關(guān) 翰,孫文衍,汪 盛,陳志軍

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤,在導(dǎo)致男性癌癥死亡的原因里名列前茅[1]。早期PCa的治療方案為去雄激素治療,隨著病情的進(jìn)展,多數(shù)會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗型PCa(castration-resistant prostate cancer,CRPC),這一階段的PCa已對(duì)雄激素不敏感,是目前的治療難題[2]。同時(shí),有50%～70%的CRPC病人最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,成為導(dǎo)致死亡的主要原因[3],探究促使PCa發(fā)生惡性進(jìn)展的機(jī)制,使病人獲得更好的預(yù)后顯得尤為重要。近年來(lái)PCa的腫瘤微環(huán)境受到越來(lái)越多的關(guān)注,因其在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移扮演著重要角色[4]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞群,在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有廣泛的促腫瘤作用。巨噬細(xì)胞在局部微環(huán)境中可能會(huì)對(duì)不同的刺激表現(xiàn)出不同的表型。一般說(shuō)來(lái),在各種外界因素刺激下,巨噬細(xì)胞可以分化為經(jīng)典的促炎型M1巨噬細(xì)胞和抗炎型M2巨噬細(xì)胞,M2型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5],因此,TAMs似乎更有可能被歸類為M2巨噬細(xì)胞,盡管其具有同時(shí)表達(dá)M1和M2標(biāo)志的混合表型。M2型巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子或蛋白與腫瘤細(xì)胞的耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。外泌體是直徑在20～200 nm之間的脂質(zhì)雙層膜囊泡。外泌體可以包裹微小RNA、長(zhǎng)非編碼RNA、蛋白質(zhì)和其他生物活性物質(zhì),調(diào)控生理和病理?xiàng)l件下細(xì)胞的活動(dòng)[6],可以由癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞分泌,并可以被微環(huán)境中的其他細(xì)胞吸收,從而影響到其他細(xì)胞的生物學(xué)功能[7]。在前期研究[8]中,筆者發(fā)現(xiàn)在PCa組織中M2型巨噬細(xì)胞含量比前列腺增生組織高,并鑒定了一些在M2型巨噬細(xì)胞外泌體和THP-1外泌體中差異標(biāo)的miRNA,其中miR-374a在M2型巨噬細(xì)胞外泌體內(nèi)高表達(dá)。本研究進(jìn)一步體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,miR-374a可通過(guò)M2外泌體傳遞至PCa細(xì)胞內(nèi),并可靶向叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)增強(qiáng)PCa細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的能力?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的獲取 PC3、DU145和LNCaP三種前列腺癌細(xì)胞以及前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI1640 (Gibco),含10%的胎牛血清以及雙抗(Gibco)。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行。人單核細(xì)胞系THP-1購(gòu)自廣州賽庫(kù),在含有10%胎牛血清(Gibco)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640中培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,在THP-1細(xì)胞中加入200 ng/mL PMA(南京春秋生物)24 h,然后再與20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13培養(yǎng)48 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1、M2標(biāo)志物的表達(dá)。

1.2 外泌體的抽提與鑒定 THP-1細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞在RPMI1640中培養(yǎng)48 h后,將條件培養(yǎng)液350 g離心10 min,再2 000 g離心30 min,去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將離心后的上清液以10 000 g離心30 min和100 000 g離心70 min。離心后的外泌體懸浮于50～100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中。超速離心機(jī)型號(hào)為Beckman Optima L-80XP。透視電鏡觀察外泌體形態(tài),使用納米粒子跟蹤分析(Particle Metrix′s ZetaView)證明外泌體1.0×109～1.0×1010/mL,并且進(jìn)一步使用Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志物。使用紅色親脂熒光染料Dil標(biāo)志通過(guò)高速離心法抽提的外泌體。將Dil標(biāo)記的外泌體分別與PC3和DU145細(xì)胞孵育24 h,使用熒光顯微鏡(Olympus FV1200,Japan)觀察PC3和DU145細(xì)胞對(duì)Dil標(biāo)記的外泌體的攝取情況。

1.3 細(xì)胞的共培養(yǎng) cy3熒光標(biāo)記的miR-374a購(gòu)買(mǎi)自西安瑞禧生物科技有限公司,GW4869購(gòu)買(mǎi)自MCE公司。將前列腺癌細(xì)胞PC3種入24孔板中,小室內(nèi)種入轉(zhuǎn)染過(guò)cy-3-miR-374a的M2型巨噬細(xì)胞,共培養(yǎng)24～48 h后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,對(duì)照組加入外泌體抑制劑GW4869。

1.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) Trizol提取細(xì)胞中的RNA,使用外泌體RNA提取試劑盒(BIOG Exosome RNA Easy Kit)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作獲取外泌體中的RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物為RT-Primer,內(nèi)參和mRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物為Random Hexamer Primer。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光試劑盒購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司。八連管中加入引物,cDNA模板、熒光染料,無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。上機(jī)檢測(cè)儀器PCR條件設(shè)置為 95 ℃ 10 min,40個(gè)循環(huán),循環(huán)條件95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。循環(huán)結(jié)束后在60 ℃時(shí)收集數(shù)據(jù),繪制擴(kuò)增曲線。以U6作為內(nèi)參,通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算miR-183-5p的相對(duì)含量。

1.5 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 基于 miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù),從上海吉瑪公司購(gòu)買(mǎi)獲得 miR-374a-5p mimic (UUA UAA UAC AAC CUG AUA AAG UG)、miR-374a-5p mimic control (UUU GUA CUA CAC AAA AGU ACU G)、miR-374a-5p inhibitor (CAC UUA UCA GGU UGU AUU AUA A) 和 miR-374a-5pinhibitor control (CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA A)以及 FOXO1 siRNA (si-FOXO1) 和具有非特異性序列的陰性對(duì)照siRNA (si-NC)。將DU145和PC3細(xì)胞接種在6孔板中,并按照制造商的方案使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48 h,使用細(xì)胞進(jìn)行功能測(cè)定。慢病毒顆粒的包裝如下:3個(gè)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪公司構(gòu)建,含有針對(duì)miR-374a的siRNA,并用于在6 μg/mL Polybrene存在下感染PC3細(xì)胞。通過(guò)嘌呤霉素篩選細(xì)胞,并通過(guò)qRT-PCR確認(rèn)miR-374a的敲低。miR-374a的stem-loop RT引物如下:5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CAC TTA GC-3′;miR-374a-5p上下游引物序列:Forward,5′-3′ CCT GAT AAG TGG TCG TAT CCA GT;Reverse,5′-3′ GTA TCC AGT GCG TGT CGT GG。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,均勻接種于96孔板(1 000個(gè)細(xì)胞/孔)中。然后將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)24、48、72和96 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),將細(xì)胞與20 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒溶液(碧云天)孵育,然后在37 ℃、5% CO2中孵育4 h,以評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。用分光光度計(jì)在495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 EdU及Tunel實(shí)驗(yàn) EdU和Tunel試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司,實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下。EdU實(shí)驗(yàn):將處理完畢的細(xì)胞接種到24孔板中,加入EdU培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用4%多聚甲醛固定,甘氨酸孵育,根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入試劑后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞圖像;Tunel實(shí)驗(yàn):每組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于密度為4×104/cm2的培養(yǎng)皿中24 h。棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌3次。然后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞,用0.5%的Triton X進(jìn)行透膜,按照說(shuō)明書(shū)操作完成剩余步驟后使用熒光顯微鏡觀察。

1.8 Western blotting實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞進(jìn)行裂解,提取總蛋白。使用聚丙烯酰氨凝膠電泳SDS-PAGE分離蛋白,隨后使用PVDF膜(Millipore)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后使用5%的脫脂奶粉封閉1 h,使用一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌后二抗(1∶2 000)孵育1～2 h,用TBST洗滌PVDF膜,隨后用ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒(碧云天)在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行顯色。Western blotting定量分析采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行(Media Cybernetics)。抗體信息:anti-FOXO1 antibody (ab207204,Abcam),anti-E-cadherin antibody (ab1416,Abcam),anti-N-cadherin antibody (ab18203,Abcam),anti-Vimentin antibody (ab92547,Abcam)。

1.9 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞鋪6 孔板,待生長(zhǎng)至70%分別轉(zhuǎn)染,3 d后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PBS洗滌細(xì)胞2次,采用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)調(diào)整濃度,PI/AV 染色(吉?jiǎng)P生物),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.10 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 分別使用不帶有Matrigel 和預(yù)鋪Matrigel的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。小室上層為無(wú)血清培養(yǎng)基,下層為含10%血清的培養(yǎng)基。加入細(xì)胞培養(yǎng)7～12 h后固定,結(jié)晶紫染色,去除上層細(xì)胞,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)薄膜的細(xì)胞。

1.11 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種在6孔板中用絲裂霉素C(1 μg/mL)預(yù)處理1 h排除增殖的影響。使用無(wú)菌移液管尖端在孔中形成直傷口,并使用PBS去除漂浮細(xì)胞。倒置顯微鏡在0和36 h拍攝細(xì)胞遷移圖像,并通過(guò)Image J分析軟件測(cè)量細(xì)胞遷移距離,選擇了3個(gè)距離并取平均值。

1.12 平板克隆實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d。處理時(shí)細(xì)胞用PBS清洗3次,甲醇固定15 min,室溫下用300 μL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min。用ImageJ 2X軟件計(jì)數(shù)含有50個(gè)以上細(xì)胞的集落。

1.13 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 6周齡BALB/C裸鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物愛(ài)護(hù)使用委員會(huì)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用研究所健康指南進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染慢病毒的PC3細(xì)胞胰酶消化后懸浮在PBS中,將細(xì)胞(4×106個(gè))注射到裸鼠側(cè)腹皮下種植7周。7周后,通過(guò)頸椎脫位處死裸鼠。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑和最短直徑,體積=1/2(長(zhǎng)徑×短徑2)計(jì)算腫瘤體積。部分切除組織用于Western blotting檢測(cè)。

1.14 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用 PBS 洗滌3次,用4%多聚甲醛固定,使用0.2% Triton X-100透膜。向細(xì)胞中加入抗體并在4 ℃下孵育過(guò)夜。 第2天將在室溫下孵育15 min的細(xì)胞與二抗一起孵育。隨后的實(shí)驗(yàn)在黑暗中進(jìn)行。在37 ℃孵育90 min并用PBS清洗3次后,使用熒光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM800型) 進(jìn)行觀察。

1.15 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 由上海吉瑪基因合成了 FOXO1 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)片段,其中包含可能的miR-374a結(jié)合序列。將野生型和突變型FOXO1 3′-UTR亞克隆到psiCHECK-2TM載體中,獲得psi-check-FOXO1-wt和psi-check-FOXO1-mut。將DU145和PC3細(xì)胞接種于24孔板中,在37 ℃下用Lipofectamine2000試劑分別與miR-374a模擬物或NC、FOXO1-WT或FOXO1-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,48 h后用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)熒光素酶活性。重復(fù)測(cè)量3次,計(jì)算平均值。

1.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建M2型巨噬細(xì)胞并抽提鑒定其外泌體 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD68、CD86及CD206的表達(dá)量,結(jié)果可見(jiàn)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)量較M0和M1型巨噬細(xì)胞相比均明顯升高(見(jiàn)圖1A和表1)。同時(shí)抽提M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察,可見(jiàn)抽提的外泌體呈典型的茶托形狀(見(jiàn)圖1B)。納米粒子跟蹤分析顯示外泌體粒徑的集中趨勢(shì)在110 nm左右。Western blotting檢測(cè)外泌體膜標(biāo)志物CD63及TSG101陽(yáng)性,同時(shí)不表達(dá)GM130(見(jiàn)圖1C),結(jié)合外泌體電鏡照片、粒徑分析及Western blotting檢測(cè)外泌體膜標(biāo)志物,確定抽提物質(zhì)為M2型巨噬細(xì)胞外泌體。

表1 M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86和CD206陽(yáng)性率比較

2.2 M2型巨噬細(xì)胞外泌體包裹miR-374a傳遞至PCa細(xì)胞內(nèi) 熒光定量PCR結(jié)果顯示,與人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1相比,miR-374a在前列腺癌細(xì)胞系DU145、PC3和LNCaP中均高表達(dá)(P<0.05),與THP-1細(xì)胞相比,miR-374a在M2型巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)(P<0.05和P<0.01)(見(jiàn)表2～3)。轉(zhuǎn)染cy3熒光標(biāo)志的miR-374a后的M2型巨噬細(xì)胞與PC3細(xì)胞在非接觸共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)后PC3中miR-374a表達(dá)量顯著升高(P<0.05),但在共培養(yǎng)體系中加入外泌體抑制劑GW4869,共培養(yǎng)后PC3中miR-374a表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)(見(jiàn)表4)。使用紅色DiL熒光標(biāo)志外泌體,并與PC3細(xì)胞共培養(yǎng),熒光顯微鏡可觀察到外泌體被PC3細(xì)胞吸收,藍(lán)色DAPI熒光為細(xì)胞核,紅色為DiL熒光(見(jiàn)圖2A～2C)。轉(zhuǎn)染cy3熒光標(biāo)志的miR-374a后的M2型巨噬細(xì)胞與PC3細(xì)胞非接觸共培養(yǎng),熒光顯微鏡觀察到PC3中存在cy3的綠色熒光,在共培養(yǎng)體系中加入GW4869則熒光顯微鏡在PC3中無(wú)法觀察到綠色熒光。抽提cy3熒光標(biāo)志的miR-374a后的M2型巨噬細(xì)胞外泌體與PC3細(xì)胞共培養(yǎng),亦可在細(xì)胞中觀察到cy3的綠色熒光(見(jiàn)圖2D～2H),代表miR-374a可通過(guò)M2型巨噬細(xì)胞外泌體傳遞至PC3細(xì)胞內(nèi)。

表2 miR-374a在不同細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

表3 miR-374a在M2和THP-1中的相對(duì)表達(dá)量

表4 不同分組外泌體與PC3細(xì)胞共培養(yǎng)后miR-374a相對(duì)表達(dá)量的變化

2.3 miR-374a可促進(jìn)PC3和DU145細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力并抑制其凋亡 通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-374a進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),克隆形成實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證抑制miR-374a后細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.01)(見(jiàn)表5及圖3A～3C);Tunel實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制miR-374a后促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表5～6及圖3C～3D);侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制miR-374a后抑制細(xì)胞侵襲及遷移能力(P<0.01)(見(jiàn)表7及圖3B～3E)。

表5 轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后細(xì)胞增殖能力的變化

表6 流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后細(xì)胞凋亡能力變化

表7 轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化

2.4 miR-374a inhibitor可抑制PC3細(xì)胞裸鼠皮下成瘤的瘤體生長(zhǎng) 轉(zhuǎn)染慢病毒穩(wěn)定干擾PC3細(xì)胞內(nèi)miR-374a的表達(dá),進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),通過(guò)小動(dòng)物成像儀觀察瘤體Luc熒光(見(jiàn)圖4A),處死裸鼠后測(cè)量瘤體體積,干擾miR-374a后可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)(見(jiàn)圖4B),Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾miR-374a組瘤體組織中FOXO1對(duì)比對(duì)照組表達(dá)顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)圖4C、表8)。

表8 轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后細(xì)胞成瘤能力變化

2.5 miR-374a靶向FOXO1促進(jìn)β-catenin入核,促進(jìn)前列腺細(xì)胞EMT 預(yù)測(cè)網(wǎng)站結(jié)合文獻(xiàn)選取FOXO1作為miR-374a潛在下游靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示miR-374a序列能直接結(jié)合到FOXO1 3′UTR區(qū)(P<0.01)(見(jiàn)表9)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后可抑制DU145及PC3細(xì)胞EMT進(jìn)展,同時(shí)FOXO1表達(dá)量升高,核內(nèi)β-catenin表達(dá)量減低(見(jiàn)圖5A),為進(jìn)一步直觀驗(yàn)證,免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后FOXO1熒光強(qiáng)度減低,同時(shí)β-catenin熒光向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移(見(jiàn)圖5B)。在前列腺增生及PCa組織中驗(yàn)證FOXO1表達(dá)量,提示增生組織中FOXO1表達(dá)量較高(P<0.05)(見(jiàn)表10)。

表9 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)各組熒光比值變化

表10 PCa及前列腺增生組織中FOXO1相對(duì)表達(dá)量

2.6 功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證si-FOXO1可逆轉(zhuǎn)miR-374a inhibitor對(duì)細(xì)胞侵襲能力及EMT造成的影響 為驗(yàn)證si-FOXO1效率,通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FOXO1后的表達(dá),結(jié)果證明干擾后PCa細(xì)胞中的FOXO1表達(dá)量顯著減低(見(jiàn)圖6A),同時(shí)干擾FOXO1表達(dá)后PCa細(xì)胞侵襲能力下降(見(jiàn)圖6B),為進(jìn)一步探究miR-374a與FOXO1的關(guān)系,共轉(zhuǎn)染后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)及Western blotting檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo),結(jié)果說(shuō)明si-FOXO1可逆轉(zhuǎn)miR-374a inhibitor對(duì)細(xì)胞侵襲能力及EMT造成的影響(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)圖6C～6D及表11)。

表11 功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞侵襲能力變化

3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者將注意力集中在腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用上[8-9],其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子和細(xì)胞因子,如CCl-5、CCl-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β,顯著影響癌癥進(jìn)展的各個(gè)方面,包括免疫逃逸、腫瘤擴(kuò)散和治療耐藥等[10]。此外有研究[11]表明,浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞群與癌細(xì)胞的生物學(xué)行為呈正相關(guān)關(guān)系,并與病人預(yù)后不良密切相關(guān)。在本課題組前期研究[12]中發(fā)現(xiàn),前列腺腫瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量高于前列腺增生組織,提示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可能在PCa惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用。

大多數(shù)研究都集中在巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、分子或其他蛋白質(zhì)上,但考慮到miRNAs對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)展的調(diào)節(jié)作用,還需要更多地關(guān)注miRNAs。miRNAs是一種非編碼的單鏈RNA分子,與靶基因的3′-UTR結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。以往的研究?jī)H局限于細(xì)胞或組織的miRNA差異表達(dá),而忽略細(xì)胞外泌體的作用,它們也可能通過(guò)包裹運(yùn)輸miRNA來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。例如,外顯子介導(dǎo)的載脂蛋白E(ApoE)的穿梭參與了PI3K-Akt信號(hào)通路的激活,從而促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移[13]。此外,膀胱癌細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞[14]。有研究團(tuán)隊(duì)[15]發(fā)現(xiàn)TAM衍生的外切體中包含的miR-21和miR-155通過(guò)靶向BRG1表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。有研究[16]報(bào)道,上皮性卵巢癌中Treg/Th17細(xì)胞的失衡主要?dú)w因于TAM外切體產(chǎn)生的miRNA水平異常,因此,筆者推測(cè)TAM外體釋放的miRNAs影響PCa細(xì)胞的惡性行為。為了驗(yàn)證筆者的假設(shè),筆者進(jìn)行了微陣列分析,從THP-1和M2型巨噬細(xì)胞的外體中篩選出差異表達(dá)的miR-374a并進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

miR-374a在促進(jìn)或抑制各種惡性腫瘤發(fā)展方面的不同作用使其難以達(dá)成共識(shí)[17-19]。通過(guò)搜索相關(guān)文獻(xiàn),尚未見(jiàn)明確證據(jù)表明 miR-374a 在PCa發(fā)生或進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用研究,這使得筆者值得進(jìn)行進(jìn)一步的研究。隨后的 qRT-PCR 結(jié)果也與基因芯片結(jié)果吻合。筆者驗(yàn)證了外泌體釋放的miR-374a可以直接被受體PCa細(xì)胞吸收,并檢測(cè)到PCa細(xì)胞中cy3標(biāo)記的miR-374a的綠色熒光信號(hào),而添加外泌體抑制劑時(shí)未檢測(cè)到綠色熒光。

在進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)后,筆者發(fā)現(xiàn)miR-374a在體外和體內(nèi)可以顯著促進(jìn) PCa 細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡。為了尋找可能導(dǎo)致 miR-374a 的促腫瘤發(fā)生作用的下游靶點(diǎn),筆者通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站選取交集結(jié)合文獻(xiàn),預(yù)測(cè)FOXO1作為miR-374a的下游靶基因,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。FOXO1 是叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子家族(FOXO1、FOXO3、FOXO4 和 FOXO6)的重要成員,它已被證明為調(diào)節(jié)腫瘤的惡性過(guò)程的重要因子,包括細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。FOXO1 在促進(jìn)或抑制多種惡性腫瘤的EMT過(guò)程中發(fā)揮著與不同的作用。一方面,ERK2與FOXO1/DOCK10協(xié)同作用以促進(jìn)細(xì)胞遷移和EMT[21],同時(shí),FOXO1參與PIK3/AKT通路來(lái)參與IMPDH2介導(dǎo)的結(jié)直腸癌EMT進(jìn)展[22]。然而另一方面,FOXO1被發(fā)現(xiàn)受到上游miRNA的抑制,例如miR-5188和miR-223,從而阻礙了乳腺癌和肺腺癌中的EMT[23-24]。在PCa 發(fā)育過(guò)程中,絕大多數(shù)研究似乎都承認(rèn)FOXO1通過(guò)受其上游mRNA和miRNA 調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子(包括RUNX2)發(fā)揮抑制作用[25-27]。在此基礎(chǔ)上筆者發(fā)現(xiàn)FOXO1的表達(dá)可能受到miR-374a的抑制,從而促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖和侵襲。從理論上講,FOXO1可以與細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin發(fā)生功能性相互作用,抑制β-catenin在細(xì)胞核中的積累并促進(jìn)其降解,從而抑制已知EMT標(biāo)志物和癌癥轉(zhuǎn)移關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的激活[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-374a通過(guò)抑制FOXO1表達(dá)發(fā)揮其對(duì)PCa惡性進(jìn)展的促進(jìn)作用,并進(jìn)一步證明干擾FOXO1導(dǎo)致 β-catenin在PCa細(xì)胞中的易位并顯增加EMT標(biāo)志物的表達(dá)。

本研究仍有一定的局限性,EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,還可以進(jìn)行體內(nèi)肺或骨轉(zhuǎn)移測(cè)定以確定miR-374a是否會(huì)影響PCa細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外,筆者的數(shù)據(jù)不支持涉及Wnt/β-catenin途徑或調(diào)節(jié)miR-374a表達(dá)的上游介質(zhì)的進(jìn)一步分子探索。除了考慮miR-374a和其他潛在靶mRNA之間的共同結(jié)合位點(diǎn)之外,識(shí)別和驗(yàn)證其他靶標(biāo)及其效果對(duì)于提供額外的治療方案是必不可少的?？傊?本研究發(fā)現(xiàn)在M2型巨噬細(xì)胞中分離出的外泌體的驅(qū)動(dòng)下,PCa 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境惡性行為進(jìn)一步發(fā)展,此外,筆者說(shuō)明了miR-374a/FOXO1/β-catenin軸在誘導(dǎo)EMT和加速PCa惡化中的作用,提示筆者可以通過(guò)研究針對(duì) miR-374a/FOXO1/β-catenin 軸的治療方法來(lái)治療PCa病人。