宋巍，徐蓉，李玉鵬，李智德，王錦國，馬超，孟塬，陳雄

0 引言

原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率第五、死亡率第三的惡性腫瘤[1]，中國肝癌的發(fā)病率及病死率遠高于世界平均水平。據(jù)統(tǒng)計，全球新發(fā)病例和死亡病例，有一半在中國[2]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占原發(fā)性肝癌的75%～85%[3]。盡管近幾十年來，HCC的治療得到了較大發(fā)展，但由于HCC具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)以及對化療和放療不敏感等特點[4]，致使HCC患者總體治療效果未得到明顯改善。HCC是多基因、多因素變化所致的疾病，其發(fā)生發(fā)展包括關(guān)鍵生長調(diào)節(jié)基因的遺傳和表觀遺傳轉(zhuǎn)化等復雜過程[5]。為此，從基因調(diào)控角度探究HCC的發(fā)生發(fā)展機制，對該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究及臨床應用具有重要價值[6]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA）是兩類小分子非編碼RNA，均參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、分化等生命過程[7-8]。lncRNA作為內(nèi)源性競爭性RNA與miRNA相互作用，調(diào)控靶基因的表達，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。研究表明，lncRNA對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達和翻譯的調(diào)控至關(guān)重要[10-11]，lncRNA可能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)關(guān)鍵的癌癥途徑[12]。

SET結(jié)合因子2反義RNA1（SET binding factor 2 antisense RNA 1, SBF2-AS1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在多種腫瘤中高表達[13]，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放化療敏感度及預后等，是腫瘤生物標志物和治療的潛在分子靶點[14-16]。SBF2-AS1在HCC細胞中的表達及其對HCC的調(diào)控機制尚不明確。本研究以miR-372-3p/CDK6軸為切入點，探討SBF2-AS1對HCC細胞增殖、凋亡及侵襲等活動的影響及機制，以期為HCC的診斷及分子治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系

正常人肝細胞系H L-7 7 0 2 和H C C 細胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel7402及SKhep1均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自武漢益普生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自廣州蕊特生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自碧云天生物技術(shù)公司，LipofectamineTM2000試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq購自北京智杰方遠科技有限公司；FITC-Annexin V細胞凋亡試劑盒及雙熒光素酶活性試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；cycle TEST PLUS DNA試劑盒購自美科美（北京）生物醫(yī)學科技中心；Transwell小室購自美國Corning公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；SBF2-AS1小干擾RNA（si-SBF2-AS1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-372-3p模擬物（miR-372-3p mimics）、模擬對照序列（mimics-NC）、miR-372-3p抑制劑（miR-372-3p inhibitor）、抑制劑對照序列（inhibitor-NC）、SBF2-AS1過表達載體（pcDNA3.1-SBF2-AS1）、CDK6過表達載體（pcDNA3.1-CDK6）及陰性對照（pcDNA3.1）、雙熒光酶素載體均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔源CDK6、β-actin一抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗均購自美國Abcam公司；PCR引物由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) HL-7702細胞、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel7402及SK-hep1細胞均用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在恒溫箱（37℃、5%CO2）內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Bel7402及SK-hep1細胞，根據(jù)不同實驗階段，分為si-NC組、si-SBF2-AS1組、mimics-NC組、miR-372-3P mimics組、inhibitor-NC+si-NC組、inhibitor-NC+si-SBF2-AS1組、miR-372-3P inhibitor+si-NC組、miR-372-3P inhibitor+si-SBF2-AS1組、mimics-NC+pcDNA3.1組、mimics-NC+pcDNA3.1-CDK6組、miR-372-3P mimics+pcDNA3.1組、miR-372-3p mimics+pcDNA3.1-CDK6組。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 qPCR檢測相關(guān)分組細胞中SBF2-AS1、miR-372-3p的表達 TRIzol試劑法從轉(zhuǎn)染后的細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq說明書進行qPCR，通過2-△△Ct方法計算SBF2-AS1、miR-372-3p的相對表達量。

1.3.3 CCK-8法檢測Bel7402及SK-hep1細胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染后的細胞以5×103個/孔接種在96孔板中，在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。向每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。酶標儀在450 nm波長處測量各吸光度（OD）值。

1.3.4 集落形成實驗 將各組細胞接種于6孔板（500個/孔），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，棄培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌后加入500 μl甲醇固定20 min（-20℃），加入400 μl 1%結(jié)晶紫染色液染色15 min（37℃），隨后顯微鏡（200倍）對其進行觀察，記錄L＞0.1 mm（L為細胞的直徑）的細胞克隆形成數(shù)。

1.3.5 Transwell實驗檢測Bel7402及SK-hep1細胞的侵襲及遷移能力 遷移實驗：收集轉(zhuǎn)染及處理后的各組細胞，將細胞加入上室（每孔200 μl），下室加入600 μl的10%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完畢后取出上室，于37℃使用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗后，在電子顯微鏡下觀察并拍照，計算遷移細胞數(shù)。侵襲實驗：具體步驟與遷移實驗相同，但在加入細胞前，預先在上室表面鋪滿基底膠。

1.3.6 細胞周期實驗 Cycle TEST PLUS DNA試劑盒對細胞進行碘化丙啶染色后，流式細胞儀進行細胞周期檢測，F(xiàn)ACScan軟件進行分析。

1.3.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 胰蛋白酶法獲取細胞。FITC-Annexin V和碘化丙啶雙重染色后，使用FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSBF2-AS1與miR-372-3p及miR-372-3p與CDK6的靶向關(guān)系 分別構(gòu)建SBF2-AS1野生型質(zhì)粒（SBF2-AS1-WT）和突變型質(zhì)粒（SBF2-AS1-MUT），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將SBF2-AS1-WT和SBF2-AS1-MUT分別與mimics-NC及miR-372-3p mimics轉(zhuǎn)染Bel7402細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

分別構(gòu)建CDK6野生型質(zhì)粒（CDK6-WT）和突變型質(zhì)粒（CDK6-MUT），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將CDK6-WT和CDK6-MUT分別與mimics-NC及miR-372-3p mimics轉(zhuǎn)染Bel7402細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3.9 Western blot檢測Bel7402細胞系中CDK6的表達 利用RIPA裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染后的細胞并提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗CDK6（1:1 000）、β-actin（1:1 000）抗體在4℃下處理過夜。TBST洗滌3次，加入二抗（羊抗鼠IgG-HRP抗體，1:3 000）室溫處理1 h。TBST洗滌后，化學發(fā)光法進行顯影，Image J軟件量化蛋白條帶灰度值并計算CDK6相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

以上所有試驗均獨立重復三遍，用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，GraphPad8.0軟件進行繪圖。所有數(shù)據(jù)均以（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SBF2-AS1在肝癌各細胞系中的表達

qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常肝細胞HL-7702相比，HCC細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel7402及SK-hep1中SBF2-AS1呈高表達，其中以Bel7402和SK-hep1細胞中表達最高（P=0.000,P=0.000），見圖1。因此，后續(xù)以Bel7402和SKhep1細胞為研究對象。

圖1 LncRNA SBF2-AS1在各細胞系表達量Figure 1 LncRNA SBF2-AS1 expression in each cell line

2.2 敲降SBF2-AS1后細胞侵襲、增殖情況

結(jié)果顯示，si-SBF2-AS1組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均低于si-NC組；si-SBF2-AS1組細胞相較si-NC組，滯留于G0/G1期細胞比例增加，且細胞凋亡增高（均P＜0.05），見圖2。

圖2 敲降SBF2-AS1后對Bel7402及SKhep1細胞的影響F i g u re 2 E f f e c t o f S B F 2-A S 1 knockdown on Bel7402 and SK-hep1 cells

2.3 LncBase Predicted v.2預測lncRNA SBF2-AS1與miR-372-3p之間的靶向關(guān)系

lncRNA SBF2-AS1與miR-372-3p之間存在結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，WT中，與miR-NC組相比，miR-372-3p mimics組的熒光素酶活性顯著降低（P=0.000）；MUT中，miR-372-3p mimics組與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明SBF2-AS1的3'UTR存在miR-372-3p的結(jié)合位點。

圖3 LncRNA SBF2-AS1可靶向結(jié)合miR-372-3pFigure 3 LncRNA SBF2-AS1 interacted with miR-372-3p in a targeted manner

2.4 lncRNA SBF2-AS1與miR-372-3p的調(diào)控關(guān)系

qPCR法結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組中Bel7402和SK-hep1細胞中miR-372-3p表達量明顯增高（均P=0.000）；與mimics-NC組對比，miR-372-3p mimics組中Bel7402和SK-hep1細胞中SBF2-AS1的表達量明顯降低（均P=0.000），見圖4。結(jié)果提示二者在Bel7402和SK-hep1細胞系中呈負相關(guān)，SBF2-AS1可以靶向負調(diào)控miR-372-3p的表達，miR-372-3p也可以負調(diào)控SBF2-AS1的表達。

2.5 敲降miR-372-3p后Bel7402細胞侵襲、增殖情況結(jié)果顯示，miR-372-3p inhibitor組miR-372-3p

表達明顯降低（P＜0.001），見圖5。與inhibitor-NC+si-NC組對比，miR-372-3p inhibitor+si-NC組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均明顯增高，滯留于G0/G1期比例減少，且細胞凋亡降低，而同時敲降SBF2-AS1后，可反轉(zhuǎn)上述結(jié)果。inhibitor-NC+si-SBF2-AS1組相較于inhibitor-NC+si-NC組，前者細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均明顯減少，滯留于G0/G1期細胞比例增加，且細胞凋亡增加，而同時敲降miR-372-3p后，可以反轉(zhuǎn)上述結(jié)果（均P＜0.05），見圖5。

圖5 敲降miR-372-3p表達后對Bel7402細胞的影響Figure 5 Effect of miR-372-3p knockdown on Bel7402 cells

2.6 miR-372-3p和CDK6有靶定位點

Starbase網(wǎng)預測發(fā)現(xiàn)，miR-372-3p與CDK6存在結(jié)合位點，見圖6。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，WT中，與miR-NC組相比，miR-372-3p mimics組的熒光素酶活性顯著降低（P=0.000）；MUT中，miR-372-3p mimics組與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明CKD6的3'UTR存在miR-372-3p的結(jié)合位點。

圖6 miR-372-3p可靶向結(jié)合CDK6Figure 6 miR-372-3p interacted with CDK6 in a targeted manner

2.7 miR-372-3p負向調(diào)控CDK6 mRNA

結(jié)果顯示，與mimics-NC+pcDNA3.1組相比，miR-372-3p mimics+pcDNA3.1組細胞CDK6表達量明顯降低（P=0.000），而miR-372-3p mimics+pcDNA3.1-SFB2-AS1組細胞CDK6表達量高于前兩組（P=0.020），見圖7。結(jié)果提示miR-372-3p和CDK6在Bel7402細胞中可能呈一種負相關(guān)關(guān)系，且SBF2-AS1過表達后，可以緩解過表達miR-372-3p對CDK6的效應。

圖7 miR-372-3p負向調(diào)控CDK6表達Figure 7 MiR-372-3p negatively regulates CDK6 expression

2.8 過表達miR-372-3p后Bel7402細胞侵襲、增殖情況

與mimics-NC+pcDNA3.1組對比，miR-372-3p mimics+pcDNA3.1組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均明顯降低，且細胞凋亡增高；而miR-372-3p mimics+pcDNA3.1-CDK6組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均高于miR-372-3p mimics+pcDNA3.1組，細胞凋亡低于miR-372-3p mimics+pcDNA3.1組（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000），見圖8。與mimics-NC+pcDNA3.1組比較，mimics-NC+pcDNA3.1-CDK6組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均明顯增高，細胞凋亡減低；而miR-372-3p mimics+pcDNA3.1-CDK6組細胞增殖能力、集落形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)均低于mimics-NC+pcDNA3.1-CDK6組，細胞凋亡高于mimics-NC+pcDNA3.1-CDK6組（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.004），見圖8。

圖8 過表達miR-372-3p對Bel7402細胞的影響Figure 8 Effect of over-expressing miR-372-3p on Bel7402 cells

3 討論

近年來，諸多l(xiāng)ncRNA被證實在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[17]。Lee等[18]在一項前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血lncRNA-ATB水平與肝癌TNM分期、門靜脈血栓形成等因素相關(guān)，是病死率及疾病進展的獨立預測因子。張錦等[19]研究表明，lncRNA PCAT6可能與肝癌患者的Edmondson分級、TNM分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并證實lncRNA PCAT6是潛在的預后預測因子。

lncRNA SBF2-AS1是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于染色體11p15.1位點，是SBF2的一個2708nt的反義RNA[20]。目前認為，SBF2-AS1參與調(diào)控了多個腫瘤的生物過程。研究[21]表明，SBF2-AS1在結(jié)直腸癌細胞中的表達上調(diào)，抑制了miR-619-5p的活性并導致HDAC3過表達，促進結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移。Dai等[22]發(fā)現(xiàn)SBF2-AS1可通過競爭性抑制miR-30a來靶向調(diào)節(jié)叉頭框蛋白家族成員A1表達，促進骨肉瘤增殖、侵襲和遷移，發(fā)揮促癌作用。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1在食管鱗癌細胞Eca109中高表達，沉默SBF2-AS1后，細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移能力均顯著受到抑制。目前，SBF2-AS1對HCC細胞調(diào)控的影響尚不明確。本研究證實SBF2-AS1在HCC細胞中高表達，說明SBF2-AS1參與調(diào)控HCC細胞的發(fā)生發(fā)展，可能是HCC診斷及治療潛在的分子靶點。

LncRNA作為內(nèi)源性競爭性RNA，可通過海綿吸附作用抑制miRNA調(diào)控基因表達，進而調(diào)控腫瘤的生物過程[23]。如lncRNA OIP5-AS1可通過miR-372-3p/USP7軸影響肝癌細胞EMT及侵襲遷移[24]。Wu等[25]研究表明，lncRNA SUMO1P3可通過靶向結(jié)合miR-320a而活化Wnt/β-catenin信號通路，進而促進HCC細胞的增殖與侵襲。本研究通過生物信息學軟件預測顯示，lncRNA SBF2-AS1與miR-372-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點。雙熒光素酶活性報告基因?qū)嶒炞C實，SBF2-AS1可能與miR-372-3p靶向結(jié)合。在HCC細胞中，過表達miR-372-3p可以抑制SBF2-AS1的表達，而敲降SBF2-AS1后，則可以使miR-372-3p的表達增高，提示二者存在一種負向調(diào)控的關(guān)系。

研究[26]表明，miR-372可調(diào)節(jié)許多腫瘤的細胞周期、凋亡、侵襲和增殖。另有研究表明，miR-372可能在非小細胞肺癌患者中轉(zhuǎn)錄后下調(diào)大腫瘤抑制基因2，從而導致腫瘤發(fā)生和增殖[27]。此外，miR-372-3p在肺鱗狀細胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高表達，可顯著促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[28-29]。本研究結(jié)果提示miR-372-3p作為抑癌基因參與HCC的調(diào)控。敲降miR-372-3p后的各項結(jié)果，可同時被敲降SBF2-AS1所反轉(zhuǎn)，提示SBF2-AS1通過負向調(diào)控miR-372-3p的表達，參與調(diào)控HCC細胞的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果提示，在Bel7402細胞系中，miR-372-3p表達上調(diào)后，CDK6表達降低，提示miR-372-3p靶向并負向調(diào)控CDK6的表達。進一步研究證實，在Bel7402細胞中，過表達SBF2-AS1可以緩解因miR-372-3p表達上調(diào)所致的CDK6表達降低，提示SBF2-AS1可以通過對miR-372-3p的海綿吸附作用，調(diào)控CDK6的表達。

細胞分裂蛋白激酶6（CDK6）是細胞周期蛋白D蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白，屬于CDC2相關(guān)激酶家族中一員，具有絲/蘇氨酸激酶活性，是關(guān)鍵的細胞周期調(diào)控因子，其與CDK4發(fā)揮協(xié)同作用，促進細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變[30]。相關(guān)研究表明，CDK6在大多數(shù)腫瘤中呈高表達，具有抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管生成等作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[31-32]。Li等[33]研究表明，DDX11-AS1可以通過增加CDK6的表達，從而促進膀胱癌的進展。He等[34]通過體內(nèi)外試驗證實，NEAT1通過miR-495-3p/CDK6軸促進結(jié)腸癌進展。細胞周期調(diào)節(jié)失控是人類癌癥的共同特征，本研究中l(wèi)ncRNA SBF2-AS1和miR-372-3p結(jié)合位點與miR-372-3p和CDK6結(jié)合位點一致，提示lncRNA SBF2-AS1通過對miR-372-3p的海綿吸附作用，調(diào)控CDK6的表達，從而影響B(tài)el7402細胞的周期活動，導致細胞的增殖、集落形成、遷移、侵襲及凋亡的改變。

本研究結(jié)果提示，lncRNA SBF2-AS1的表達量高于人正常肝細胞。受實驗條件所限，本研究僅選取lncRNA SBF2-AS1表達量增高最為明顯的細胞系行進一步研究，故SBF2-AS1是否通過miR-372-3p/CDK6軸影響肝炎相關(guān)肝癌細胞系的生物活性，還有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究推斷l(xiāng)ncRNA SBF2-AS1海綿吸附miR-372-3p上調(diào)CDK6的表達，通過影響細胞周期活動，促進HCC細胞增殖、遷移及侵襲等。本研究可能為新的肝癌診斷及靶向治療提供實驗依據(jù)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。