喻玢 黃棟

(1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽 550004;2.貴州省人民醫(yī)院,貴州 貴陽 550001)

目前利用干細(xì)胞移植來促使組織修復(fù)的治療手段已成為前沿科學(xué),羊水干細(xì)胞因其取材來源為分娩廢棄物,倫理束縛較小,來源廣泛,取材較為容易,故在前臨床研究中越來越受到重視,羊水是胎兒生長的保護(hù)液,在胚胎發(fā)生期間提供機(jī)械支持和必要的營養(yǎng)。它主要由水、細(xì)胞和化學(xué)元素構(gòu)成[1],人羊水干細(xì)胞(human amniotic fluid stem cells,hAFS)做為羊水中的提取物已被廣泛研究。hAFS已被證明在體外和體內(nèi)具有廣泛的多能性[2],有助于激活內(nèi)源性修復(fù)反應(yīng),同時還具有免疫調(diào)節(jié)功能等。目前已有研究表明人羊水干細(xì)胞(hAFS,human amniotic fluid stem cells)成梭形細(xì)胞形態(tài)[3],其細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的表面標(biāo)志物如CD90,CD105,而不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34、CD45及人類白細(xì)胞抗原基因HLA-dr[4],以上細(xì)胞學(xué)特點均提示人羊水干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的組織修復(fù)作用主要依賴于營養(yǎng)因子、抗炎蛋白和外泌體的旁分泌途徑[5],外泌體含有多種細(xì)胞因子、生長因子、代謝產(chǎn)物以及間充質(zhì)干細(xì)胞自身產(chǎn)生的microRNA(miRNAs),當(dāng)外泌體與相應(yīng)靶細(xì)胞膜融合后,外泌體內(nèi)容物釋放,以microRNA(miRNAs)對受體細(xì)胞進(jìn)行信號調(diào)節(jié)。目前已有學(xué)者證明hAFS對各類肺發(fā)育不良模型中促進(jìn)了胎兒肺再生[6],實驗中證明在支氣管肺發(fā)育不良模型中,氣管內(nèi)給予AFS后可促進(jìn)肺泡發(fā)育,減弱了血管重塑和肺動脈高壓,降低了肺促炎細(xì)胞因子表達(dá),減少了巨噬細(xì)胞浸潤。最新研究顯示,microRNAs(miRNAs)在多種生物過程中扮演了重要角色,如細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等[7],可以通過直接降解靶基因或者抑制其翻譯來沉默靶基因,參與大多數(shù)細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)功能,目前miRNAs在細(xì)胞分化和器官再生中的功能逐漸凸顯,已經(jīng)有多個miRNA被證明在肺發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。發(fā)掘并研究新的miRNAs在肺發(fā)育中的作用對開拓治療肺疾患、促進(jìn)肺組織再生及修復(fù)有著重要意義。

1 資料與方法

1.1差異性miRNA分析 在對hAFS的研究,通過對圍產(chǎn)期hAFS(perinatal human amniotic fluid stem cells,p-hAFS)和胎兒期hAFS(fetal human amniotic fluid stem cells,f-hAFS)miRNAs的差異性比較研究(常規(guī)妊娠Ⅱ期獲得的羊水干細(xì)胞為胚胎期,從妊娠Ⅲ期分離出來的羊水干細(xì)胞為圍產(chǎn)期),通過對p-hAFS和f-hAFS的差異miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析從數(shù)據(jù)集GSE168152獲取p-hAFS(GSM5129985,GSM5129987,GSM5129991,GSM5129994,GSM5129983)和f-hAFS(GSM5129977,GSM5129979,GSM5129981,GSM5129989)的miRNA測序數(shù)據(jù),使用DESeq包比較了5個p-hAFS樣本和4個f-hAFS樣本之間的差異miRNA(篩選條件為:P<0.05,logFC>1)。

1.2靶基因預(yù)測及功能富集分析 通過主流的miRNA-mRNA互作數(shù)據(jù)庫對3個目標(biāo)miRNA(hsa-miR-199b-5p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199a-3p)進(jìn)行預(yù)測分析,這里我們主要選取了miRDB,miRWalk,Starbase進(jìn)行預(yù)測分析;理想狀況下我們?nèi)?個數(shù)據(jù)集的交集作為miRNA的靶基因。但經(jīng)過這樣的處理后hsa-miR-199b-5p 在KEGG富集中只能找到2條通路是顯著的。因此我們對取交集的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了變更,經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn),miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的靶基因數(shù)目最少,因為我們決定只取miRWalk和Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果。通過上述方式在miRWalk和 Starbase數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測得到291個hsa-miR-199a-3p的交集靶基因;同時預(yù)測得到363個hsa-miR-199b-5p的交集靶基因。為了說明差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)功能和信號通路,利用R/Bioconductor package clusterProfiler、org.Mm.eg.db、enrichplot、ggplot2包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

2 結(jié) 果

2.1篩選差異表達(dá)的miRNA 通過對p-hAFS和f-hAFS的差異miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析出p-hAFS及f-hAFS中差異表達(dá)的16個基因,同時注意到在p-hAFS中高表達(dá)的6個miRNA即miRNAhsa-miR-3919,hsa-miR-199a-3p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199b-5p,hsa-miR-875-3p,hsa-miR-424-5p中有3個基因來自同一族系,即hsa-miR-199a-3p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199b-5p。使用heatmap繪制熱圖(圖1)來展示差異表達(dá)情況。基于熱圖可以看到,在p-hAFS中hsa-miR-199a-3p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199b-5p均為hsa-miR-199族系miRNA,且在p-hAFS中的表達(dá)顯著,在一篇胎兒和圍產(chǎn)期人羊水干細(xì)胞的分泌組配方的全面概況[8]中亦檢測到p-hAFS中的hsa-miR-199b-3p的序列。差異表達(dá)的micRNA可能在28周后胎肺加速發(fā)育中發(fā)揮重要作用,繼而為肺發(fā)育的相關(guān)研究提供新的思路。在目前對miR-199基因的前臨床研究中可以了解到miR-199可通過靶向SP1的表達(dá)負(fù)性調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖和纖維化[9],miR-199a/b-3p通過下調(diào)PAK4/MEK/ERK通路可抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖[10],miR-199a-3p可抑制mTOR的表達(dá)引起細(xì)胞自噬從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡降低細(xì)胞增殖[11],但與肺發(fā)育的相關(guān)性尚不明確。通過生物信息學(xué)分析對其靶基因及靶基因功能進(jìn)行富集分析,為深入研究hsa-miR-199a-3p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199b-5p在肺發(fā)育中的生物功能及調(diào)控機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

2.2靶基因預(yù)測及miRNA靶基因功能富集分析 我們分別使用miRDB,miRWalk,Starbase等3個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對hsa-miR-199b-5p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-199a-3p預(yù)測可能結(jié)合的靶基因。研究結(jié)果顯示hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-199b-3p在數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的結(jié)果一致,于是我們選取hsa-miR-199a-3p的預(yù)測靶基因結(jié)果。每個miRNA的靶基因取交集處理,在數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測得到291個交集靶基因。hsa-miR-199b-5p的miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的靶基因數(shù)目較少,因此只選取miRWalk和Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果,共預(yù)測到363個交集靶基因?；谏鲜鼋Y(jié)果,我們對靶基因進(jìn)行功能富集分析,利用R包clusterprofile進(jìn)行通路富集分析。在hsa-miR-199a-3p相關(guān)靶基因的KEGG富集分析中,我們共鑒定出37條富集通路,在GO中共鑒定出505通路被顯著富集,其中包括371條BP,56條CC,78條MF。在KEGG富集結(jié)果中,顯示前30個KEGG通路(圖2)。對GO通路進(jìn)行富集分析,如圖為最顯著差異的前30個GO通路(圖3)。在hsa-miR-199b-5p相關(guān)靶基因的KEGG富集分析中,我們共鑒定出21條通路被顯著富集,在GO中共鑒定出370通路被顯著富集,其中包括268條BP,40條CC,62條MF。在KEGG富集結(jié)果中,我們展示了21條顯著的KEGG通路。(圖4)。hsa-miR-199b-5p相關(guān)靶基因的GO通路展示差異最顯著的前30個富集分析結(jié)果(圖5)。

注:富集得到最顯著的前30個KEGG條目,橫軸表示 KEGG通路的基因數(shù)目,縱軸表示KEGG通路的名稱,顏色表示 Pvalue。

注:富集得到最顯著的前30個GO條目,橫軸表示 GO條目的基因數(shù)目,縱軸表示GO條目的名稱,顏色表示 Pvalue。

注:富集得到最顯著的前21個KEGG條目,橫軸表示 KEGG通路的基因數(shù)目,縱軸表示KEGG通路的名稱,顏色表示 Pvalue。

注:富集得到最顯著的前30個GO條目,橫軸表示 GO條目的基因數(shù)目,縱軸表示GO條目的名稱,顏色表示 Pvalue。

3 討 論

肺發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,受信號分子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。特別是一些miRNAs,miRNA作為一類基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其表達(dá)水平的非編碼RNA,可以通過直接促進(jìn)mRNA的降解或干擾mRNA翻譯來沉默靶基因,發(fā)揮其生物學(xué)作用[12],在肺發(fā)育過程中miRNA可能通過控制分支形態(tài)發(fā)生和上皮和間質(zhì)分化[13],糾正信號分子失調(diào)的網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)肺發(fā)育。目前研究發(fā)現(xiàn)hAFS能夠釋放出包含microRNA的囊泡,能夠抑制炎癥,提供心肌保護(hù),減輕心肌毒性,刺激血管生成等作用[14-16]。使用miRDB,miRWalk,Starbas數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-199a-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測,因hsa-miR-199a-3p與hsa-miR-199b-3p預(yù)測的靶基因一致,故合并討論。

細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上的保守過程,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被雙膜自噬體隔離,然后在各種生理病理條件下被溶酶體降解和回收。自噬作用本身不能促進(jìn)肺組織的發(fā)育,但當(dāng)肺損傷發(fā)生時,自噬可以減輕肺纖維化的形成,W.Zheng等[17]實驗發(fā)現(xiàn)自噬與損傷后的纖維變性呈負(fù)相關(guān)。實驗結(jié)果提示hsa-miR-199a-3p及hsa-miR-199b-5p均富集到AMPK信號通路,且相關(guān)性較高,AMPK激活細(xì)胞自噬作用上調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或啟動調(diào)亡程序促進(jìn)肺損傷病理進(jìn)展。除此以外hsa-miR-199a-3p還富集到兩條與自噬相關(guān)的信號通路,PI3K信號通路及RAS信號通路。PI3K通路可通過激活成熟的PI3K-AKT-mTOR (雷帕霉素的機(jī)械靶點)復(fù)合物1(MTORC1)通路抑制自噬[18],且Ⅰ類PI3K的PIK3CB催化亞基可作為自噬的正向調(diào)節(jié)因子。RAS信號通路可直接激活自噬[19]。hsa-miR-199a-3p及hsa-miR-199b-5p很可能通過細(xì)胞自噬在肺組織損傷發(fā)生時產(chǎn)生積極作用。

除AMPK信號通路外,在hsa-miR-199a-3p及hsa-miR-199b-5p上同時富集到的還有T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)信號通路。而T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)信號主要與細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān),與自噬相同,炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)本身不具有促進(jìn)肺組織發(fā)育的功能,但對肺損傷尤其是支氣管肺發(fā)育不良等疾病具有重要影響[19]。hsa-miR-199a-3p的富集結(jié)果中ErbB信號通路[20]及hsa-miR-199b-5p富集到的IL-7信號通路同樣具有炎癥調(diào)節(jié)的作用。炎癥調(diào)節(jié)作用可在肺組織出現(xiàn)感染等損傷時,下調(diào)其炎性物質(zhì)的表達(dá)從而減輕肺組織的損傷。

血管的發(fā)育在胎肺發(fā)展的過程中有著重要作用,而血管重塑在發(fā)生肺損傷時也是重要的病理過程。在hsa-miR-199a-3p的GO富集分析中,與hsa-miR-199a-3p最顯著差異的前30個GO通路中共有兩個與血管調(diào)節(jié)相關(guān)的通路,血管發(fā)育的正向調(diào)節(jié)、血管生成的正性調(diào)節(jié)),而此機(jī)制可能是hsa-miR-199a-3p影響肺發(fā)育的機(jī)制之一。

在現(xiàn)有的前臨床實驗中,已驗證P53可通過調(diào)節(jié)miR-199a-3p來影響體細(xì)胞編程。而在我們對hsa-miR-199a-3p的富集結(jié)果中,我們富集到miR-199a-3p在動物器官再生、mRNA加工的調(diào)控、體內(nèi)平衡等與組織發(fā)育、細(xì)胞編程相關(guān)的通路,而mRNA加工調(diào)控與樹突棘發(fā)育通路間有共同基因參與。Hsa-miR-199a-3p與細(xì)胞的發(fā)育有著密切關(guān)系。而在hsa-miR-199b-5p的GO富集分析中,細(xì)胞酰胺代謝過程的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、mRNA代謝過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對環(huán)境刺激的反應(yīng)、細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)?；⒓?xì)胞周期檢查點等生物活性通路;其富集到的可參與細(xì)胞編程的通路數(shù)量更多,且在這些通路中有多個基因重復(fù)出現(xiàn),目前已有研究[21]表明miR-199b可抑制VEGF、JAG1、SET蛋白的表達(dá),為其靶基因,可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,延長細(xì)胞周期,并抑制細(xì)胞凋亡,而靶基因的富集結(jié)果與之相符,由此推測hsa-miR-199b-5p可能直接參與到了細(xì)胞對環(huán)境的應(yīng)激甚至mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)中,對于細(xì)胞活性及細(xì)胞反應(yīng)有直接作用,上述通路可能對肺發(fā)育的進(jìn)程產(chǎn)生作用。

綜上所述,hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-199b-3P、hsa-miR-199a-3p是圍產(chǎn)期羊水干細(xì)胞中對肺發(fā)育起作用的因子,對肺發(fā)育的調(diào)控可能是多維度的。hsa-miR-199a-3p及hsa-miR-199b-5p的靶基因具有豐富的生物功能,對靶基因富集到的信號通路進(jìn)行進(jìn)一步分析得出以下結(jié)論:①hsa-miR-199a-3p及hsa-miR-199b-5p可能通過AMPK信號通路、動物自噬、P13k-Akt信號通路等通路上調(diào)細(xì)胞的自噬作用;②通過血管發(fā)育的正向調(diào)節(jié)、血管生成的正向調(diào)節(jié)促進(jìn)肺發(fā)育中肺血管的生成或減輕肺損傷中肺血管重塑;③T細(xì)胞受體信號通路、ErbB信號通路及hIL-7信號通路通過對炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)在肺損傷的過程中起到積極作用;④hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-199a-3p還具有mRNA加工的調(diào)控、DNA損傷檢查點、DNA損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)等具有調(diào)控作用,對肺發(fā)育可能是有益的。