胡祖霞，楊中橋

（開封市兒童醫(yī)院 急診科，河南 開封 475000）

患兒在發(fā)生肺炎支原體感染后，如果未能得到及時(shí)有效的對(duì)癥治療，易并發(fā)肺部疾病，其中最為常見的一種即為難治性肺炎支原體肺炎（refractoryMycoplasma pneumoniaepneumonia,RMPP），RMPP 主要表現(xiàn)為心肌炎、胸腔積液以及肺壞死等，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致多臟器衰竭，對(duì)兒童的健康成長造成極大危害［1-2］。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolide antibiotics,MA）作為臨床上常用的藥物被廣泛應(yīng)用于治療患兒RMPP，但RMPP 的發(fā)病機(jī)制在臨床上尚未得到統(tǒng)一。相關(guān)研究認(rèn)為RMPP患兒的患病程度與感染肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae,MP）的多少以及機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有關(guān)，也有研究認(rèn)為患兒病情加重的原因與MP 對(duì)MA 的耐藥性有關(guān)［3-5］。因此，本研究將對(duì)從患兒支氣管肺泡灌洗液中提取的MP DNA 的23S rRNA基因片段做測(cè)序，而后將測(cè)序結(jié)果與MP 標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對(duì)比分析，以期進(jìn)一步明確MP 藥物敏感性與RMPP 患兒發(fā)病之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

84 例RMPP 患兒選自于開封市兒童醫(yī)院在2018 年3 月至2020 年3 月收治的兒童，根據(jù)胸部影像檢查及臨床癥狀將其分為GMPP 組（n=35）以及RMPP 組（n=49）。其中，GMPP 組男20 例（占57.14%），女15 例（占42.86%）；年齡2～12 歲，平均（5.25±2.15）歲；病程4～15 d，平均（7.54±2.06）d；RMPP 組男27 例（占55.10%），女22 例（44.90%）；年齡1～13 歲，平均（6.54±2.46）歲；病程3～16 d，平均（8.13±2.15）d；上述資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《兒童肺炎支原體肺炎中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識(shí)（2017 年制定》［6］和《難治性肺炎支原體肺炎診治中應(yīng)關(guān)注的問題》［7］制定，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他呼吸道感染疾?。幻庖叩拖禄純?；具有哮喘病史及肺結(jié)核患兒。本研究已通過院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者及其家屬知曉研究過程及內(nèi)容。

1.2 方法

1.2.1 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本采集 令患兒采取平躺的方式進(jìn)行支氣管鏡檢查，鎮(zhèn)靜劑選擇呋麻滴鼻液滴鼻、咪達(dá)唑侖，為使支氣管鏡能夠順利達(dá)到病灶，適當(dāng)?shù)脑谥夤茜R上涂抹丁卡因膠漿。由專業(yè)醫(yī)師使用BF-IT290 電子支氣管鏡（江蘇安茂醫(yī)療科技有限公司）由患兒鼻孔一側(cè)入鏡，添加利多卡因麻醉的同時(shí)逐步深入直至到達(dá)患兒的病變部位，而后使用NaCl 溶液（濃度為0.9%）進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，連續(xù)進(jìn)行3 次上述操作，注意3 次操作的使用的灌洗液總量≤10 mL/kg，將痰液收集器進(jìn)行無菌處理，并將其連接在支氣管鏡操作孔道，負(fù)壓100～150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）進(jìn)行抽吸，通過此種方式采集來患兒的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本。GMPP 組其余26 例患兒采集鼻咽吸出物標(biāo)本，由專業(yè)護(hù)士給患兒清潔鼻腔，而后將無菌吸痰管深入鼻孔約7～8 cm 直至咽喉部位，用無菌負(fù)壓吸痰器將鼻腔抽吸物吸出以獲得鼻咽吸出物標(biāo)本。獲取標(biāo)本后將其立即送往生化試驗(yàn)室進(jìn)行病理、病原學(xué)等檢測(cè)。

1.2.2 MP 23S rRNA 基因檢測(cè) MP 23S rRNA 基因的檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光定量RCR 法進(jìn)行（試劑盒來源于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），對(duì)鼻咽吸出物及支氣管肺泡灌液標(biāo)本中的MA DNA 進(jìn)行檢測(cè)，拷貝數(shù)超過1×106copies/L 即為陽性。采用Step one plusTM定量PCR 儀（美國）對(duì)以上檢測(cè)為陽性的標(biāo)本與MA 標(biāo)準(zhǔn)株的MP 23S rRNA 進(jìn)行定量檢測(cè)，將其擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司做測(cè)序，將獲取的序列結(jié)果與MP 23S rRNA 的基因排序作比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25,P75）表示，用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

MP 23S rRNA 基因引物PCR 擴(kuò)增后結(jié)果表明，49 例RMPP 患兒以及35 例GMPP 患兒的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本和鼻咽吸出物標(biāo)本獲得的基因片段大小均為244 bp。見圖1。

圖1 部分MP V 區(qū)MP 23S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 基因測(cè)序結(jié)果及基因變異情況

49 例RMPP 患兒支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中，與MP 標(biāo)準(zhǔn)株23S rRNA 的排序相同的有2 例，并未檢測(cè)出位點(diǎn)突變，見圖2。47 例在2063 位A-G 的發(fā)生耐藥基因突變，突變率為95.92%，未出現(xiàn)2064 位A-G 的突變和2063位A-T 的突變，見圖3。35 例GMPP 患兒支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本和鼻咽吸出物標(biāo)本的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中，與MP 標(biāo)準(zhǔn)株23S rRNA 的排序相同的有6 例，并未檢測(cè)出位點(diǎn)突變；其他的29 例亦均存在2063 位A-G 的耐藥基因突變，突變率為82.86%，未出現(xiàn)2064 位A-G 的突變和2063 位A-T的突變。故兩組患兒（n=84）發(fā)生MP 23S rRNA基因突變的共76 例，突變率為90.48%，且突變均以2063 位點(diǎn)A-G 的突變?yōu)橹鳌?/p>

圖2 MP 標(biāo)準(zhǔn)株的基因測(cè)序（不存在位點(diǎn)突變）

圖3 23S rRNA 基因2063 位A-G 位點(diǎn)突變的測(cè)序圖

2.3 兩組患兒的臨床特點(diǎn)比較

根據(jù)MP 耐藥基因的突變情況分為MA 敏感組（n=8）和MA 耐藥組（n=49），比較結(jié)果顯示：MA 耐藥組發(fā)熱時(shí)間較MA 敏感組長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MA 敏感組患兒糖皮質(zhì)激素的使用率為37.50%，MA 耐藥組使用率為76.32%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；8 例MA 敏感組患兒中RMPP 的發(fā)生率為25.00%，76 例MA 耐藥組患兒中RMPP 的發(fā)生率為61.84%。見表1。

表1 MA 耐藥組和敏感組MPP 患兒的各項(xiàng)指標(biāo)比較

3 討論

近年來，據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)顯示：RMPP 已經(jīng)成為兒童中的主要肺部疾病，對(duì)患兒的生命安全造成嚴(yán)重威脅［8］。MA 因其使用方便、不良反應(yīng)發(fā)生率低的特點(diǎn)，已成為臨床治療RMPP 患兒的主要藥物。但有報(bào)道表明，MP 對(duì)MA 發(fā)生耐藥的情況日趨增多，我國尤其嚴(yán)重，導(dǎo)致有些患兒在MP 感染后選取治療藥物不合理。由于MP 培養(yǎng)時(shí)間長且生長條件極為苛刻，因此傳統(tǒng)的MP 藥物敏感試驗(yàn)耗時(shí)較長［9-11］。本研究通過檢測(cè)MP 基因以判定耐藥基因序列情況，進(jìn)一步判定MP 耐藥是否更加靈敏和快速，以期為MPP 臨床治療中抗生素藥物的使用提供參考。

本研究結(jié)果表明：①M(fèi)A 敏感組和MA 耐藥組患兒中性粒細(xì)胞比例、白細(xì)胞數(shù)、C 反應(yīng)蛋白、淋巴細(xì)胞亞群、肌酸激酶同工酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在陳煜等［12］的研究中，MPP 患兒血液中的C 反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞比例、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)在MA 敏感組和MA 耐藥組中的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），他們把肺部影像學(xué)特征分為4 種類型，即磨玻璃樣滲出、單純的肺門淋巴腫大、點(diǎn)片狀浸潤以及大葉性實(shí)質(zhì)浸潤，上述類型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與本文研究結(jié)果一致。且經(jīng)胸部X 線檢查結(jié)果表明：兩組患兒大葉性肺炎、支氣管肺炎以及伴胸腔積液的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。故若將化驗(yàn)結(jié)果以及胸部影像學(xué)特征用于判定肺炎種類是否是耐藥MA 所導(dǎo)致的，不利于臨床治療方案的決策。②MA 耐藥組患兒RMPP 的發(fā)生率顯著較MA 敏感組高（P＜0.05），提示MP 對(duì)MA 耐藥一定程度上提高了RMPP 的發(fā)生率，應(yīng)提高對(duì)RMPP 的臨床耐藥監(jiān)測(cè)，選擇合理的抗菌藥物，與既往JIN 等［13］的研究保持一致。原因可能是MPP 患兒中性粒細(xì)胞比例增高，表明MP 對(duì)中性粒細(xì)胞具有激活作用，進(jìn)而誘發(fā)了患兒體內(nèi)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)；RMPP患兒機(jī)體內(nèi)CD3-CD8+T 淋巴細(xì)胞等比例明顯增加，提示部分免疫異常變化進(jìn)一步加速了炎癥的產(chǎn)生，從而增加了RMPP 的發(fā)生［14］。③兩組患兒發(fā)生MP 23S rRNA 基因突變的共76 例，突變率為90.48%，且突變均以2063 位點(diǎn)A-G 的突變?yōu)橹鳎崾綧P 對(duì)MA 耐藥的主要分子基礎(chǔ)是23S rRNA V 區(qū)2063 位點(diǎn)的突變，與姚慧生等［15］的研究結(jié)果保持一致。

綜上所述，RMPP 患兒的氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中MP 對(duì)MA 的藥物敏感性比較高，均為MP 23S rRNA V 區(qū)2063A-G 位點(diǎn)的突變。臨床上需要時(shí)刻對(duì)RMPP 患兒的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以及時(shí)選擇合理的藥物。