龔保榮,吳紅軍,李本鎮(zhèn),徐大洋,鄒文騰,曲君藝,鮑傳和,朱若林

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

黑斑蛙,俗稱田雞、青蛙,是屬于無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)側(cè)褶蛙屬(Pelophylax)的兩棲動物。黑斑蛙肉質(zhì)鮮嫩,富含維生素,具有豐富的營養(yǎng)價值,深受消費者喜愛。目前,中國人工養(yǎng)殖的黑斑蛙已成規(guī)模,具有廣闊的市場前景[1]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高,其病害也頻繁發(fā)生,給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)報道,黑斑蛙常見疾病包括蛙虹彩病毒病[2]、黑斑蛙蛙病毒病[3]、紅腿病、腐皮病、腹水病、水霉病、腦膜炎、白內(nèi)障等[4]。

2019年以來,安徽舒城地區(qū)部分養(yǎng)殖場黑斑蛙出現(xiàn)眼睛白濁甚至出血、運動異常的癥狀,短期內(nèi)死亡率達到90%以上。為探明其病因,本研究從病蛙中進行細菌分離和純化,得到優(yōu)勢菌,通過革蘭氏染色、生化鑒定、16S rRNA、gyrB基因檢測和進化分析確定該菌的種類,同時對分離菌的PNGase基因進行了克隆和分析,并進行了藥敏檢測,旨在為該病的確診和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019年7月從安徽舒城某蛙養(yǎng)殖場取回典型患病個體,每只體重為100～150 g。

2×TaqMasterMix (Dye)、6×Superstain Loading Buffer購自北京康為世紀(jì)科技有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T載體、PCR產(chǎn)物快速連接試劑盒、DNA marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司。M-H瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染液、微量生化鑒定管和抗生素紙片均購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 細菌的分離培養(yǎng)和生理生化鑒定

取典型患白內(nèi)障病黑斑蛙,用75%乙醇棉球?qū)ζ潴w表消毒,在無菌操作臺中分別取肝臟、眼睛、腦和脊柱的部分組織,將其橫斷面在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線,進行細菌分離操作。將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑取優(yōu)勢菌落重復(fù)劃線培養(yǎng),得到形態(tài)大小一致的純菌落。分別挑取一個單菌落進行革蘭氏染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察細菌的顏色和形態(tài)。根據(jù)Li等[5]將培養(yǎng)好的4株菌接種到9種生化鑒定管中并于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h進行生化鑒定。各挑取1個單菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后,用于后續(xù)實驗。同時取部分菌液加入終濃度為20%的甘油凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 16S rRNA和gyrB基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

在無菌環(huán)境下,挑取單克隆作為模板,以16S rRNA和gyrB通用引物(表1)進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選后,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序得到的16S rRNA序列通過NCBI的BLAST系統(tǒng)進行序列同源性搜索,使用ClustalX 2.0進行多重序列比對,然后使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 米爾伊麗莎白菌16S rRNA和N-糖苷酶引物

1.4 PNGase基因克隆與分析

參考李蒙等[6]及NCBI上FMS-007(GenBank序列號：CP006576)全序列,分別設(shè)計了擴增PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因的引物(表1),利用該引物參考1.3節(jié)擴增獲得PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因全序列,對序列進行測序并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 藥敏試驗

采用Kirby-Bauer紙片擴散法[7],將18種藥敏紙片貼于涂有分離菌的M-H固體平板上,并將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病蛙的主要癥狀

病蛙臨床表現(xiàn)為運動機能失調(diào)、頭部歪斜、眼部白濁甚至出血,同時伴有脊柱彎曲等現(xiàn)象,部分蛙腿部發(fā)紅。解剖后可見肝臟充血腫大、腸道脹氣以及脊柱膿腫(圖1)。

A,眼睛白濁;B,脊柱膿包;C,眼睛出血;D,腸道脹氣。A, Cloudy eyes; B, Spinal pus; C, Eyes bleeded; D, Intestinal flatulence.圖1 患病黑斑蛙臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of diseased Pelophylax nigromaculatus

2.2 細菌分離純化

從肝臟、眼睛、腦和脊柱等4個部位進行細菌分離和純化,得到表面整齊、中間隆起的淡黃色單菌落,從中分離出4株優(yōu)勢菌,分別命名為pn1907-1、pn1907-2、pn1907-3、pn1907-4。革蘭氏染色結(jié)果顯示,分離菌均為短桿狀的革蘭氏陰性菌(圖2)。對分離菌的部分生化指標(biāo)進行了鑒定,結(jié)果如表2所示,4株菌生化反應(yīng)結(jié)果與米爾伊麗莎白菌(DSM 14571)完全一致,其中甘油、硫化氫和卵磷脂吐溫-80培養(yǎng)基生化反應(yīng)結(jié)果與腦膜炎敗血伊麗莎白菌(NCTC 10016)有所不同。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對4株優(yōu)勢菌的16S rRNA進行PCR擴增(圖3),測序結(jié)果顯示,序列長度均為1 479 bp,除極個別堿基外完全一致,表明4株菌為同一種菌。Blast同源性搜索結(jié)果顯示,該菌與腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica,GenBank序列號：EU128743.1)相似性最高,達到99.96%,其次是米爾伊麗莎白菌(GenBank序列號：CP040516.1),相似性為99.86%。與伊麗莎白菌屬的細菌16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,分離菌與米爾伊麗莎白菌和腦膜炎敗血伊麗莎白菌聚為一分支(圖4-A),另有部分腦膜炎伊麗莎白菌聚為另一分支(圖4-B)。

M,Marker DL2000;1,pn1907-1;2,pn1907-2;3,pn1907-3;4,pn1907-4;N,陰性對照。M, Marker DL2000; 1, pn1907-1; 2, pn1907-2; 3, pn1907-3; 4, pn1907-4; N, Negative control.圖3 16S rRNA的PCR電泳Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA PCR

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence

2.4 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增gyrB基因,測序結(jié)果顯示,4株菌gyrB基因長度為1 410 bp。Blast同源性搜索結(jié)果顯示,4株菌與米爾伊麗莎白菌(GenBank序列號：CP040516.1)相似性達100%。與伊麗莎白菌屬構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖5所示,分離菌與米爾伊麗莎白菌聚為一分支。

圖5 基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on gyrB gene sequence

2.5 PNGase基因檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析

以pn1907-1為對象,通過PCR分別檢測了兩種PNGase基因(PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ),結(jié)果顯示,兩種PNGase基因均能檢測到(圖6),測序結(jié)果顯示,兩個基因長度分別為1 475 bp和1 788 bp。BLAST同源性搜索結(jié)果顯示,PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ與米爾伊麗莎白菌(GenBank序列號：CP040516.1)相似性達100%。與伊麗莎白菌屬構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖7、圖8所示,分離菌與米爾伊麗莎白菌聚為一分支。

M,DL2000 marker;1,PNGase F;2,PNGase F-Ⅱ;N,陰性對照。M, DL2000 marker; 1, PNGase F; 2, PNGase F-Ⅱ; N, Negative control.圖6 PNGase基因的PCR電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis result of PNGase gene

圖7 基于PNGase F基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree constructed based on PNGase F gene sequence

圖8 基于PNGase F-Ⅱ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed based on PNGase F-Ⅱ gene sequence

2.6 藥敏試驗

檢測了4株菌對18種藥物的敏感性(表3),結(jié)果顯示,4株菌的藥敏結(jié)果基本一致： 僅對氟苯尼考敏感;對紅霉素、利福平、新生霉素3種藥物中介;對青霉素類、頭孢菌素類、林可酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、多肽類等14種藥物耐藥。

表3 四株菌的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

16S rRNA結(jié)構(gòu)和功能上高度保守,可以判定不同菌屬、菌種間遺傳關(guān)系的遠近[8]。gyrB即促旋酶的B亞單位基因,在信息通路中參與DNA的復(fù)制和修復(fù)等,在近緣種細菌的區(qū)分和鑒定方面具有較高的分辨率[9]。16S rRNA和gyrB是細菌分子生物學(xué)鑒定中最常用的兩種分子標(biāo)記。

據(jù)報道,蛙白內(nèi)障的可能病原包括腦膜炎敗血伊麗莎白菌[10]、黃桿菌Ⅱ b群[11]、藤黃葡萄球菌、淺黃假單胞菌[12]和肺炎克雷伯菌[13]等,其中大量報道的都是腦膜炎敗血伊麗莎白菌[10,14-16]。本研究從患病黑斑蛙中分離到4株優(yōu)勢菌,通過對其16S rRNA序列的同源性比對,結(jié)果顯示其與腦膜炎敗血伊麗莎白菌(GenBank序列號：EU128743.1)的相似性最高,為99.96%,其次是米爾伊麗莎白菌(GenBank序列號：CP040516.1),相似性為99.86%。然而,進化分析結(jié)果顯示,分離菌與部分腦膜炎敗血伊麗莎白菌和米爾伊麗莎白菌聚為一支,而另有一部分腦膜炎敗血伊麗莎白菌聚為一支。經(jīng)查閱文獻,伊麗莎白菌屬細菌在早期鑒定的過程中,僅用常規(guī)的生化鑒定或者16S rRNA基因鑒定經(jīng)常發(fā)生誤判。Janda等[17]的結(jié)果顯示,部分曾被鑒定為腦膜敗血伊麗莎白菌的菌株后被證實為按蚊伊麗莎白菌。Hu等[18]的研究顯示,部分曾被鑒定為腦膜敗血伊麗莎白菌的菌株被證明是米爾伊麗莎白菌。為了進一步確定分離菌的種類,對分離菌的gyrB基因進行了序列分析和比對,BLAST同源性檢索結(jié)果顯示,其與米爾伊麗莎白菌(GenBank序列號：CP040516.1)相似性最高,達100%,基于已有的伊麗莎白菌屬gyrB基因序列構(gòu)建的進化樹顯示分離菌與米爾伊麗莎白菌聚為一支,而腦膜炎敗血伊麗莎白菌聚為另一支,表明分離菌更接近米爾伊麗莎白菌。生化鑒定結(jié)果顯示,在諸多生化特性上,分離菌與米爾伊麗莎白菌保持一致而與腦膜炎敗血伊麗莎白菌相反。加之近年來陸續(xù)有從患病兩棲動物中分離到米爾伊麗莎白菌的報道[18-20],因此,本研究中從患病黑斑蛙中分離到的4株病原菌為米爾伊麗莎白菌。

米爾伊麗莎白菌于2003年首次在和平空間站冷凝水中發(fā)現(xiàn)[6],后被鑒定廣泛分布于土壤和水中。2008年美國報道了該菌引起人類感染的首個病例[21],其可引起人類膿毒癥[22]、胰腺炎[23]、尿路感染[24]等癥狀。近些年,在中國和德國有米爾伊麗莎白菌感染蛙類的報道[17,19,25]。Huang等[25]等建立了米爾伊麗莎白菌感染黑斑蛙的模型,研究顯示,病原菌主要定殖在宿主的大腦,導(dǎo)致神經(jīng)源性器官損傷,黑斑蛙在感染米爾伊麗莎白菌后,其抗氧化功能會逐漸減弱,進一步加劇疾病的發(fā)生。本研究中患病黑斑蛙脊柱部位出現(xiàn)膿包,并從中分離到大量病原菌,表明脊柱被細菌感染,這可能是導(dǎo)致黑斑蛙神經(jīng)異常和行動異常的原因之一。

PNGase是一種去糖基化酶,能夠?qū)Ｒ恍缘財嗔烟擎満偷鞍字g的酰胺鍵[26],最早于1977年從杏仁中發(fā)現(xiàn)并命名為PNGaseA[27],后發(fā)現(xiàn)存在于番茄[28]、稻谷[29]、果蠅[30]、酵母[31]等多種真核生物中,1984年首次從原核生物-腦膜炎敗血伊麗莎白菌中分離到,并命名為PNGase F[32],后作為一種工具酶,廣泛應(yīng)用于糖生物學(xué)研究[33]。李蒙等[6]從腦膜炎敗血伊麗莎白菌(后更正為按蚊伊麗莎白菌)中鑒定到PNGase F和PNGase F-Ⅱ兩種糖苷酶的同工酶。本文對分離菌的PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因序列進行了克隆和分析,結(jié)果表明,分離菌基因組中存在PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ兩種同工酶基因?；谶@兩種同工酶基因序列與伊麗莎白菌屬已有菌構(gòu)建進化樹,結(jié)果顯示,PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ均與米爾伊麗莎白菌聚為一支,與腦膜炎敗血伊麗莎白菌相隔較遠,印證了16S rRNA和gyrB的結(jié)果。此外,基于PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ構(gòu)建的進化樹能很好地將伊麗莎白菌屬細菌進行聚類,表明其可作為伊麗莎白菌屬細菌進行鑒定和聚類分析的保守基因。

藥敏試驗中,本研究以18種常用抗菌藥物對黑斑蛙病原菌進行藥物敏感性檢測,結(jié)果顯示,4株分離株僅對氟苯尼考敏感,對3種藥物中介,而對另外14種藥物耐藥,存在多重耐藥現(xiàn)象,該結(jié)果與雷雪平等[15]的結(jié)果一致。在對氟苯尼考的藥敏測試中,4株分離菌中的pn1907-1、pn1907-3和pn1907-4的抑菌圈直徑很接近,而pn1907-2的抑菌圈明顯大很多,表明不同分離株的耐藥性有所差異,pn1907-2分離株對氟苯尼考的耐藥程度相較其他3株較輕。在本病例中,可使用已批準(zhǔn)的氟苯尼考粉和氟苯尼考注射液進行治療。然而,在蛙類養(yǎng)殖過程中,應(yīng)注重疫苗預(yù)防和中草藥治療,減少抗生素的使用,確需使用抗生素時,需進行藥敏檢測后再針對性地用藥,避免濫用亂用抗生素,減少耐藥性的產(chǎn)生。