劉文斌,李艷兵,周焱濤

骨肉瘤是好發(fā)于兒童及青少年的骨組織惡性腫瘤,易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[1]。目前,骨肉瘤發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究[2]顯示,骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的異常激活及抑癌基因的失活有關(guān),探究骨肉瘤中異常表達(dá)的基因分子,可為其治療提供分子靶點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA,且lncRNA可靶向miRNA進(jìn)而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動,為腫瘤的治療提供了分子靶點[3-4]。人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18(human leukocyte antigen complex 18,HCG18)屬于一種lncRNA,其在胃癌[5]、肝癌[6]、鼻咽癌[7]和肺腺癌[8]等腫瘤中表達(dá)升高,促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Starbase靶基因軟件預(yù)測顯示,HCG18可能靶向結(jié)合miR-34b-5p,而叉頭框蛋白p1(forkhead box protein p1,FOXP1)可能是miR-34b-5p的靶基因。miR-34b低表達(dá)與骨肉瘤進(jìn)展過程中的生理病理學(xué)活動密切相關(guān),通過上調(diào)miR-34b可增強(qiáng)體外骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,延緩腫瘤進(jìn)展[9]。FOXP1是叉頭框家族成員之一,參與心肌細(xì)胞發(fā)育、免疫B細(xì)胞分化等過程。有報道[10]稱,FOXP1在骨肉瘤組織中表達(dá)升高,促進(jìn)骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移。本研究檢測了骨肉瘤組織中HCG18的表達(dá),然后以骨肉瘤U2OS細(xì)胞為研究對象,miR-34b-5p/FOXP1軸為切入點,探討HCG18對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年5月至2019年10月在我院確診并行手術(shù)治療的骨肉瘤病人47例瘤組織及對應(yīng)的瘤旁組織,液氮保存。其中女19例,男28例;年齡4～25歲,平均(14.29±4.51)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤;合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙。組織樣本取材經(jīng)病人或家屬同意,研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞和試劑 U2OS細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物);RPMI 1640培養(yǎng)基、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶);胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司);LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司);PCR引物、HCG18小干擾RNA(si-HCG18)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-34b-5p抑制劑(anti-miR-34b-5p)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、HCG18和FOXP1的野生型質(zhì)粒(WT-HCG18、WT-FOXP1)及突變型質(zhì)粒(MUT-HCG18、MUT-FOXP1)、miR-34b-5p 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、FOXP1過表達(dá)載體(pcDNA-FOXP1)、空載體(pcDNA)(上海生工);兔抗人FOXP1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR法檢測HCG18和miR-34b-5p表達(dá) 將收集的新鮮組織樣本在液氮保護(hù)下進(jìn)行研磨,用RNA抽提試劑提取組織總RNA。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,并行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán)。引物序列:HCG18上游5′-GAC CGA GAC CAA TGG CAC AG-3′,下游5′-CGA CTA GAT CCG AGA GGA CAC-3′;miR-34b-5p上游5′-ACG ATA GAC CAA CGG CTG AC-3′,下游5′-CGT GTG CGA GGC GAG CGT AGC-3′;GAPDH上游5′-CGA TAG TCG CGA GCT CGG-3′,下游5′-CGA TAG AGG AAA CCA CG-3′;U6上游5′-CGT GTC GTG AGC GAG CAC-3′,下游5′-CGA GCG CTA GAT TCA GAG G-3′。2-△△Ct法計算HCG18相對于內(nèi)參GAPDH、miR-34b-5p相對于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

1.3.2 U2OS細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將U2OS細(xì)胞在超凈工作臺中復(fù)蘇,加含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期U2OS接種于6孔板中(1.0×105個/孔),用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-HCG18(si-HCG18組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-34b-5p mimics(miR-34b-5p組)、共轉(zhuǎn)染si-HCG18與anti-miR-NC(si-HCG18+anti-miR-NC組)、si-HCG18與anti-miR-34b-5p(si-HCG18+anti-miR-34b-5p組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA(miR-34b-5p+pcDNA組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA-FOXP1(miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1組)。轉(zhuǎn)染12 h后,更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,RT-qPCR法檢測細(xì)胞中HCG18或miR-34b-5p表達(dá)驗證轉(zhuǎn)染效果,方法同1.3.1,并收集細(xì)胞備用。同時設(shè)置對照組(Control組),細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞接種于96孔板中(2.5×104個/孔),培養(yǎng)24 h后,加10 μL CCK-8試劑。孵育2 h,用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測吸光度值。

1.3.4 克隆形成實驗 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×104個/孔),每2 d換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后,棄培養(yǎng)基。用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,顯微鏡觀察,對超過50個細(xì)胞的克隆記數(shù)。

1.3.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)基。用200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板底部平行于中軸線劃兩條平行線,并用PBS清洗掉劃痕間細(xì)胞,測量劃痕間距d,記為d0h。更換為新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,再次測量細(xì)胞間間距d,記為d24h。劃痕愈合率(%)=(d0h-d24h)/d0h×100%。

1.3.6 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 將Transwell小室置于24孔板中,鋪Matrigel基質(zhì)膠,自然晾干。在上室中加含1.0×104個細(xì)胞的細(xì)胞懸液,下室加500 μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,隨后棄培養(yǎng)基,用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色。將基質(zhì)膠下層置于倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個視野,對視野下的細(xì)胞記數(shù)。

1.3.7 免疫印跡法檢測FOXP1蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔),培養(yǎng)24 h后,用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,并用BCA定量。將定量后的蛋白溶液行12% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜,并用5%脫脂奶粉封閉1 h。先分別用FOXP1(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液在4 ℃冰箱中將封閉后的蛋白條帶孵育過夜,洗膜后,再用山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液在37 ℃搖床中孵育2 h。最后加顯影液避光顯影,凝膠系統(tǒng)曝光拍照,Image J軟件分析FOXP1相對于GAPDH的表達(dá)量。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?Starbase靶基因預(yù)測軟件顯示,HCG18與miR-34b-5p、FOXP1與miR-34b-5p的核苷酸序列分別存在連續(xù)結(jié)合位點(見圖1)。將U2OS細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔),用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-HCG18、miR-NC與WT-HCG18、miR-34b-5p mimics與MUT-HCG18、miR-NC與MUT-HCG18、miR-34b-5p mimics與WT-FOXP1、miR-NC與WT-FOXP1、miR-34b-5p mimics與MUT-FOXP1、miR-NC與MUT-FOXP1,轉(zhuǎn)染時間為12 h。然后換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并裂解,經(jīng)離心(3 500 r/min、5 min)后,取上清液,檢測熒光素酶活性,結(jié)果以螢火蟲熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析、q檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織中HCG18和miR-34b-5p的表達(dá)及相關(guān)性 骨肉瘤組織中HCG18表達(dá)量高于瘤旁組織(P<0.01),而miR-34b-5p表達(dá)量低于瘤旁組織(P<0.01)(見表1)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.812,P<0.05)。

表1 骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p的表達(dá)

2.2 下調(diào)HCG18對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-HCG18的U2OS細(xì)胞中HCG18表達(dá)量明顯低于Control組和si-NC組(P<0.05),而Control組和si-NC組HCG18表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明下調(diào)HCG18的U2OS細(xì)胞構(gòu)建成功;與Control組或si-NC組比較,si-HCG18組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P<0.05),而Control組和si-NC組各檢測指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 下調(diào)HCG18對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 HCG18靶向負(fù)調(diào)控miR-34b-5p 共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-HCG18的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-HCG18的U2OS細(xì)胞(P<0.01),而共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與MUT-HCG18的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-HCG18的U2OS細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。與Control組或si-NC組比較,si-HCG18組U2OS細(xì)胞中HCG18表達(dá)量降低(P<0.05),而miR-34b-5p表達(dá)量升高(P<0.05)(見表4)。

表3 熒光素酶活性檢測結(jié)果

表4 下調(diào)HCG18對骨肉瘤細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)的影響

2.4 HCG18靶向miR-34b-5p影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與si-HCG18組和si-HCG18+anti-miR-NC組比較,si-HCG18+anti-miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)量降低,U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)升高(P<0.05),而si-HCG18組與si-HCG18+anti-miR-NC組各檢測指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表5和圖2)。

表5 HCG18靶向miR-34b-5p影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

2.5 miR-34b-5p靶向負(fù)調(diào)控FOXP1 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-FOXP1的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-FOXP1的U2OS細(xì)胞(P<0.01),而共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與MUT-FOXP1的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-FOXP1的U2OS細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表6)。同時,與Control組或miR-NC組比較,miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)量升高(P<0.05),而FOXP1蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)(見表7和圖3)。

表6 熒光素酶活性檢測結(jié)果

表7 上調(diào)miR-34b-5p對骨肉瘤細(xì)胞中FOXP1蛋白表達(dá)的影響

2.6 miR-34b-5p靶向FOXP1影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與miR-NC組比較,miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P<0.05);而與miR-34b-5p+pcDNA組比較,miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)升高(P<0.05),miR-34b-5p組與miR-34b-5p+pcDNA組各檢測指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表8和圖4)。

表8 miR-34b-5p靶向FOXP1影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

3 討論

骨肉瘤是一種間質(zhì)細(xì)胞來源的惡性腫瘤,其侵襲性強(qiáng),易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[11]。骨肉瘤細(xì)胞的異常增殖及遷移和侵襲是其發(fā)生發(fā)展的主要原因[12],抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲可起到治療骨肉瘤的作用。近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,發(fā)掘影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的基因分子對骨肉瘤的診斷和治療具有重要意義。lncRNA在真核生物中廣泛存在,其可發(fā)揮miRNA分子海綿作用,調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞生命活動。KCNQ1OT1[13]、ROR1-AS1[14]和CCAT1[15]等多種lncRNA在骨肉瘤中表達(dá)升高,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型,可能是骨肉瘤治療的潛在分子靶點。

作為一種lncRNA,HCG18在多種腫瘤中表達(dá)增加,對腫瘤發(fā)展起促進(jìn)作用。例如,胃癌中HCG18表達(dá)上調(diào),其可通過靶向抑制miR-141-3p的表達(dá)間接調(diào)控Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲,進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)展[16];HCG18在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),其可通過靶向 miR-1271/MTDH軸和Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和侵襲[17];下調(diào)HCG18可通過靶向上調(diào)miR-34a降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,HCG18可作為口腔鱗癌治療的分子靶點[18]。本研究結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中HCG18的表達(dá)明顯高于瘤旁組織,而下調(diào)HCG18阻礙了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,提示HCG18在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用,其可能是骨肉瘤治療的分子靶點。

為了進(jìn)一步探討HCG18促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制,本研究證實了HCG18可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-34b-5p,骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。miR-34b-5p在結(jié)腸癌[19]、胰腺導(dǎo)管腺癌[20]、乳腺癌[21]和膀胱癌[22]等腫瘤中均表達(dá)降低,通過上調(diào)miR-34b-5p的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型,進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示,miR-34b-5p在骨肉瘤中表達(dá)減低,而上調(diào)miR-34b-5p降低了骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性,說明miR-34b-5p對骨肉瘤發(fā)展起抑制作用。本研究還顯示,下調(diào)miR-34b-5p逆轉(zhuǎn)了下調(diào)HCG18對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,進(jìn)一步提示HCG18通過靶向抑制miR-34b-5p來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

此外,本研究證實了FOXP1是miR-34b-5p的靶基因。FOXP1基因位于染色體3p14.1,是一種轉(zhuǎn)錄因子,其蛋白產(chǎn)物在不同腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。FOXP1在食管癌[23]、卵巢癌[24]和肺癌[25]等腫瘤中表達(dá)升高,發(fā)揮促癌基因作用;而FOXP1在結(jié)腸癌[26]和膀胱癌[27]等腫瘤中表達(dá)降低,作為抑癌基因起作用。本研究顯示,下調(diào)HCG18降低骨肉瘤細(xì)胞中FOXP1蛋白表達(dá),而上調(diào)FOXP1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-34b-5p對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,進(jìn)而提示HCG18通過競爭性結(jié)合miR-34b-5p進(jìn)而上調(diào)FOXP1的表達(dá)來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上,HCG18在骨肉瘤組織中表達(dá)升高,其可靶向miR-34b-5p/FOXP1軸促進(jìn)體外骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其可能是骨肉瘤治療的分子靶點。但本研究尚需要在體內(nèi)證實HCG18/miR-34b-5p/FOXP1軸對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響。