趙健欽，金京，陳杰

(浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省綠色農(nóng)藥 2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 臨安 311300)

1 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑概況

甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)殺菌劑是繼苯并咪唑類、三唑類后第3 個里程碑式的殺菌劑類別[1]，被廣泛用于防治作物病害[2]。該殺菌劑擁有廣譜、滲透、快速分布等特點和較好的環(huán)境相容性，可用于莖葉噴霧、種子處理，也可進(jìn)行土壤處理。其在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)活性較強(qiáng)，不僅能阻止真菌在植物體內(nèi)侵入和擴(kuò)展，而且能明顯地降低初侵染和再侵染的孢子基數(shù)以達(dá)到防治病害的目的。該類殺菌劑具有良好的內(nèi)吸性和熏蒸作用，被葉片吸收后可在木質(zhì)部中隨水流在運(yùn)輸系統(tǒng)中流動(即內(nèi)吸性)，此外其可在葉片表面的氣相中流動，當(dāng)其隨著氣相進(jìn)入葉片后又可在木質(zhì)部中流動(即熏蒸作用)，使得活性成分能夠有效再分配和充分傳遞。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑耐雨水沖刷性能好、持效期長，因此其活性不受應(yīng)用環(huán)境影響，在晴雨天氣均能提供良好的保護(hù)和治療作用。該類殺菌劑對卵菌綱、藻菌綱、子囊菌綱和半知菌綱病害，如白粉病、銹病、穎枯病、網(wǎng)斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性，且使用劑量低，適用于禾谷類、果樹和蔬菜等多種作物[3]。在我國，QoI 類殺菌劑在各類糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物病害防治上均有登記[4]。

1.1 作用機(jī)理

國際殺菌劑抗性委員會(FRAC)基于交叉抗性模式和作用方式將甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑歸類于C3 (Group 11)(圖1)。該類殺菌劑是以天然源物質(zhì)為基礎(chǔ)，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾和化學(xué)優(yōu)化而具有農(nóng)藥活性，主要作用于真菌線粒體，與線粒體上細(xì)胞色素b 的Qo 位點結(jié)合，阻斷細(xì)胞色素b 和細(xì)胞色素c1之間的電子傳遞，阻止NADH 的氧化和ATP 的合成，抑制真菌呼吸作用、破壞其內(nèi)部的能量循環(huán)從而抑制真菌生長(圖2)[5]。

圖1 基于交叉抗性模式和作用方式的殺菌劑劃分

圖2 甲氧基丙烯酸酯衍生物靶標(biāo)

1.2 種類及應(yīng)用

目前已開發(fā)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑多達(dá)20 余種，廣泛應(yīng)用于草坪、蔬菜、水果、谷類、核果類等植物[9]。各品種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的主要化合物結(jié)構(gòu)存在著一定的差異，因而其內(nèi)吸傳導(dǎo)性、生物活性、防治對象及適用作物存在不同。目前商品化的主要品種有：

嘧菌酯(azoxystrobin)由先正達(dá)開發(fā)并于1997 年上市，1999 年獲中國行政保護(hù)。根據(jù)作物和病害的不同該殺菌劑施用劑量為25～400 g a.i./hm2，通常使用劑量為100～375 g a.i./hm2，如在25 g a.i./100L劑量下，對葡萄霜霉病有很好的預(yù)防作用，在12.5 g a.i./100L 劑量下，對葡萄白粉病和蘋果黑星病有很好的防治效果，在200 g a.i./hm2劑量下，對馬鈴薯疫病具有預(yù)防作用[7]。嘧菌酯是先正達(dá)殺菌劑產(chǎn)品線的重要組成部分，一度占據(jù)全球殺菌劑年銷售額榜首，年銷售峰值超過10 億美元。2019 年，該殺菌劑全球銷售額14.89億美元，2014—2019 年復(fù)合年增長率為4.15%，近年來占據(jù)的全球市場份額始終保持在前10 位[10-11]。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)由巴斯夫公司2000 年研發(fā)并于2002 年上市，該殺菌劑應(yīng)用范圍較廣，現(xiàn)已在全球100 個多國家登記，用于100 多種作物，其中在我國登記的作物有80 余種[4]。研究表明吡唑醚菌酯對多種病原菌有效，例如谷物葉枯病菌(Septoria tritici)和條紋病菌(Pyrenophora teres)，大豆褐紋病菌(Septoria glycines) 、 紫斑病菌(Cercospora kikuchii) 和銹病病菌(Phakopsora pachyrhizi)，荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)，葡萄白粉病菌(Uncinula necator)，番石榴葉斑病菌(Pestalotiopsis disseminatum)[12-16]等。吡唑醚菌酯在食用作物上的用量為50～250 g a.i./hm2，草坪上的用量為280～560 g a. i./hm2。巴斯夫已在我國推出18 個基于吡唑醚菌酯的高效殺菌和對植物具有保健作用的施樂健?系列產(chǎn)品，包括百泰、凱潤、健達(dá)等，這些產(chǎn)品對幾乎所有作物具有病害防治作用及植物保健作用。同時，吡唑醚菌酯作為“有病治病，無病健體”理念的典范，是美國環(huán)保署、歐盟和中國就“植物健康作用”登記的第一個產(chǎn)品[17-18]。2019 年吡唑醚菌酯全球銷售額10.15 億美元，2014—2019 年復(fù)合年增長率為0.30%。

肟菌酯(trifloxystrobin)于1999 年在南非和瑞士上市，被認(rèn)為是第2 代甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對白粉病、葉斑病有特效[7]。大豆是肟菌酯的第一大用藥作物，2015 年，大豆用肟菌酯的銷售額為3.10 億美元，占其全球市場的47.7%；2016 年，大豆用肟菌酯銷售額為3.03 億美元，占其全球市場的47.3%[19]。自上市以來，肟菌酯全球市場總體呈增長趨勢。2015 年，由于全球大豆病害抗性的加劇、氣候條件不利以及轉(zhuǎn)基因作物的大量種植等多方面因素，導(dǎo)致肟菌酯銷售額略有下降，但在2018 年農(nóng)化市場逐漸復(fù)蘇，2019 年肟菌酯全球銷售額為8.42 億美元，2014—2019 年復(fù)合年增長率為4.68%[11]。肟菌酯適配性強(qiáng)，具有較多混配產(chǎn)品，三唑類殺菌劑是其最好的配伍類型。肟菌酯可與三唑類殺菌劑三唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、環(huán)丙唑醇、戊唑醇、三唑酮等進(jìn)行混配，還可與琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑氟唑菌苯胺、氟吡菌酰胺、啶酰菌胺等進(jìn)行混配[4]。

氟嘧菌酯(fluoxastrobin)由拜耳公司于1994 年發(fā)現(xiàn)并于2004 年在歐洲首先上市。作為全新一代QoI類殺菌劑，具有優(yōu)于嘧菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯等同類產(chǎn)品的內(nèi)吸活性、跨層傳導(dǎo)和木質(zhì)部傳導(dǎo)性。該殺菌劑可有效防治100 余種真菌病害，對種傳和土傳病害腥黑穗病、黑穗病等，小麥葉部病害均具有優(yōu)異防效。田間藥效試驗結(jié)果表明，氟嘧菌酯對小麥葉枯病、穎枯病和銹病，大麥云紋病、條紋病和銹病等的防效均達(dá)到或超過醚菌酯[20]，但對大麥白粉病或網(wǎng)斑病等氣傳病害的防效較差[7]。氟嘧菌酯使用量一般為75～200 g a.i./hm2，用作禾谷類作物的種子處理劑時，用量為5～l0 g a.i./100kg。由于該殺菌劑制劑產(chǎn)品可與眾多產(chǎn)品配伍，且目前專利到期，國內(nèi)多家企業(yè)已啟動該產(chǎn)品的登記和上市工作，并獲批開展氟嘧菌酯單劑和復(fù)配制劑的田間試驗，因此氟嘧菌酯在未來存在著巨大的市場潛力，很可能成為繼嘧菌酯后又一優(yōu)良產(chǎn)品。2018 年氟嘧菌酯全球銷售額2.45 億美元，2013—2018 年的復(fù)合年增長率為3.9%[20]。

啶氧菌酯(picoxystrobin)由先正達(dá)2001 年在歐洲首次推出，2006 年由杜邦公司收購后，先后在拉美、北美市場登記，在我國于2012 年7 月獲得臨時登記并于同年11 月獲正式登記。啶氧菌酯是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中內(nèi)吸活性最強(qiáng)的殺菌劑，與嘧菌酯和吡唑醚菌酯等比較，對小麥葉枯病、網(wǎng)斑病和云紋病有更強(qiáng)的治療效果[21-23]，據(jù)報道，該藥劑比嘧菌酯和肟菌酯等具有更好的治療活性[7,24]，且啶氧菌酯在小宗作物上的表現(xiàn)絲毫不輸其同類藥劑，在我國的主要登記也是集中在小宗作物上用來替代嘧菌酯。使用啶氧菌酯防治谷物病害時，谷物的產(chǎn)量和質(zhì)量明顯提高，在生長期無病害發(fā)生，綠葉始終保持完好。冬小麥大田試驗表明，用啶氧菌酯處理的小麥比用肟菌酯處理的平均增產(chǎn)0.2t/hm2[7]。在歐洲小麥試驗田進(jìn)行的試驗中，用啶氧菌酯處理過的小麥產(chǎn)量與對照相比增產(chǎn)22%，比使用醚菌酯和三唑類殺菌劑氟環(huán)唑(epoxiconazole)混劑處理的增產(chǎn)0.4 t/hm2，這表明啶氧菌酯在小麥病害防治中效果好且增產(chǎn)顯著[7,25]。

2006 年，杜邦公司收購啶氧菌酯后，通過一系列新增登記以及開發(fā)復(fù)配產(chǎn)品等方式來提升銷售額，其與環(huán)丙唑醇和苯并烯氟菌唑的復(fù)配產(chǎn)品熱銷于拉美地區(qū)，用于防治大豆、谷物和玉米病害。2019 年，隨著新復(fù)配產(chǎn)品的增多，啶氧菌酯的全球銷售額上升至4.85 億美元，2014—2019 年復(fù)合年增長率為6.74%[26]。2018 年起啶氧菌酯不再在歐洲國家繼續(xù)登記，但這并未影響其在全球其他地區(qū)的銷售，其在國內(nèi)乃至整個亞洲的市場份額還在不斷上升，國內(nèi)廠家正在進(jìn)一步挖掘啶氧菌酯的市場潛能，啶氧菌酯的開發(fā)和利用仍處于上升趨勢[11,25]。

2 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用位點單一，屬于高抗藥性風(fēng)險類殺菌劑[27]，在實際應(yīng)用過程中極易產(chǎn)生抗藥性。隨著生產(chǎn)上頻繁使用和用藥量不斷上升，導(dǎo)致各類病原菌抗性問題日趨嚴(yán)重，給全球糧食安全問題提出了嚴(yán)峻考驗。

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，P＜0.05代表干預(yù)前后效果差異明顯，計量資料和計量數(shù)據(jù)分別使用t檢驗和x2檢驗。

2.1 子囊真菌對QoI 類殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

在QoI 類殺菌劑上市僅2 年后，1998 年首次在德國的谷物類作物中發(fā)現(xiàn)小麥白粉病菌(Blumeria graminis)的QoI 類殺菌劑耐藥菌株，隨著全球該類殺菌劑的用量增加和使用范圍擴(kuò)大，抗性報道逐漸增多[28-29]。Sierotzki 等[30]2000 年在歐洲小麥白粉病菌中發(fā)現(xiàn)抗性菌株，而在之后的十幾年間，小麥白粉病菌的抗藥性在世界范圍內(nèi)仍在不斷蔓延。2008年Sedláková等[31]報道德國、法國、比利時、丹麥和英國均發(fā)現(xiàn)了小麥白粉病菌對肟菌酯不同程度的抗性，在德國最高抗性菌株分布達(dá)到70%～90%。2017 年在澳大利亞的小麥田中同樣也發(fā)現(xiàn)了小麥白粉病菌抗性菌株[32]。2021 年Cowger 等[33]在美國中部和東部15 個州共分離出381 株小麥白粉病菌，它們對吡唑醚菌酯敏感度適中，RF 最大值為11.2(抗性因子RF 指殺菌劑對目標(biāo)菌株與敏感菌株的EC50之比)。

以小麥白粉病為代表的氣傳病害傳播速度較快，目前，在其他白粉病中也陸續(xù)檢測到QoIs 抗性。1999 年美國紐約256 株葡萄白粉病菌(Erysiphe necator)中有2%能夠在嘧菌酯2 mg/L 的劑量下存活[34]。Wong 等[35]2002 年研究發(fā)現(xiàn)QoI 類殺菌劑對美國葡萄白粉病菌存在不同程度的抗性，其中肟菌酯抗性最高(EC50：0.015 mg/L)，其余依次為嘧菌酯(EC50：0.013mg/L)、吡唑醚菌酯(EC50：0.00442mg/L)。僅過了10 年，Miles 等[36]于2012 年在對美國密歇根州的12 株葡萄白粉病菌株的研究中發(fā)現(xiàn)1株抗性突變體，其能在添加100 mg/L肟菌酯的培養(yǎng)基上正常生長，該菌株對肟菌酯的抗藥性是Wong 等在2002年所報道抗性的6 667 倍。當(dāng)前，世界各地均有不同程度的葡萄白粉病菌對QoI 類殺菌劑的抗藥性發(fā)生，在歐洲已有多國出現(xiàn)QoIs 抗性報道[37-38]，Hall等[39]2016 年測得吡唑醚菌酯對澳大利亞72 個葡萄白粉病菌株的EC50值范圍為0.000 5～14.4 mg/L，其中42%的菌株EC50值在1 mg/L 以上。2008—2013年采集自歐洲和澳大利亞的239 株蘋果白粉病菌(Podosphaera leucotricha)對吡唑醚菌酯較敏感，EC50值范圍為1.39～2.07 mg/L，沒有發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株[40]。Heick等[41]2015—2018 年在丹麥和瑞典采集的43 株甜菜白粉病菌(Erysiphe betae) 中監(jiān)測到25 個對吡唑醚菌酯的抗性菌株。

Frederick 等[42]研究發(fā)現(xiàn)紐約和美國東部的果園蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis)對QoI 類殺菌劑抗性較低，67%的供試菌株對QoI 類殺菌劑肟菌酯表現(xiàn)為敏感，僅有28%表現(xiàn)為抗性。直到2020 年，Jaklová等[43]從捷克多地采集的蘋果黑星病菌中發(fā)現(xiàn)，抗性菌株多達(dá)95%。2021 年，Turan 等[44]在意大利北方對49 個蘋果黑星病菌樣品進(jìn)行敏感性測定，結(jié)果顯示，70%以上菌株對肟菌酯表現(xiàn)出抗藥性，EC50值大于0.12 mg/L。由此可見，全球范圍內(nèi)蘋果黑星病菌對QoI 類殺菌劑的抗性水平在迅速升高。

2.2 半知真菌對QoI 類殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

2013 年，日本采集的376 個甜菜褐斑病菌(Cercospora beticola) 中有15 個對嘧菌酯和醚菌酯都有抗性[45]。2015 年，Piszczek 等[46]從波蘭采集的甜菜褐斑病供試菌株中，有56%在添加1 mg/L 嘧菌酯的PDA 培養(yǎng)基中能正常生長，抗性株最高EC50值大于100 mg/L。2018 年，Zakariae 等[47]從摩洛哥采集的甜菜褐斑病供試菌株中至少70%的菌株對嘧菌酯具有抗性，EC50值大于10 mg/L。日本和波蘭甜菜褐斑病菌抗性均為首次報道。段亞冰等[48]在溫室中采集到的黃瓜褐斑病菌(Corynespora cassiicola)對QoIs 類殺菌劑的抗性高達(dá)100%。2014—2018 年采集自阿根廷布宜諾斯艾利斯的82 個小麥褐斑病(Pyrenophora tritici repentis)均為QoIs抗性菌株，以1 mg/L 的嘧菌酯、肟菌酯和唑菌胺酯處理，病菌孢子生長不受抑制。而100 mg/L 的嘧菌酯、肟菌酯和唑菌胺酯對病原菌也無法完全抑制[49]。

2.3 鞭毛真菌對QoI 類殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

2001 年，整個歐洲采用合理的QoI 類殺菌劑施用方案，并對抗藥性進(jìn)行了嚴(yán)密監(jiān)測，因此，當(dāng)時歐洲對葡萄霜霉病的控制整體較好，暫無葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)對QoI 類殺菌劑產(chǎn)生抗性的報道[2]。然而，僅在一年后在法國和意大利就檢測到霜霉病菌對其產(chǎn)生抗性[5]。2005年，王巖等[50]研究結(jié)果表明，烯肟菌酯對我國北京、天津、河北、內(nèi)蒙古、湖北等地采集的52 株黃瓜霜霉病菌EC50范圍為0.003 0～0.031 3 mg/L，平均EC50為(0.010 1±0.003 1) mg/L，具有較高的抗性風(fēng)險。2021 年，Campbell 等[51]在美國佐治亞州3 個葡萄園采集的39 株葡萄霜霉病菌對嘧菌酯和吡唑醚菌酯全部表現(xiàn)出抗性。隨著QoI 類殺菌劑在生產(chǎn)上的頻繁使用和用藥量不斷上升，抗藥性問題呈現(xiàn)加重趨勢，延緩和治理QoI 類殺菌劑的抗性、延長藥劑使用壽命已經(jīng)成為一個迫切需要解決的科學(xué)問題。韓秀英等[52]研究表明，嘧菌酯對19 株我國山東、河北、武漢等地采集的黃瓜霜霉病菌的EC50范圍為0.000 12～0.009 34 mg/L，同時建立了黃瓜霜霉病菌對嘧菌酯的敏感基線。趙建江等[53]研究發(fā)現(xiàn)番茄葉霉病菌對嘧菌酯存在較高的抗性風(fēng)險。

3 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性分子機(jī)制

3.1 靶標(biāo)位點氨基酸取代

在大多數(shù)情況下，QoI 類殺菌劑抗性是由線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因的點突變產(chǎn)生。由于細(xì)胞色素b 由突變率很高的線粒體基因組編碼，因此病原菌極易因該基因的突變而導(dǎo)致耐藥性發(fā)生，在田間極易產(chǎn)生抗藥性。

病原菌對QoI 類藥劑產(chǎn)生抗性的原因主要與cytb基因的127～147 位和275～296 位間的氨基酸區(qū)域有關(guān)，主要表現(xiàn)為第143 位的甘氨酸變?yōu)楸彼?G143A)[2]，和第129 位的苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?F129L)[54]。這種氨基酸轉(zhuǎn)換導(dǎo)致病原菌對殺菌劑的敏感性顯著降低，并且沒有或幾乎沒有適合度損失，根據(jù)病原體和檢測系統(tǒng)的不同，抗性系數(shù)(RF)為100～1 000。具F129L 的菌株大都表現(xiàn)中低抗性，相比之下G143A 分離株基本表現(xiàn)出完全高抗性[55]且出現(xiàn)的頻率更高，例如在歐洲、澳大利亞和美國多個州，從小麥白粉病菌、小麥葉斑病菌、小麥穎枯病菌、大豆灰斑病菌中均鑒定出G143A 突變[29,32,56-58]，目前，Neves 等[59]建立了一種基于G143A 突變的PCR 檢測方法，可以成功區(qū)分QoI敏感和耐藥菌株。準(zhǔn)確監(jiān)測這一突變將有助于減緩QoI 抗性的傳播，并對這一病原菌系統(tǒng)中的殺菌劑抗性管理具有重要意義。此外，在小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophora tritici repentis) 中還發(fā)現(xiàn)了G137R的位點突變[55]，Cosseboom 等[60]在葡萄晚季腐爛病菌中發(fā)現(xiàn)了包含S108A 和A194V 的突變，但這2 種突變的抗性都較低。Zhou 等[61]在荔枝露疫病菌的抗性株中發(fā)現(xiàn)G142A、G142S、Y131C、F128S 等突變，通過分子對接技術(shù)分析表明，由于藥劑自身結(jié)構(gòu)的差異及與口袋腔作用力變化強(qiáng)弱的程度不同，F(xiàn)128S、Y131C 突變株對于不同的殺菌劑具有RF＞500 和RF＜100 不同程度的抗性。

3.2 旁路氧化途徑

除了cytb基因中靶標(biāo)位點氨基酸的取代，其他機(jī)制也可能誘導(dǎo)病原真菌對QoIs 的耐藥性。交替氧化途徑過程中的關(guān)鍵酶AOX 是一種單亞基(非血紅素)含雙鐵的單分子膜蛋白，廣泛存在于植物、真菌和原生線粒體中，其在呼吸過程中充當(dāng)復(fù)合物III 和IV 的旁路，形成一種不同于細(xì)胞色素系統(tǒng)的電子傳遞系統(tǒng)，在植物病原體線粒體內(nèi)形成另一種呼吸途徑，即線粒體的電子通過繞過細(xì)胞色素bc1復(fù)合物QoI 的抑制位點而轉(zhuǎn)移，這種旁路有效克服了QoI 類殺菌劑對復(fù)合物III 的抑制作用[62]。

在亞致死濃度的QoI 殺菌劑壓力下，交替呼吸可能是植物病原真菌從敏感到全面抗性轉(zhuǎn)變的重要途徑。AOX 有誘導(dǎo)表現(xiàn)型和組成型2 種形式，前者多發(fā)生在以細(xì)胞色素為介質(zhì)的呼吸途徑被阻斷或線粒體蛋白的合成受到抑制的情況下，AOX 被誘導(dǎo)表達(dá)，后者則是不受呼吸途徑的影響，不需要其他因子的誘導(dǎo)即可表達(dá)，一般對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性比誘導(dǎo)型的敏感性差。在植物體外，AOX 活性可以被旁路氧化酶抑制劑水楊肟酸(SHAM)抑制，SHAM 是一種相對活性較低的AOX抑制劑，其作為一種抗真菌藥物被觀察到在體外與QoI 類殺菌劑具有協(xié)同增效作用[63-64]。楊維等[65]在含SHAM 培養(yǎng)基中測定肟菌酯對香蕉黑斑病菌菌絲生長的抑制，結(jié)果表明水楊肟酸存在時，肟菌酯對菌絲生長的抑制比肟菌酯單獨(dú)作用效果明顯，但在抗藥菌株中，未觀察到明顯區(qū)別，說明交替氧化途徑在敏感菌株中更為重要[36,55]。

3.3 外排轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制

ABC(ATP-binding cassette)和MFS(major facilitator superfamily)復(fù)合體蛋白是最具代表性的保護(hù)病原菌免受殺菌劑影響的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體[66-67]，可轉(zhuǎn)運(yùn)多種底物，介導(dǎo)各種有毒底物從細(xì)胞外流，防止毒素積累。合成殺菌劑通常被認(rèn)為是對真菌種群的毒素，其功效因此會受到真菌體內(nèi)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的影響[55,68]。植物病原菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中在參與植物對殺菌劑的多重抗性，如灰霉病菌中的BcATRB 和BcATRD 以及青霉菌中的PMR1和PMR5[69]。已有大量研究報道了ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體在病原菌多藥抗性(multi-drug resistance)中發(fā)揮著重要作用。研究者在構(gòu)巢曲霉中第一次檢測到由atrB基因編碼的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體與QoI 類殺菌劑抗性存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該基因過表達(dá)可以保護(hù)病原菌免受幾乎所有供試殺菌劑的抑制作用[55]。MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在病原菌的多藥抗性中也發(fā)揮著重要作用，小麥葉枯病菌的多藥抗性相關(guān)研究指出，Mgmfs1基因的啟動子序列可發(fā)生519 bp 的插入突變，致使該基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥抗性[55]。有報道稱通過插入編碼基因的啟動子可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MFS1 的過表達(dá)，由此引起病原菌產(chǎn)生多重耐藥性[66]。

4 植物病原菌對QoI 類殺菌劑抗藥性治理

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在全世界受到廣泛的應(yīng)用，已超越三唑類成為全球第一大殺菌劑類型，可防治不同作物的多種病害?？剐詳?shù)據(jù)分析表明，該類殺菌劑存在著較高的抗性風(fēng)險[20]。不合理使用藥劑會使抗藥性突變菌株在較短時間內(nèi)形成抗藥性群體，導(dǎo)致殺菌劑失效，從而造成嚴(yán)重?fù)p失，如在西班牙的穆爾西亞瓜類種植區(qū)，僅在2008 年瓜類白粉病菌(Podosphaera fusca)中多達(dá)74%的菌株對QoI 類殺菌劑已產(chǎn)生了抗性[55]。因此，治理抗藥性必須合理規(guī)范藥劑的使用。

抗性風(fēng)險管理需要多方合作，包括但不限于3 個方面：降低殺菌劑本身固有風(fēng)險、規(guī)范殺菌劑施用者操作以及農(nóng)業(yè)相關(guān)部門的積極管理。殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)將病原菌固有風(fēng)險和殺菌劑固有風(fēng)險劃分為高、中、低3 個等級(1=低，2=中，3=高)，將農(nóng)藝風(fēng)險等級同樣劃分為3 個等級(0.25=低，0.5=中，1=高)，結(jié)合病原菌固有風(fēng)險、藥劑固有風(fēng)險和農(nóng)藝風(fēng)險等級，以3 者的乘積作為相對應(yīng)病原菌對殺菌劑的抗性風(fēng)險等級(聯(lián)合風(fēng)險)，其中理論抗性風(fēng)險劃分標(biāo)準(zhǔn)：0～1=低等風(fēng)險，1～3=中低風(fēng)險，3～6=中風(fēng)險，6=中高風(fēng)險，9=高風(fēng)險(表1)[27]。因此，首先應(yīng)盡量減少利用甲氧基丙烯酸酯等高風(fēng)險類殺菌劑防治同樣為高風(fēng)險的病原菌，如白粉病菌、灰霉病菌、霜霉病菌等，避免產(chǎn)生較高的聯(lián)合風(fēng)險[6]。其次，殺菌劑的輪換和混配使用是延緩抗性的有效手段之一，避免長期單一使用某一產(chǎn)品或某一類藥劑，必須采用科學(xué)的混配用藥和輪換用藥防治措施，即與不同作用機(jī)理或不存在交互抗性的殺菌劑混用或輪換用藥，例如圖1中C3 (Group 11)的殺菌劑之間存在交互抗性，而C3 (Group 11A)中的殺菌劑與存在G143A 突變的C3(Group 11)中的殺菌劑無交叉抗性，因而可使用C3(Group 11A)中的殺菌劑與之進(jìn)行混配使用[70]。

表1 殺菌劑固有抗性風(fēng)險和病原菌固有抗藥性風(fēng)險等級[27]

在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步研制開發(fā)具有增效作用或具有協(xié)同作用的殺菌劑混劑，根據(jù)抗藥病原群體形成的主要影響因素，針對性地設(shè)計抗藥性治理策略。綜合考慮所有與抗藥性發(fā)生相關(guān)的影響因子，抗藥性的治理也應(yīng)當(dāng)從施藥者因素出發(fā)。進(jìn)一步建立完善一系列正確的施藥操作規(guī)范，加大全方位宣傳教育，落實到每一位相關(guān)從業(yè)者，使其明確科學(xué)合理用藥的重要性，不得私自加大施藥量。企業(yè)與產(chǎn)品銷售所在地方縣級農(nóng)業(yè)管理部門應(yīng)積極合作，組織開展對農(nóng)藥經(jīng)營者和農(nóng)藥施用者進(jìn)行抗藥性治理、科學(xué)用藥及實際操作性知識培訓(xùn)。例如，施藥者應(yīng)在病害早期施用殺菌劑，避免在病害嚴(yán)重發(fā)生時期噴施高劑量的藥劑，一則達(dá)不到有效的防治，二則在高濃度藥劑的定向選擇下，加速了田間抗性群體的產(chǎn)生和發(fā)展。同時，施藥者還需掌握一定的農(nóng)業(yè)防治措施，如利用非同一寄主作物進(jìn)行輪作或休耕，改變播期，降低田間濕度，注意田園清潔，及時移除、深埋或焚燒修剪或摘除病花、病果、病葉等作物組織等。同時，選用物理防治、生物防治等其他有利于減輕病害發(fā)生和危害的非化學(xué)防治措施，例如選用抗病品種，增強(qiáng)植物對病害的抗病性[71-72]。該措施旨在精準(zhǔn)有效防控病害，減少農(nóng)藥用量，防止病害突發(fā)性流行危害，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)與農(nóng)民增收。此外，為延緩該類藥劑抗藥性突變體的產(chǎn)生速度，對于已有報道顯示對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的作物病害，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥登記管理部門應(yīng)適當(dāng)控制防治該病害具有交互抗性的藥劑登記數(shù)量，并組織登記同類產(chǎn)品的企業(yè)開展抗藥性監(jiān)測。在登記藥劑的產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注抗性風(fēng)險等級，并標(biāo)明相應(yīng)的抗性風(fēng)險管理措施、生長季該產(chǎn)品的使用次數(shù)、不能與其他哪類藥劑混用或輪用等信息。在殺菌劑推廣應(yīng)用之前，藥企必須具有抗藥性風(fēng)險評估報告，預(yù)測病原菌產(chǎn)生抗藥性的潛在風(fēng)險，并在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注抗性風(fēng)險級別。這有助于在田間出現(xiàn)實際抗藥性導(dǎo)致藥劑防效下降之前，指導(dǎo)生產(chǎn)中及早采用預(yù)防性的抗藥性治理。

與此同時，日本殺菌劑抗藥性行動委員會(Japan FRAC)建議，在梨上每年最多使用2 次QoI 類殺菌劑，每個季節(jié)使用吡菌苯威的次數(shù)也需要少于3 次[73]；歐洲農(nóng)業(yè)政策指出，從2014 年起，所有歐盟成員國都應(yīng)實施蟲害綜合治理(IPM)，以減少農(nóng)藥的影響和使用[74]。此外，開展病原菌對QoI 類殺菌劑的抗性監(jiān)測和鑒定工作在病害防治中十分重要。大量文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)細(xì)胞色素b 靶標(biāo)位點氨基酸取代在QoI 類殺菌劑抗性中的作用，但隨著近年來對QoI 類抗性機(jī)制的認(rèn)識不斷深入，越來越多的研究將QoI 類抗藥現(xiàn)象歸因于不同于靶標(biāo)位點氨基酸取代的機(jī)制，例如交替呼吸、外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和其他等未知機(jī)制。因此檢測病原菌群體抗藥性不能僅僅依據(jù)cytb靶標(biāo)位點氨基酸取代，還需建立殺菌劑和防治對象的敏感性基線和抗性監(jiān)測方法，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，明確病原菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展情況，在實踐中進(jìn)一步調(diào)整、補(bǔ)充和完善抗性治理策略，通過改變殺菌劑的應(yīng)用方案，從而有助于防止對QoI 類耐藥的病原體群體的進(jìn)一步發(fā)展[75-76]。