劉光瑞,宗 淵,李 云,曹 東,劉寶龍,包雪梅,3,李建民

(1.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,青海 西寧 810008; 2.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所,青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008; 3.中國(guó)科學(xué)院 藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008)

當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.) Diels]是傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物,主要以根部入藥,是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材,藥用歷史悠久,廣泛應(yīng)用于各類(lèi)方劑中[1-3]。當(dāng)歸根中富含揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、氨基酸、黃酮類(lèi)等活性成分,藥理價(jià)值高,具有抗炎[4]、抗腫瘤[5-7]、抗氧化[8]、保肝護(hù)肝[9]、抗抑郁[10-11]、強(qiáng)腎健體[12],以及促進(jìn)造血[13-14]、舒張平滑肌[15]等作用。與其他中藥材相比,當(dāng)歸中有機(jī)酸多為酚酸類(lèi)化合物[16],酚酸具有多種藥理作用,如抗腫瘤、抗癌等[17-20]。

藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成和積累受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如MYB、bHLH、WRKY、ERF、bZIP等[21]。轉(zhuǎn)錄因子與植物多種生理活動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、脅迫應(yīng)答等過(guò)程密切相關(guān),例如,通過(guò)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[22-28]。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的特征可分為4大類(lèi),包括1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB,進(jìn)一步分為28個(gè)亞家族[29]。其中,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在黃酮、萜類(lèi)等化合物的合成代謝中具有明顯的調(diào)控作用[22],如苦蕎[Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.]FtMYB23通過(guò)調(diào)控黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),促進(jìn)原花青素的合成和積累[30];在低溫脅迫下FtJAZ2可正向調(diào)控花青素的合成和積累[31]。西伯利亞白刺(NitrariasibiricaPall.)NsMYB1能調(diào)控果實(shí)花青素的合成和積累[32]。紅花(CarthamustinctoriusL.)CtFRMYB1和CtFRMYB2能調(diào)控類(lèi)黃酮的合成代謝[33]。盡管多種植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子已被克隆和驗(yàn)證,但當(dāng)歸MYB轉(zhuǎn)錄因子鮮有報(bào)道。

基于課題組前期的研究,從當(dāng)歸不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選到1個(gè)差異表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,其在根中高表達(dá)。通過(guò)同源比對(duì),初步推測(cè)AsMYB44與根部酚酸的特異積累相關(guān),但AsMYB44的功能尚不明確。本研究擬克隆轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,通過(guò)生物信息學(xué)分析、農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和廣泛靶向代謝組學(xué)對(duì)其調(diào)控次生代謝物合成的功能進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究AsMYB44參與當(dāng)歸次生代謝產(chǎn)物合成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸(Angelicasinensis)、Samsun煙草(Nicotianatabacum)種植于青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室育種室。大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)細(xì)胞EHA105購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。卡那霉素(kanamycin,Kan)、利福平(rifampicin,Rif)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)、Tiangen TIANgel Midi Purification Kit試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa Code No.6210A)、SacⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)、QuantStudioTM3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)。

1.2 當(dāng)歸RNA提取與cDNA合成

新鮮當(dāng)歸經(jīng)液氮冷凍后,用高速研磨機(jī)打碎成粉末,使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶質(zhì)量。用Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)測(cè)定其濃度,用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因克隆與植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)本課題組前期篩選得到的AsMYB44基因序列,通過(guò)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以當(dāng)歸cDNA為模板和表1中相應(yīng)引物擴(kuò)增AsMYB44基因。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit試劑盒回收PCR產(chǎn)物,然后用XbaⅠ和SacⅠ限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切,用T4 DNA連接酶4 ℃過(guò)夜連接,構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s：AsMYB44。然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR鑒定后選取陽(yáng)性單克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序無(wú)誤后,挑取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒備用。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析

使用MEGA 11.0軟件的Neighbour-joining法構(gòu)建AsMYB44系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),用在線軟件NCBI Conservation Domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)分析AsMYB44編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和理化性質(zhì)。

1.5 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

利用液氮凍融法將pCAMBIA2300s：AsMYB44重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,涂布于LB固體培養(yǎng)基(Kan+Rif),28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性菌落于LB液體培養(yǎng)基(Kan+Rif)中28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)至D600為0.6～0.8;然后采用葉盤(pán)法侵染煙草[34],經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等,得到轉(zhuǎn)基因煙草植株。使用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA,用AsMYB44基因克隆引物進(jìn)行PCR檢測(cè),篩選陽(yáng)性植株。

1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析

分別選取3株野生型(WT)煙草、T0代轉(zhuǎn)基因煙草根,將符合質(zhì)量要求的樣本總RNA送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq Pe150,每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾、質(zhì)控,得到高質(zhì)量clean reads。將煙草參考基因組(GCF_000715135.1_Ntab-TN90_genomic.fna)與高質(zhì)量clean reads進(jìn)行比對(duì)組裝。組裝的unigenes提交至公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索,與Nr(非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù))、Swiss-Prot(蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù))、KOG(真核生物蛋白相鄰類(lèi)的聚簇)、GO(http：//www.geneontology.org)、KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比對(duì)、基因功能注釋和分類(lèi)。通過(guò)FPKM(fragments per kilo bases per million fragments)確定基因表達(dá)量,以表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|>1、顯著性P-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。同時(shí),將選取的樣本送至武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)分析,每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。樣品經(jīng)凍干、提取、LC-MS檢測(cè)、原始數(shù)據(jù)處理與質(zhì)控等過(guò)程,得到高質(zhì)量數(shù)據(jù),根據(jù)校正后的質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定注釋、差異代謝物統(tǒng)計(jì)與富集注釋分析。

1.7 AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因qRT-PCR分析

選取T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株,提取根組織總RNA,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa Code No.6210A)將上述提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA稀釋100倍備用。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)、阿魏酸-5-羥化酶基因(NtF5H)和肉桂酰輔酶A還原酶基因(NtCCR)的qRT-PCR引物見(jiàn)表1,以煙草肌動(dòng)蛋白(NtActin)基因?yàn)閮?nèi)參基因。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平,用Graphpad prims 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖,3次生物學(xué)重復(fù),取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsMYB44克隆與生物信息分析

從當(dāng)歸中分離克隆獲得AsMYB44的cDNA序列,其開(kāi)放閱讀框(ORF)為903 bp(圖1-A),編碼300個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為33.057 ku,理論等電點(diǎn)為8.84。編碼的蛋白質(zhì)包含PLN03212、MYB domain、SANT結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

A,AsMYB44基因克隆;M,DL5000 marker;1～3,當(dāng)歸葉片cDNA為模板的PCR產(chǎn)物。B,結(jié)構(gòu)域分析。C,AsMYB44系統(tǒng)進(jìn)化分析。A, AsMYB44 gene clone; M, DL5000 marker; 1-3, PCR product of Angelica sinensis leaf cDNA. B, Domain analysis. C, Phylogenetic analysis of AsMYB44.圖1 AsMYB44基因克隆、結(jié)構(gòu)域分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Cloning, domain analysis and phylogenetic analysis of AsMYB44 gene

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,AsMYB44與AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12(AF062864.1)聚到一類(lèi),同源性較高(圖1-C)。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

將pCAMBIA2300s：AsMYB44植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5α,并挑取單克隆進(jìn)行陽(yáng)性PCR檢測(cè)(圖2-A),同時(shí)測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序無(wú)誤菌株提取重組質(zhì)粒備用。采用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105,并對(duì)農(nóng)桿菌菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2-B),用陽(yáng)性菌落侵染煙草。對(duì)獲得的12株T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株,提取基因組DNA進(jìn)行陽(yáng)性鑒定,共有10株煙草擴(kuò)增到特異性目的條帶,與陽(yáng)性對(duì)照條帶大小一致(圖2-C)。與野生型煙草對(duì)比,AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草無(wú)明顯表型差異。

A,1～10為大腸埃希菌菌落PCR,11為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,12為陰性對(duì)照;B,1～9為農(nóng)桿菌菌落PCR,10為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,11為陰性對(duì)照;C,1～12為以轉(zhuǎn)基因煙草DNA為模板的PCR,13為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,14為陰性對(duì)照;M,DL5000 marker。A, 1-10 were PCR products of E. coli colonies, 11 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 12 was negative control; B, 1-9 were PCR products of Agrobacterium colonies, 10 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 11 was negative control; C, 1-12 were PCR products with transgenic tobacco DNA as templates, 13 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 14 was negative control; M, DL5000 marker.圖2 大腸埃希菌菌落、農(nóng)桿菌菌液與轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of Escherichia coli colony, Agrobacterium liquid and transgenic tobacco

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草基因和化合物差異表達(dá)分析

AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草根轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序共得到124 011 108個(gè)clean read。根據(jù)每個(gè)unigene的FPKM值和log2Fold Change進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選,共得到8 084個(gè)差異表達(dá)基因。與野生型煙草相比,4 119個(gè)基因上調(diào),3 965個(gè)基因下調(diào)(圖3-A、圖3-B)。KEGG結(jié)果顯示,34個(gè)差異表達(dá)基因富集到苯丙烷代謝途徑(圖3-C)。

A,差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)圖;B,差異表達(dá)基因火山圖;C,差異表達(dá)基因KEGG富集因子圖。A, Statistical map of differentially expressed genes; B, Volcano map of differentially expressed genes; C, Map of KEGG enrichment factors of differentially expressed genes.圖3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)圖、火山圖、KEGG富集因子圖Fig.3 Statistical graph, volcano graph and KEGG enrichment factor graph of differentially expressed genes

AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草根代謝組學(xué)分析共檢測(cè)到1 137個(gè)代謝物,其中339個(gè)代謝物差異顯著,187個(gè)上調(diào)、152個(gè)下調(diào),差異代謝物主要為酚酸、脂質(zhì)、生物堿、黃酮類(lèi)等化合物(圖4-A)。KEGG分析顯示,差異代謝物主要集中于氨基酸、黃酮類(lèi)、苯丙氨酸等合成代謝途徑(圖4-B)。

聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)對(duì)差異表達(dá)基因富集最多的苯丙烷代謝途徑進(jìn)行分析,結(jié)果表明,苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量上調(diào);該途徑中差異代謝產(chǎn)物主要為酚酸類(lèi)化合物,其中,對(duì)香豆醛(p-coumaraldehyde)、芥子酸(sinapic acid)、對(duì)香豆酸(p-coumaric acid)含量上調(diào)顯著,而肉桂酸(cinnamic acid)、反式-5-O-對(duì)香豆酰莽草酸[trans-5-O-(p-coumaroyl) shikimate]、5-O-對(duì)香豆?？鼘幩?5-O-p-coumaroylquinic acid)含量下調(diào)幅度較大(圖4-C)。

2.4 苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因qRT-PCR分析

轉(zhuǎn)基因煙草根中,苯丙烷代謝通路中結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平顯著提高(圖5),與轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)保持一致。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)的相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)2.28、1.63、2.00、3.14、1.56倍,而肉桂酰輔酶A還原酶基因(NtCCR)、阿魏酸-5-羥化酶基因(NtF5H)的相對(duì)表達(dá)量則下調(diào)。

3 討論

3.1 AsMYB44參與調(diào)控當(dāng)歸酚酸類(lèi)化合物的積累

基于課題組前期的當(dāng)歸不同組織部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從當(dāng)歸中分離出1個(gè)與酚酸合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,AsMYB44與AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12 (AF062864.1)聚到一類(lèi),同源性較高。丹參中過(guò)表達(dá)SmMYB97能激活丹參毛狀根中酚酸化合物的積累,已證實(shí)該基因能激活PAL、C4H、4CL等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量;擬南芥AtMYB11、AtMYB12等轉(zhuǎn)錄因子也能通過(guò)調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響酚酸類(lèi)化合物的合成代謝[35-38]。而酚酸類(lèi)化合物是由苯丙氨酸作為底物,AsMYB44過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草中苯丙氨酸途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)上調(diào)也是關(guān)鍵證據(jù)之一,由此初步推測(cè)AsMYB44可能具備調(diào)控植物酚酸類(lèi)化合物積累的功能。

3.2 過(guò)表達(dá)AsMYB44影響煙草根部化合物積累

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析表明,與野生型煙草相比,過(guò)表達(dá)AsMYB44煙草根中差異表達(dá)基因主要富集在苯丙烷代謝途徑,且該途徑中NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量上調(diào)。廣泛靶向代謝組學(xué)的結(jié)果顯示,差異代謝產(chǎn)物主要為酚酸、脂質(zhì)、生物堿、黃酮類(lèi)等化合物,這些化合物作為前體物質(zhì),主要參與氨基酸、黃酮類(lèi)、苯丙氨酸等的合成代謝?？嗍w中,FtMYB1、FtMYB2的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因和抑制黃酮醇合酶(FLS)基因的表達(dá)量,促進(jìn)花青素的積累[39];FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15、FtMYB16能調(diào)控蘆丁的代謝合成[40];FtMYB1通過(guò)降低黃酮醇合酶基因和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(RT)基因的表達(dá)量抑制黃酮醇的合成[41]。擬南芥中AtMYB111、AtMYB12和AtMYB11能通過(guò)促進(jìn)黃酮醇合酶基因、黃烷酮-3-羥基轉(zhuǎn)移酶基因(F3H)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)和查爾酮合成酶基因(CHS)的表達(dá)量,調(diào)控黃酮醇的合成與積累[42-44]。苯丙烷代謝途徑在植物次生代謝產(chǎn)物的合成代謝中具有重要作用,通過(guò)調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量,進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)代謝物的合成代謝[45]。

3.3 煙草中過(guò)表達(dá)AsMYB44激活苯丙烷代謝途徑

與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)基因煙草T0代根組織中,苯丙烷代謝途徑的NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD、NtCCR等結(jié)構(gòu)基因相對(duì)表達(dá)量有所提高,而NtF5H下調(diào),該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)保持一致。擬南芥中AtMYB11、AtMYB12通過(guò)提高PAL、CHS、FLS、C4H、4CL等基因的表達(dá)量,從而調(diào)控酚酸的合成代謝。丹參SmMYB52、SmMYB97、SmMYB1、SmMYB52、SmMYB111等轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)正向調(diào)控苯丙烷代謝及其下游通路中的PAL、C4H、4CL、TAT、RAS等基因的表達(dá)量,以促進(jìn)酚酸的合成和積累[46-50]。過(guò)表達(dá)SmMYB36會(huì)造成苯丙烷代謝途徑及其下游PAL、4CL、TAT等基因表達(dá)量降低,負(fù)調(diào)控酚酸的合成代謝[51]。本研究中AsMYB44功能驗(yàn)證的結(jié)果與上述報(bào)道相似,AsMYB44轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)正向調(diào)節(jié)苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響酚酸等相關(guān)化合物的合成代謝;其中,對(duì)香豆醛、芥子酸、對(duì)香豆酸含量明顯上調(diào);肉桂酸、反式-5-O-對(duì)香豆酰莽草酸、5-O-對(duì)香豆?？鼘幩岷肯陆?。因此,本研究后續(xù)可進(jìn)一步分析AsMYB44轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控當(dāng)歸酚酸合成的機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究從當(dāng)歸中分離出1個(gè)與酚酸合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時(shí)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系在Samsun煙草中異源表達(dá)并進(jìn)行多組學(xué)聯(lián)合分析,對(duì)其調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,AsMYB44能通過(guò)調(diào)控苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表達(dá)量,正向調(diào)控酚酸的合成代謝,這為當(dāng)歸MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控酚酸等次生代謝物的合成代謝機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。但仍然存在不足之處,后續(xù)還需對(duì)其更深層次的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。