王俊凱 劉崢 申?yáng)|晨 董愛(ài)榮

摘 要：采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)探究人工林與天然林東北紅豆杉（Taxus cuspidata）健康針葉與感葉枯病的病葉之間內(nèi)生真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明，紅豆杉針葉感病前后真菌的OTU （Operational Taxonomic Units）變化較小，細(xì)菌的OTU變化較大，天然林比人工林具有更多的真菌OTU數(shù)，細(xì)菌OTU數(shù)差距較小。4組樣品中共有相同的真菌OTU 9個(gè)，占真菌OTU 總數(shù)的9.37%，4組樣品中共有相同的細(xì)菌OTU 34個(gè)，占細(xì)菌OTU總數(shù)的4.19%。在門(mén)水平下，感病前后樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)多度，相比于天然林，子囊菌門(mén)（ Ascomycota ）在人工林中的相對(duì)多度更高，子囊菌門(mén)在4組樣品占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。感病前后樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)多度都發(fā)生了較大變化，相比于天然林，人工林中細(xì)菌種類(lèi)更多。在屬水平下，Genolevuria屬是人工林健康葉中最主要的優(yōu)勢(shì)真菌，穴殼屬（Dothiora）是人工林病葉中最主要的優(yōu)勢(shì)真菌，Buckleyzyma屬是天然林健康葉已知屬中最主要的優(yōu)勢(shì)真菌，Genolevuria屬是天然林病葉已知屬中最主要的優(yōu)勢(shì)真菌。勞爾氏菌屬（Ralstonia）是人工林健康葉中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，1174-901-12屬是人工林病葉中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是天然林健康葉已知屬中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，馬賽菌屬（Massilia）是天然林病葉已知屬中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。推測(cè)出鏈格孢屬（Alternaria）和盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）可能會(huì)導(dǎo)致紅豆杉的葉枯病。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；紅豆杉；葉枯病；真菌多樣性；細(xì)菌多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ??文章編號(hào)：1006-8023（2023）04-0010-09

Diversity of Endophytic Microorganisms in Healthy and Susceptible

Leaf Blight Needles of Taxus cuspidata

WANG Junkai， LIU Zheng， SHEN Dongchen， DONG Airong*

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：：Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to investigate the differences in endophytic fungal and bacterial community structure between healthy and diseased needles of Taxus cuspidata in artificial and natural forests. The results showed that the changes of fungal OTU （Operational Taxonomic Units） were small and the changes of bacterial OTU were large. The natural forest had more fungal OTU number than the artificial forest， and the difference of bacterial OTU number was smaller. There were 9 fungal OTUs in the four groups， accounting for 9.37% of the total fungal OTU. There were 34 identical bacterial OTUs in the four groups of samples， accounting for 4.19% of the total bacterial OTU. At the phylum level， the fungal community composition in the samples before and after infection was basically the same， but degree of relative abundance was significantly different. Compared with the natural forest， the relative abundance of Ascomycota was higher in the artificial forest. Ascomycota was dominant in the four groups of samples. The bacterial community structure and relative abundance changed greatly before and after infection. There were more bacterial species in artificial forests than in natural forests. At the genus level， Genolevuria was the most dominant fungus in healthy leaves of plantations. Dothiora was the most dominant fungus in diseased leaves of plantations， Buckleyzyma was the most dominant fungus in known genera of healthy leaves of natural forests. Genolevuria was the most dominant fungus in the known genera of diseased leaves in natural forests. Ralstonia was the most dominant bacteria in healthy leaves of plantations， 1174-901-12 was the most dominant bacteria in diseased leaves of plantations， Sphingomonas was the most dominant bacteria in known genera of healthy leaves of natural forests. Massilia was the most dominant bacterium in the known genus of natural forest leaf disease. It was speculated that Alternaria and Seimatosporium may cause leaf blight of Taxus cuspidata.

Keywords：High-throughput sequencing; Taxus cuspidate; leaf blight; fungal diversity;bacterial diversity

收稿日期：2022-10-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31670494）

第一作者簡(jiǎn)介：王俊凱，碩士研究生。研究方向?yàn)樯植±韺W(xué)。E-mail： wangjk19970912@163.com

通信作者：董愛(ài)榮，博士，副教授。研究方向?yàn)樯植±韺W(xué)。E-mail： darlmy@tom.com

引文格式：王俊凱，劉崢，申?yáng)|晨，等. 紅豆杉健康與感葉枯病針葉內(nèi)生微生物多樣性[J].森林工程，2023，39（4）：10-18.

WANG J K， LIU Z， SHEN D C， et al. Diversity of endophytic microorganisms in healthy and susceptible leaf blight needles of Taxus cuspidata[J]. Forest Engineering， 2023，39（4）：10-18.

東北紅豆杉（Taxus cuspidata）為紅豆杉屬（Taxus）植物，是珍貴的第三紀(jì)孑遺樹(shù)種[1]，為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹(shù)種[2， 3]，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值和生態(tài)效益[4]。東北紅豆杉終年常綠，是優(yōu)秀的園林綠化樹(shù)種，可以吸附有害氣體，釋放植物精氣，驅(qū)蚊防蟲(chóng)，抗病蟲(chóng)害能力強(qiáng)[5-6]。在 20 世紀(jì) 70 年代，Wani等[7]的研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)名為短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的植物成分進(jìn)行研究后，成功提取出具有較為明顯抗癌效果的紫杉醇，紅豆杉屬植物便成為眾多學(xué)者研究熱點(diǎn)。東北紅豆杉由于其地理環(huán)境以及氣候因素的特殊條件，紫杉醇的平均含量明顯高于其他種的含量[8-9]。東北紅豆杉天然種群本身生長(zhǎng)較緩慢，天然結(jié)實(shí)率低，且對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較嚴(yán)，種群競(jìng)爭(zhēng)力較弱[1， 10]，再加上外界環(huán)境影響，東北紅豆杉天然林已瀕臨滅絕，其保護(hù)形勢(shì)十分嚴(yán)峻[11-13]。

紅豆杉葉枯病會(huì)給東北紅豆杉帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。2021年在黑龍江省穆棱市穆棱鎮(zhèn)人工林內(nèi)發(fā)現(xiàn)了紅豆杉葉枯病的發(fā)生，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在染病針葉上發(fā)病，并最終導(dǎo)致針葉枯死。近些年來(lái)，隨著生物防治的逐漸完善，運(yùn)用植物內(nèi)生菌拮抗病原菌來(lái)防治葉枯病自然是一種較為可行的方法[13， 15]。高通量測(cè)序能夠更為準(zhǔn)確快捷了解微生物的性質(zhì)及其在自然界中的生態(tài)功能，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)能夠一次性檢測(cè)出樣品中可能感染的多種病原物基因組序列， 對(duì)病原檢測(cè)鑒定具有很好的應(yīng)用[16- 17]。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，分析人工林與天然林感紅豆杉葉枯病與健康針葉內(nèi)生微生物的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變化，探知優(yōu)勢(shì)微生物的分布，從而可用于指導(dǎo)篩選紅豆杉針葉內(nèi)生優(yōu)勢(shì)的葉枯病拮抗菌，并探究人工林與天然林內(nèi)生微生物的差異[18-20]。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

采樣地點(diǎn)位于黑龍江省穆棱市穆棱鎮(zhèn)東北紅豆杉人工林及天然林。東北紅豆杉天然林25 hm2樣地，位于穆棱東北紅豆杉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)（43°49′～44°06′ N，130°00′～130°28′ E）。樣地地形走勢(shì)西南高，海拔最高781 m，最低658 m，高差123? m；年平均溫度在-2? ℃，年平均降水量530? mm，土壤為暗棕壤。樣地內(nèi)森林群落優(yōu)勢(shì)種明顯，垂直層次復(fù)雜，是典型的中齡復(fù)層異齡林，其主要建群樹(shù)種為紫椴（Tilia amurensis）、紅松（Pinus koraiensis）、臭冷杉（Abies nephrolepis）和楓樺（Betula costata）等，樣地內(nèi)共有胸徑（DBH）大于等于1 cm木本植物57種，隸屬于22科38屬。獨(dú)立個(gè)體數(shù)為63 877株，平均胸徑為7.83? cm，胸高斷面積26.4? m2。樣地內(nèi)現(xiàn)有東北紅豆杉（Taxus cuspidate）成樹(shù)169株，天然更新幼苗350～450株。

東北紅豆杉人工林（43°45′ N，131°00′ E）約4 hm2，1995年?duì)I建， 土壤為暗棕壤，東北紅豆杉20 a以上開(kāi)始結(jié)實(shí)，40 a以上果實(shí)質(zhì)量高，株行距為2.5? m×3? m，主要建群樹(shù)種為落葉松（Larix gmelinii），樣地內(nèi)現(xiàn)有東北紅豆杉共計(jì)一百多萬(wàn)株。

1.2 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)分別于人工林及天然林采集健康紅豆杉及感葉枯病紅豆杉針葉。2021 年6月18日至20日，采用“S”形十點(diǎn)采樣法，分別剪取 10 棵 15年生健康及感葉枯病紅豆杉針葉。從 10 棵樹(shù)上采集的樣品中分別選取 1.0? g，用無(wú)菌剪刀剪碎，將其混勻后，使用75%乙醇表面消毒1? min，無(wú)菌水沖洗1次，再使用5%（有效氯）次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，從而得到人工林及天然林各 10.0? g 健康樣品及 10.0? g 感病樣品。穆棱鎮(zhèn)人工林健康樣品、感葉枯病樣品分別用S1、L1表示；穆棱鎮(zhèn)天然林健康樣品、感葉枯病樣品分別用S2、L2表示。將樣品分別置于2? mL的無(wú)菌離心管中并于－80? ℃的超低溫冰箱中保存至DNA提取。

1.3 紅豆杉內(nèi)生微生物基因組 DNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè)

紅豆杉樣品的基因組DNA參照 MP 試劑盒 Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200 的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，將所提取到的 DNA 溶于50? μL無(wú)菌水中，混合均勻，置于－80? ℃保存?zhèn)溆?。之后使用NanoDrop2000進(jìn)行基因組DNA濃度及純度檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA完整性檢測(cè)。

1.4 PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

利用提取的 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌選擇ITS1 和ITS2R 作為引物，分別為 5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′和 5′－GCTGCGTTCTTCATC-GATGC－3′；細(xì)菌選擇 799F 和 1193R 作為引物，引物序列分別為 5′－AACMGGATTAGATACCCKG－3′和 5′－ACGTCATCCCCACCTTCC－3′。將其送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，利用 Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò) QIIME（ v1．8．0） 軟件過(guò)濾、拼接和去除嵌合體，去除各樣本中reads 尾部質(zhì)量值在 20 以下的堿基、切除 reads 中含N 部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列（ 長(zhǎng)度閾值 200? bp） ，隨后再對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過(guò)濾。采用Usearch（ v7.1） 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，物種比對(duì)注釋使用RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間大于0.8 的注釋結(jié)果。用R語(yǔ)言工具繪制稀釋性曲線(xiàn)、韋恩（Venn）圖、群落結(jié)構(gòu)圖及主坐標(biāo)分析圖（Principal Co-ordinates Analysis，PcoA）。利用 Mothur 軟件（version v.1.30.2 http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_diversity）進(jìn)行 Chao1 （估計(jì)物種總數(shù)）指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（ Shannon）、氣旋能量指數(shù)（Accumulated cyclone energy， Ace）、辛普森（Simpson）指數(shù)、Coverage（覆蓋度）指數(shù)計(jì)算分析，并在各分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。生境內(nèi)的多樣性指數(shù) （within-habitat diversity，Alpha）可用來(lái)反映生物群落的豐富度和多樣性。其中，Ace、Chao1指數(shù)可反映生物物種的豐富度，其數(shù)值越大表示該樣品物種豐富度越大，其中Ace指數(shù)用來(lái)估計(jì)樣本中物種組成的均勻度的指數(shù)，Chao1指數(shù)用來(lái)估計(jì)樣本中所含OTU（Operational Taxonomic Units）數(shù)目的指數(shù)；Shannon、Simpson指數(shù)可以反映生物群落的多樣性，其中Shannon指數(shù)用來(lái)衡量群落的異質(zhì)性，其數(shù)值越大表示群落多樣性越高，Simpson指數(shù)代表隨機(jī)取樣的2個(gè)體屬于不同種的概率，其數(shù)值越大表示群落物種分布越均勻；Coverage指數(shù)則可以反映生物群落的覆蓋度，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。生境間多樣性 （between-habitat diversity，Beta）分析通過(guò)對(duì)不同微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

通過(guò)對(duì)人工林及天然林健康紅豆杉及感葉枯病紅豆杉針葉4種樣品進(jìn)行高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，S1、L1、S2、L2分別得到102 022、87 750、100 624、65 973條有效真菌序列及16 090、15 336、18 905和15 983條有效細(xì)菌序列，采用對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法， 以抽到的序列數(shù)與其所代表的OTU數(shù)構(gòu)建稀釋曲線(xiàn)（圖1）。由圖1可以看出，4種針葉內(nèi)生微生物的稀釋曲線(xiàn)均趨于平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)能很好地反映各樣品中真菌及細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，更多的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。

將測(cè)序所得的有效序列按97%的相似度進(jìn)行OTU的劃分后整理繪制的Venn圖（圖2）。由圖2（a）可知，在4組處理中檢測(cè)到的真菌總OTU數(shù)為950個(gè)，其中S1組有222個(gè)、L1組有204個(gè)、S2組有306個(gè)、L2組有218個(gè)。4組樣品中共有相同的OTU89個(gè)，占 OTU 總數(shù)的9.37%，4組樣品中特有的 OTU 數(shù)目分別為58、17、74、31個(gè)；由圖2（b）可知，在4組處理中檢測(cè)到的細(xì)菌總OTU數(shù)為811個(gè)，其中S1組有274個(gè)、L1組有121個(gè)、S2組有279個(gè)、L2組有137個(gè)。4組樣品中共有相同的OTU34個(gè)，占 OTU 總數(shù)的4.19%，4組樣品中特有的 OTU 數(shù)目分別為144、17、100、17個(gè)，以上結(jié)果表明天然林比人工林具有更多的真菌與細(xì)菌OTU數(shù)，細(xì)菌OTU數(shù)量差距較小；感病后，針葉的真菌與細(xì)菌OTU數(shù)量減少。

2.2 感病前后紅豆杉針葉的微生物群落門(mén)類(lèi)組成

在97％的相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，由表1可知，4組紅豆杉針葉微生物多樣性豐富，將不同樣品中相同的真菌進(jìn)行合并，共鑒定得出真菌6個(gè)門(mén)、24個(gè)綱、71個(gè)目、164個(gè)科、300個(gè)屬、427個(gè)種，將不同樣品中相同的細(xì)菌進(jìn)行合并，共鑒定得出細(xì)菌23個(gè)門(mén)、47個(gè)綱、104個(gè)目、161個(gè)科、248個(gè)屬、350個(gè)種。其中，人工林健康針葉與天然林健康針葉的真菌及細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量明顯高于人工林感病針葉與天然林感病針葉（人工林健康針葉的真菌種類(lèi)數(shù)量稍高于人工林感病針葉）。

在相似水平為97%的條件下，與16S嵌合體數(shù)據(jù)庫(kù)（Gold database）及ITS嵌合體數(shù)據(jù)庫(kù)：（UNITE）對(duì)比，對(duì)所得序列進(jìn)行聚類(lèi)分析， 圖3為感病前后人工林與天然林內(nèi)生真菌和細(xì)菌在門(mén)水平上的群落結(jié)構(gòu)特征（物種多度占比大于0.1%的門(mén)）。由圖3（a）可知，從真菌分類(lèi)門(mén)水平看，人工林和天然林4種樣品檢測(cè)出3個(gè)相對(duì)多度較高的真菌類(lèi)群，即： 子囊菌門(mén)（ Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（ Basidiomycota）及未鑒定出的真菌（ unclassified_k__Fungi）。其中S1、L1、S2和L2中子囊菌門(mén)的相對(duì)多度依次降低，擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)多度依次升高。S1 和L1中Ascomycota的相對(duì)多度分別為83.02%與78.81%，明顯高于S2和L2；S2和L2中unclassified_k_Fungi的相對(duì)多度分別為29.95%與33.37%，明顯高于S1和L1。結(jié)果表明，在門(mén)水平下，感病前后樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)多度；相比于天然林，Ascomycota在人工林中的相對(duì)多度更高。

由圖3（b）可知，從細(xì)菌分類(lèi)門(mén)水平看，人工林和天然林4種樣品主要檢測(cè)出6個(gè)相對(duì)多度較高的細(xì)菌類(lèi)群，即： 變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteriota）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、粘球菌門(mén) （ Myxococcota）和酸桿菌門(mén)（ Acidobacteriota）。其中Proteobacteria與Actinobacteriota為4組針葉共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，S1、L1、S2和L2中Proteobacteria的相對(duì)多度分別為67.44%、35.26%、52.24%和86.29%；Actinobacteriota的相對(duì)多度分別為8.14%、58.38%、41.39%和11.38%。Myxococcota為L(zhǎng)1 及S2共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，分別占比4.74%和4.66%。Firmicutes與Bacteroidota只在S1中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，Acidobacteriota只在L1中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。結(jié)果表明，在門(mén)水平下，感病前后樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)多度都發(fā)生了較大變化；相比于天然林，人工林中細(xì)菌種類(lèi)更多。

根據(jù)物種分類(lèi)結(jié)果，由于樣品中所檢測(cè)出的真菌及細(xì)菌種類(lèi)繁多，許多物種含量很少，因此篩選出優(yōu)勢(shì)物種，并對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)并將在2組樣品中含量均小于1%的物種合并至其他類(lèi)別。由圖4（a）可知，從真菌分類(lèi)屬水平看，Genolevuria屬為S1、L1、S2和L2中共有的優(yōu)勢(shì)真菌，占比為4.97%～16.62%。S1中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為尾孢屬（Cercospora）、副孢霉屬（Paramycosphaerella）、柱隔孢屬（Ramularia）、Mycodiella屬、膜盤(pán)菌屬（Pezoloma）、小莢孢腔菌屬（Sporormiella）和Arthrocatena屬；L1中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為鏈核盤(pán)菌屬（Monilinia）、穴殼屬（Dothiora）和白孔座殼菌屬（Leucostoma）；S2中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為Buckleyzyma屬和Retiarius屬；L2中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為銀耳屬（Tremella）、酵母菌屬（Mrakia）、彎擔(dān)菌屬（Curvibasidium）、附球菌屬（Epicoccum）、褐銀耳屬（Phaeotremella）、鐮孢屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibberella）。健康樣品S1和S2中特有的真菌為維希尼克氏酵母屬（Vishniacozyma）、柱隔孢屬（Ramularia）、Dioszegia屬和Arthrocatena屬；感病樣品L1和L2中特有的真菌為鏈格孢屬（Alternaria）和盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）；人工林樣品S1和L1中特有的真菌為外囊菌屬（Taphrina）、短梗霉屬（Aureobasidium）、亞隔孢殼屬（Didymella）和Claussenomyces屬；天然林樣品S2和L2中特有的真菌為Buckleyzyma屬、多臂菌屬（Trichomerium）和Retiarius屬。

由圖4（b）可知，4組樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不盡相同，且相對(duì)多度的差異也較大。從細(xì)菌分類(lèi)屬水平看，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為S1、L1、S2和L2中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，占比分別為1.94%、2.71%、14.23%和6.42%。S1中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為勞爾氏菌屬（Ralstonia）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、代爾夫特菌屬（Delftia）、噬氫菌屬（Ottowia）、大腸埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、湖沉積桿菌屬（Limnobacter）、norank_f__PHOS-HE36屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、Clostridium_sensu_stricto_8屬和亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）；L1中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為內(nèi)桿菌屬（Endobacter）；S2中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為動(dòng)球菌屬（Kineococcus）、中村氏菌屬（Nakamurella）、湖沼菌屬（Limnohabitans）、norank_f__norank_o__Gaiellales屬、Klenkia屬和諾卡氏菌屬（Nocardioides）；L2中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為嗜酸菌屬（Acidiphilium）。健康樣品S1和S2中特有的細(xì)菌為勞爾氏菌屬（Ralstonia）、貪噬菌屬（Variovorax）、擬桿菌屬（Bacteroides）、中村氏菌屬（Nakamurella）、湖沼菌屬（Limnohabitans）、norank_f__norank_o__Gaiellales屬和Klenkia屬；感病樣品L1和L2中特有的細(xì)菌為嗜酸菌屬（Acidiphilium）；天然林樣品S2和L2中特有的細(xì)菌為弗萊德門(mén)菌屬（Friedmanniella）和克雷伯菌屬（Klebsiella）。

2.3 群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性

由表2可知，本研究將相似度為97%的序列劃分為1個(gè) OTU，進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算，并以5個(gè)衡量指數(shù)詳細(xì)列出了4組樣品中微生物的豐富度和多樣性分布情況。所有樣品真菌及細(xì)菌的覆蓋度（Coverage）均超過(guò) 99.67%，表明真菌及細(xì)菌的測(cè)序深度已達(dá)到較高水平，數(shù)據(jù)可靠。

感病前后人工林與天然林4組紅豆杉針葉樣品中真菌與細(xì)菌群落的 Alpha 多樣性指數(shù)部分有差異。 4組樣品的真菌與細(xì)菌群落中S2（天然林健康樣品）的 Chao1指數(shù)最高，即測(cè)得OTU 數(shù)最高，其次分別為 L2（天然林感病樣品）、S1（人工林健康樣品）和L1（人工林感病樣品），樣品S1及L1的Chao1指數(shù)差異不顯著，Ace多樣性指數(shù)所表現(xiàn)的多樣性規(guī)律與 Chao1多樣性指數(shù)結(jié)果一致。表明天然林樣品的真菌與細(xì)菌豐富度指數(shù)高于人工林樣品；在天然林及人工林中，健康樣品的真菌與細(xì)菌豐富度指數(shù)高于感病樣品，但人工林健康樣品與感病樣品相差不大。

4組樣品的真菌與細(xì)菌群落中S1的 Shannon指數(shù)最高，其次分別為 S2、L2、L1，4組樣品的真菌與細(xì)菌群落中Shannon指數(shù)均差異較大，Simpson多樣性指數(shù)所表現(xiàn)的多樣性規(guī)律與Shannon多樣性指數(shù)結(jié)果相反。表明健康樣品的真菌與細(xì)菌多樣性指數(shù)高于感病樣品；相比于天然林，在人工林中，健康樣品的真菌與細(xì)菌多樣性指數(shù)明顯高于感病樣品。

2.3.2 Beta多樣性

PCoA分析可用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性，此分析以點(diǎn)的形式將多組數(shù)據(jù)的差異性反映在二維坐標(biāo)圖上，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離的遠(yuǎn)近代表樣品中群落的差異程度。由圖5可以看出，S1與L1、S2與L2的微生物構(gòu)成差距較大，即同地區(qū)健康與感病樣品的微生物構(gòu)成差距較大；S1與S2、L1與L2的微生物構(gòu)成差距較大，即不同地區(qū)同為健康與感病樣品的微生物構(gòu)成差距也較大。

3 討論

本研究通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)人工林與天然林紅豆杉健康葉和感葉枯病針葉內(nèi)生微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，用數(shù)據(jù)說(shuō)明了上述兩者之間共生細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。關(guān)于病害對(duì)微生物群落的影響，Wei等[21]發(fā)現(xiàn)病原菌侵染微生物群落會(huì)導(dǎo)致群落的多樣性下降，而本研究得出了相同結(jié)論：健康針葉的Ace、Chao1及Shannon多樣性指數(shù)均高于感病針葉，可能是病原菌侵入破壞了原有微生物群落的平衡。

本研究發(fā)現(xiàn)，相比于健康樣品，人工林與天然林感病樣品中特有的真菌為鏈格孢屬（Alternaria）和盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）。目前盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）已記錄有38種，這一屬中的某些種可以致病，比如大白花杜鵑病害[22]。商娜等[23]確定白三葉草葉斑病病原菌為喬木鏈格孢（Alternaria arborescens），楊志英等[24]確定茶葉斑病病原菌為長(zhǎng)柄鏈格孢菌（Alternaria longipes），劉俏等[25]確定櫻桃葉斑病病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata），目前鏈格孢屬真菌已記錄有500多種，且95%寄生在不同植物上，鏈格孢屬真菌寄主范圍廣，侵染能力強(qiáng)并且危害程度大。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬（Alternaria）和盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）可能為紅豆杉葉枯病的病原菌。

利用內(nèi)生菌進(jìn)行植物病害生物防治是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，貪噬菌屬（Variovorax）在土壤與植物環(huán)境中廣泛分布，且該菌具有固氮作用，目前并未作為致病病原細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)，陳丹[26]發(fā)現(xiàn)Variovorax可以作為拮抗菌抑制灰葡萄孢霉菌。故接下來(lái)的研究方向可以著重研究Variovorax對(duì)于病原菌屬的拮抗能力及拮抗原理。

4 結(jié)論

紅豆杉發(fā)生紅豆杉葉枯病后，感葉枯病病葉與健康葉相比，細(xì)菌、真菌的多樣性及物種總數(shù)都顯著下降，在門(mén)及屬水平上差異都較為顯著；天然林比人工林具有更多的真菌與細(xì)菌物種數(shù)，細(xì)菌物種數(shù)差距較小。本研究確定了人工林與天然林內(nèi)生微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)多度，明確了感病前后，病葉與健康葉在門(mén)與屬水平上的具體差異，推測(cè)出鏈格孢屬（Alternaria）和盤(pán)雙端毛孢屬（Seimatosporium）可能會(huì)導(dǎo)致東北紅豆杉的葉枯病，并通過(guò)查閱文獻(xiàn)，確定了一種可能拮抗病原菌的細(xì)菌：貪噬菌屬。研究結(jié)果為接下來(lái)拮抗菌拮抗紅豆杉病的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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