Rhodojaponin Ⅲ; TLR4/MyD88/NF-κB signal axis; rheumatoid arthritis; Yangzhizhu [Rhododendron molle （Blum） G.Don]; inflammation; angiogenesis

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種常見的自身免疫性疾病[1]。目前，全國有0.5%的人患有RA[2]。RA的主要特征有：滑膜炎、血管翳形成、鄰近骨侵蝕、以及關(guān)節(jié)腫脹和疼痛等[3-6]。雖然多種抗風(fēng)濕藥物具有良好臨床治療效果，但RA患者與正常人仍相差了10～15年的預(yù)期壽命[7]。因此，我們需要進一步探索治療RA的藥物。

人體內(nèi)各種炎性細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-7、TNF-α等）能夠促進炎癥反應(yīng)，加重鄰近骨破壞，這表明炎癥因子可能影響RA的發(fā)展[8-12]。有研究表明，阻斷TNF-α、IL-1、IL-6和IL-7等炎癥因子釋放，可以減緩RA相關(guān)炎癥反應(yīng)[13-14]。TLR4能夠接收外界刺激并將其轉(zhuǎn)化為信號分子，從而傳導(dǎo)相關(guān)炎癥和免疫信號[15-16]。例如，TLR4通過依賴MyD88途徑激活NF-κB信號[17]，促進TNF-α、IL-1、IL-7、IL-6等下游炎性因子的合成與分泌[18]，從而導(dǎo)致RA炎癥和免疫反應(yīng)發(fā)生[17-20]。多項研究表明，控制TLR4/MyD88/NF-κB信號軸有助于減輕RA癥狀[21-22]。因此，為緩解RA的發(fā)展，我們亟須探索阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號軸的新藥物。

羊躑躅Rhododendron molle （Blum） G.Don是中醫(yī)用來治療RA的常用藥物，其提取物具有鎮(zhèn)痛、消炎和免疫抑制的作用[23]。目前研究發(fā)現(xiàn)，羊躑躅中的主要活性成分之一鬧羊花毒素Ⅲ具有抑炎作用，能夠抑制TNF-α和IL-1β釋放[24]。前期的研究報道了鬧羊花毒素Ⅲ通過介導(dǎo)Wnt1/Dvl1/β-catenin信號通路來抑制滑膜細胞增殖和細胞炎癥的產(chǎn)生，從而緩解RA[25]。而鬧羊花毒素Ⅱ能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號軸，抑制細胞炎癥反應(yīng)改善RA[26-27]。鬧羊花毒素Ⅲ和Ⅱ均為羊躑躅的二萜類化合物，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[28]。因此，我們將進一步探討鬧羊花毒素Ⅲ是否也能通過TLR4/MyD88/NF-κB軸來改善RA。本研究擬通過研究鬧羊花毒素Ⅲ對RA的調(diào)節(jié)作用，以期為鬧羊花毒素Ⅲ臨床治療RA提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1? 實驗動物

48只Wistar雄性大鼠（200±20） g購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。許可證號：SYXK（湘）2022-0007。實驗倫理審批編號：LL2022061401。實驗前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2? 主要試劑及儀器

生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）;熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific，型號：PIKOREAL96）。

鬧羊花毒素Ⅲ（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號：LM20895）;雷公藤多苷片（貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號：2003006）;牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑購自美國Chondrex公司（批號分別為：20022和7001）;RIPA裂解液（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：AWB0136）;BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific，批號：23225）;TRIzon總RNA提取試劑盒和mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司（批號分別為：CW0580S和CW2569）;一抗VEGF、MMP-2、MMP-9、MyD88、p-NF-κB均購買自英國Abcam公司（批號分別為：ab32152、ab92536、ab76003、ab219413、ab76302）;TLR4抗體、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）抗體、β-actin抗體、HRP goat anti-mouse IgG和HRP goat anti-rabbit IgG抗體以及IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α ELISA試劑盒均購自美國Proteintech公司（批號分別為：19811-1-AP、10745-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2、KE00021、KE10007、KE10020、KE10002）。

1.3? 方法

1.3.1? Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立RA大鼠模型? RA大鼠模型采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)進行構(gòu)建[27，29]。具體操作如下：將終濃度為2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原溶液與完全弗氏佐劑以1∶1混合制成Ⅱ型膠原乳劑。于大鼠尾根部皮下注射300 μL制好的Ⅱ型膠原乳劑。7天后，同劑量二次注射Ⅱ型膠原乳劑。同時設(shè)置假手術(shù)組（Sham組），對該組大鼠注射等劑量生理鹽水作為對照。每日觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況。實驗期間每4天根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹程度評估關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index， AI）。以AI作為判斷RA大鼠模型構(gòu)建成功與否的標準。AI評分每4天統(tǒng)計一次，根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹程度進行評價。總共分為4個等級：未出現(xiàn)任何發(fā)紅、腫脹狀況，計為0分;趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微發(fā)紅、腫脹狀況，計為1分;趾或者足趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹狀況，計為2分;除踝關(guān)節(jié)外，全部后肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹狀況，計為3分;所有后肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹狀況，計為4分[30]。由于前爪炎癥的發(fā)生率很低，后足關(guān)節(jié)更容易出現(xiàn)嚴重腫脹，因此，選用兩后肢之和來評價大鼠的發(fā)病機制[31]。所有關(guān)節(jié)腫脹評分之和即為AI值。當(dāng)AI≥4時，RA大鼠模型構(gòu)建成功[32]。

1.3.2? 分組與給藥? 雷公藤療法是當(dāng)前治療RA最有效和關(guān)鍵的療法之一[33]。因此，本研究用雷公藤作為陽性對照藥物。隨機將48只Wistar雄性大鼠分成Sham組、RA模型組（Model組）、陽性藥物雷公藤組[TWG組，50 mg·（kg·d）-1]、鬧羊花毒素Ⅲ低劑量組[R-Ⅲ Lo組，0.06 mg·（kg·d）-1]、鬧羊花毒素Ⅲ中劑量組[R-Ⅲ Mi組，0.12 mg·（kg·d）-1]、鬧羊花毒素Ⅲ高劑量組[R-Ⅲ Hi組，0.24 mg·（kg·d）-1]，每組8只，灌胃給藥。Sham組和Model組灌胃等劑量的生理鹽水。28 d后，將大鼠麻醉，固定四肢，然后剪開腹壁，腹主動脈采血。最后，剪開皮膚，從鄰近肌肉中分離踝關(guān)節(jié)，剪短兩側(cè)韌帶，暴露滑膜位置，取出滑膜，并用于后續(xù)實驗。

1.3.3? HE染色觀察滑膜組織形態(tài)? 用4%多聚甲醛固定大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織。隨后經(jīng)石蠟包埋、切片、烘烤二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精和伊紅染液染色、脫水、封片等過程，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)病變情況。

1.3.4? ELISA檢測血清中促炎因子含量? 取腹主動脈全血，在4 ℃下，1000×g離心15 min，取上層血清用于檢測。分別按照試劑盒操作步驟，檢測血清中促炎因子含量的變化。

1.3.5? Western blot檢測血管生成、TLR4/MyD88/NF-κB軸相關(guān)蛋白? 用RIPA裂解緩沖液提取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中的總蛋白。再用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。隨著SDS-PAGE電泳后，將總蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。將膜與一抗4 ℃孵育過夜，再與二抗孵育90 min。內(nèi)參蛋白為β-actin。最后，分析蛋白VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB的相對表達量。

1.3.6? RT-qPCR檢測TLR4/MyD88/NF-κB軸相關(guān)基因表達? 按照試劑盒說明，用TRIzon試劑提取踝關(guān)節(jié)滑膜組織總RNA。然后，用紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處的吸光度值，并計算其濃度跟純度。再用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。接下來，將cDNA直接用于熒光定量PCR反應(yīng)。運用Primer 5軟件設(shè)計引物，結(jié)果見表1。最后，以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。

1.4? 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究使用GraphPad Prism 9對實驗數(shù)據(jù)進行評估。數(shù)據(jù)均用“x±s”表示。數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和多因素方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1? 鬧羊花毒素Ⅲ對RA大鼠的改善作用

首先，我們評估了不同時間點的AI評分變化。隨著天數(shù)的變化，Sham組中AI評分無顯著變化（P>0.05）。隨著天數(shù)的變化，Model組AI評分逐漸升高，在第12天達到最高值（P<0.05），12 d以后無顯著變化（P>0.05）。隨著天數(shù)的變化，TWG、R-Ⅲ Lo組、R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組AI評分逐漸升高，在第12天 達到最高值，12 d以后AI評分逐漸降低（P>0.05）。此外，我們比較了不同組間的AI評分。在4 d后，Model組大鼠AI評分顯著高于Sham組（P<0.05）。8 d后，TWG組、R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組與Model組比較，AI評分顯著降低（P<0.05），且R-Ⅲ Hi組和TWG組AI評分基本一致（P>0.05）。見圖1A。Sham組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，表面光滑無增生;Model組、R-Ⅲ Lo組、R-Ⅲ Mi組大鼠滑膜組織增生，層次模糊，伴有大量炎性細胞浸潤;TWG組、R-Ⅲ Hi組大鼠滑膜組織表面光滑，且層次清晰，見圖1B。

2.2? 鬧羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)

如圖2所示，相比于Sham組，Model組中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17含量顯著升高（P<0.05）。相比于Model組，R-Ⅲ Lo、R-Ⅲ Mi、R-Ⅲ Hi組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量呈濃度依賴性降低（P<0.05）。與TWG組比較，R-Ⅲ Lo、R-Ⅲ Mi組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量顯著升高（P<0.05），而R-Ⅲ Hi組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量無顯著變化（P>0.05）。

2.3? 鬧羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的血管生成

與Sham組相比，Model組中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著升高（P<0.05）;TWG組、R-Ⅲ Lo組、R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平相比于Model組，呈劑量依賴性降低（P<0.05）。R-Ⅲ Lo組、R-Ⅲ Mi組中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高于TWG組（P<0.05），而R-Ⅲ Hi組中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平與TWG組無顯著差異詳見圖3。

2.4? 鬧羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的TLR4/MyD88/NF-κB信號軸激活

如圖4A所示，相較于Sham組，Model組中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相對表達水平均顯著上升（P<0.05）。R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相對表達水平相比于Model組，均顯著降低（P<0.05）。而R-Ⅲ Lo組與Model組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。R-Ⅲ Lo組中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相對表達水平顯著高于TWG組（P<0.05）而R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相對表達水平與TWG組比，無顯著性差異（P>0.05）。相比于Sham組，Model組中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達量顯著增加（P<0.05）。R-Ⅲ Lo組、R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組中TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平相比于Model組，均呈濃度依賴性降低（P<0.05）。R-Ⅲ Lo組中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達量顯著高于TWG組（P<0.05）而R-Ⅲ Mi組、R-Ⅲ Hi組中TLR4、MyD88、NF-κB基因的蛋白表達量與TWG組比，無顯著性差異（P>0.05），見圖4B。

3 討論

RA的發(fā)展與機體分泌的炎癥因子[34]密切相關(guān)。例如，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎癥因子的釋放能夠加重滑膜炎癥反應(yīng)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)在RA造模后，大鼠AI評分顯著增加，血清中促炎癥因子表達水平顯著上升。同時，在鬧羊花毒素Ⅲ的干預(yù)下，大鼠血清中促炎因子的釋放被抑制。這些結(jié)果表明，鬧羊花毒素Ⅲ能夠抑制促炎癥因子的釋放，產(chǎn)生抑炎作用。綜上，鬧羊花毒素Ⅲ可能是通過抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等的釋放，緩解RA。

滑膜組織炎癥和骨關(guān)節(jié)破壞的另一原因可能是血管生成[36]。研究表明VEGF能夠調(diào)控血管生成，促進RA疾病發(fā)展[37]。同時，VEGF因子表達與RA患者病癥也呈正相關(guān)的調(diào)控趨勢，因此，可以選用VEGF檢測RA病變程度[38-39]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），影響骨關(guān)節(jié)破壞，RA滑膜液中MMP-2和MMP-9[39]水平升高具有觸發(fā)血管生成的能力[40-42]。本研究結(jié)果顯示，RA大鼠中促血管因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）表達量顯著升高，鬧羊花毒素Ⅲ的干預(yù)顯著下調(diào)了RA大鼠促血管生成因子VEGF、MMP-2和MMP-9的表達。這些結(jié)果說明，鬧羊花毒素Ⅲ可通過下調(diào)促血管生成因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）的表達來改善RA。

TLR4-MyD88-NF-κB通路是常見于RA并調(diào)控相關(guān)炎性反應(yīng)的信號通路[43]。TLR4蛋白監(jiān)控先天免疫與后天免疫，并在RA患者中表達異常升高[44-45]。TLR4蛋白可以上調(diào)MyD88蛋白表達，促進NF-κB因子積累，進而誘導(dǎo)促炎因子的分泌，加劇RA滑膜炎癥反應(yīng)和骨破壞[46-49]。抑制該通路可以減緩相關(guān)炎性反應(yīng)，從而改善RA[50]。本研究表明，在RA大鼠中，TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB等相關(guān)因子含量顯著上升，且鬧羊花毒素Ⅲ能顯著抑制RA滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB等相關(guān)因子水平的上升。由此，我們得出，鬧羊花毒素Ⅲ可以通過抑制TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子表達上調(diào)，減少促炎因子的分泌，抑制關(guān)節(jié)滑膜惡性增生，從而改善RA大鼠相關(guān)病癥。這將為鬧羊花毒素Ⅲ治療RA提供實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究表明鬧羊花毒Ⅲ具有改善RA的作用。其主要作用機制可能是通過下調(diào)促血管生成相關(guān)因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）和TLR4/MyD88/NF-κB信號軸相關(guān)蛋白的表達，抑制促炎因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和抑制滑膜增生。

總之，鬧羊花毒Ⅲ可通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號軸改善RA，這將為鬧羊花毒素Ⅲ應(yīng)用于RA的臨床治療提供可靠的實驗依據(jù)。

參考文獻

[1] EVANGELATOS G， FRAGOULIS G E， KOULOURI V， et al. MicroRNAs in rheumatoid arthritis： From pathogenesis to clinical impact[J]. Autoimmunity Reviews， 2019， 18（11）： 102391.

[2] ALETAHA D， SMOLEN J S. Diagnosis and management of rheumatoid arthritis： A review[J]. JAMA， 2018， 320（13）： 1360-1372.

[3] BI X， GUO X H， MO B Y， et al. LncRNA PICSAR promotes cell proliferation， migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes by sponging miRNA-4701-5p in rheumatoid arthritis[J]. EBioMedicine， 2019， 50： 408-420.

[4] LIU H， ZHU Y L， GAO Y T， et al. NR1D1 modulates synovial inflammation and bone destruction in rheumatoid arthritis[J]. Cell Death & Disease， 2020， 11（2）： 129.

[5] RANA A K， LI Y， DANG Q J， et al. Monocytes in rheumatoid arthritis： Circulating precursors of macrophages and osteoclasts and， their heterogeneity and plasticity role in RA pathogenesis[J]. International Immunopharmacology， 2018， 65： 348-359.

[6] MATTHIJSSEN X M E， WOUTERS F， SIDHU N， et al. Tenosynovitis has a high sensitivity for early ACPA-positive and ACPA-negative RA： A large cross-sectional MRI study[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2021， 80（8）： 974-980.

[7] VAN DEN HOEK J， BOSHUIZEN H C， ROORDA L D， et al. Mortality in patients with rheumatoid arthritis： A 15-year prospective cohort study[J]. Rheumatology International， 2017， 37（4）： 487-493.

[8] TAN Q， HUANG Q， MA Y L， et al. Potential roles of IL-1 subfamily members in glycolysis in disease[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews， 2018， 44： 18-27.

[9] 許? 艷， 崔海虹， 朱靜媛. 金線蓮苷對TNF-α誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖及炎癥因子、MMPs產(chǎn)生的影響[J]. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2022， 24（2）： 38-42.

[10] YOKOTA K， SATO K， MIYAZAKI T， et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheumatology， 2021， 73（7）： 1145-1154.

[11] AKRAM M， DANIYAL M， SULTANA S， et al. Traditional and modern management strategies for rheumatoid arthritis[J]. Clinica Chimica Acta， 2021， 512： 142-155.

[12] KOPER-LENKIEWICZ O M， SUTKOWSKA K， WAWRUSIEWICZ-KURYLONEK N， et al. Proinflammatory cytokines （IL-1， -6， -8， -15， -17， -18， -23， TNF-α） single nucleotide polymorphisms in rheumatoid arthritis-a literature review[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（4）： 2106.

[13] MALHOTRA H， GARG V， SINGH G. Biomarker approach towards rheumatoid arthritis treatment[J]. Current Rheumatology Reviews， 2021， 17（2）： 162-175.

[14] ALAM J， JANTAN I， BUKHARI S N A. Rheumatoid arthritis： Recent advances on its etiology， role of cytokines and pharmacotherapy[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2017， 92： 615-633.

[15] ARENAS-PADILLA M， MATA-HARO V. Regulation of TLR signaling pathways by microRNAs： Implications in inflammatory diseases[J]. Central-European Journal of Immunology， 2018， 43（4）： 482-489.

[16] QUERO L， TIADEN A N， HANSER E， et al. MiR-221-3p drives the shift of M2-macrophages to a pro-inflammatory function by suppressing JAK3/STAT3 activation[J]. Frontiers in Immunology， 2019， 10： 3087.

[17] WANG Q， ZHOU X， ZHAO Y J， et al. Polyphyllin I ameliorates collagen-induced arthritis by suppressing the inflammation response in macrophages through the NF-κB pathway[J]. Frontiers in Immunology， 2018， 9： 2091.

[18] ICHISE Y， SAEGUSA J， TANAKA-NATSUI S， et al. Soluble CD14 induces pro-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells via toll-like receptor 4[J]. Cells， 2020， 9（7）： 1689.

[19] 袁? 娟， 胡? 玲， 宋小鴿， 等. 艾灸對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Toll樣受體4-骨髓樣分化因子88-核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路的影響[J]. 針刺研究， 2015， 40（3）： 199-204.

[20] LI Y， XU J Z， GU C X， et al. Carvacrol suppresses inflammatory responses in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019， 120（5）： 8169-8176.

[21] SAMARPITA S， KIM J Y， RASOOL M K， et al. Investigation of toll-like receptor （TLR） 4 inhibitor TAK-242 as a new potential anti-rheumatoid arthritis drug[J]. Arthritis Research & Therapy， 2020， 22（1）： 16.

[22] HEGEWALD A B， BREITWIESER K， OTTINGER S M， et al. Extracellular miR-574-5p induces osteoclast differentiation via TLR 7/8 in rheumatoid arthritis[J]. Frontiers in Immunology， 2020， 11： 585282.

[23] 姚禹民， 房? 鑫， 李? 俊， 等. 羊躑躅二萜類成分和各極性部位的體內(nèi)外抗炎活性研究[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2019， 33（4）： 84-88.

[24] HE Y C， YAO Y M， XUE Q W， et al. Anti-rheumatoid arthritis potential of diterpenoid fraction derived from Rhododendron molle fruits[J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2021， 19（3）： 181-187.

[25] 劉笑蓉， 劉湘丹， 王? 智， 等. 鬧羊花毒素Ⅲ通過調(diào)控Wnt1/Dvl1/β-catenin通路影響成纖維樣滑膜細胞增殖凋亡的實驗研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2022， 42（10）： 1199-1206.

[26] 闞玉娜， 謝佳明， 馬立威， 等. 中藥活性成分改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機制研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2021， 23（10）： 139-145.

[27] KONG L L， WANG L F， ZHAO Q， et al. Rhodojaponin II inhibits TNF-α-induced inflammatory cytokine secretion in MH7A human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J]. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology， 2020， 34（10）： e22551.

[28] 夏德超， 楊天明， 朱景申， 等. 羊躑躅的研究進展[J]. 中藥材， 2002， 25（11）： 829-832.

[29] HU X M， TANG J H， ZENG G， et al. RGS1 silencing inhibits the inflammatory response and angiogenesis in rheumatoid arthritis rats through the inactivation of Toll-like receptor signaling pathway[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019， 234（11）： 20432-20442.

[30] DA SILVEIRA K L， DA SILVEIRA L L， THORSTENBERG M L， et al. Free and nanoencapsulated vitamin D3： Effects on E-NTPDase and E-ADA activities in an animal model with induced arthritis[J]. Cell Biochemistry and Function， 2016， 34（4）： 262-273.

[31] ZHANG Q， PENG W， WEI S， et al. Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction possesses anti-arthritic effects on type II collagen-induced arthritis in rats via suppression of inflammatory reactions， inhibition of invasion & migration and induction of apoptosis in synovial fibroblasts. Biomed Pharmacother， 2019， 118： 109367.

[32] HU X， TANG J， ZENG G， et al. RGS1 silencing inhibits the inflammatory response and angiogenesis in rheumatoid arthritis rats through the inactivation of Toll-like receptor signaling pathway. J Cell Physiol， 2019， 234（11）： 20432-20442.

[33] ZHANG Y Q， MAO X， LI W J， et al. Tripterygium wilfordii： An inspiring resource for rheumatoid arthritis treatment[J]. Medicinal Research Reviews， 2021， 41（3）： 1337-1374.

[34] SHEN P， LIN W J， BA X， et al. Quercetin-mediated SIRT1 activation attenuates collagen-induced mice arthritis[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2021， 279： 114213.

[35] FIGUS F A， PIGA M， AZZOLIN I， et al. Rheumatoid arthritis： Extra-articular manifestations and comorbidities[J]. Autoimmunity Reviews， 2021， 20（4）： 102776.

[36] CHEN Z， WANG H Q， XIA Y， et al. Therapeutic potential of mesenchymal cell-derived miRNA-150-5p-expressing exosomes in rheumatoid arthritis mediated by the modulation of MMP14 and VEGF[J]. Journal of Immunology， 2018， 201（8）： 2472-2482.

[37] DAI C Q， KUO S J， HU S L， et al. VEGF-C gene polymorphisms increase susceptibility to rheumatoid arthritis[J]. International Journal of Medical Sciences， 2019， 16（10）： 1397-1403.

[38] LEE Y H， BAE S C. Correlation between circulating VEGF levels and disease activity in rheumatoid arthritis： A meta-analysis[J]. Zeitschrift Für Rheumatologie， 2018， 77（3）： 240-248.

[39] MELINCOVICI C S， BO[S][5]CA A B， [S][5]U[S][5]MAN S， et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF）-key factor in normal and pathological angiogenesis[J]. Revue Roumaine De Morphologie et Embryologie， 2018， 59（2）： 455-467.

[40] TATEMATSU N， WAGURI-NAGAYA Y， KAWAGUCHI Y， et al. Mithramycin has inhibitory effects on gliostatin and matrix metalloproteinase expression induced by gliostatin in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J]. Modern Rheumatology， 2018， 28（3）： 495-505.

[41] DU H Y， ZHANG X， ZENG Y C， et al. A novel phytochemical， DIM， inhibits proliferation， migration， invasion and TNF-α induced inflammatory cytokine production of synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis patients by targeting MAPK and AKT/mTOR signal pathway[J]. Frontiers in Immunology， 2019， 10： 1620.

[42] DAS S， AMIN S A， JHA T. Inhibitors of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） for the management of hematological malignancies[J]. European Journal of Medicinal Chemistry， 2021， 223： 113623.

[43] 井維堯， 杜小正， 田杰祥， 等. 基于TLR4/NF-KB通路的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥發(fā)病機制及中醫(yī)藥治療研究進展[J]. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2022， 39（2）： 84-89.

[44] BAHRAMI A， PARSAMANESH N， ATKIN S L， et al. Effect of statins on toll-like receptors： A new insight to pleiotropic effects[J]. Pharmacological Research， 2018， 135： 230-238.

[45] ZHANG Y D， JI T F， MA S， et al. MLL1 promotes migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis by activating the TRIF/NF-κB signaling pathway via H3K4me3 enrichment in the TLR4 promoter region[J]. International Immunopharmacology， 2020， 82： 106220.

[46] GOMES DA SILVA I I F， LIMA C A D， SILVA J E A， et al. Is there an inflammation role for MYD88 in rheumatoid arthritis？[J]. Inflammation， 2021， 44（3）： 1014-1022.

[47] MITCHELL J P， CARMODY R J. NF-κB and the transcriptional control of inflammation[M]//International Review of Cell and Molecular Biology. Amsterdam： Elsevier， 2018： 41-84.

[48] 李? 梅， 蔣錦梅， 歐大明， 等. 白術(shù)多糖對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用及TLR4/NF-κB信號通路的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2022， 57（4）： 552-557

[49] 張傳英， 胡? 玲， 蔡榮林， 等. 艾灸對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Toll樣受體4/核因子-κB信號通路的影響[J]. 針刺研究， 2018， 43（11）： 687-691.

[50] 李宗祥， 肖? 凱. 基于TLR4/NF-κB信號通路探討通痹膠囊對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎治療機制的研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志， 2019， 35（12）： 1453-1457.