楊 立,王 志,董浩旭,劉艷娟,黃冬梅

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院,湖北 武漢 430000)

多囊卵巢綜合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是常見的女性生殖內分泌疾病,以月經稀發(fā)、高雄激素血癥、高胰島素血癥、持續(xù)無排卵和卵巢多囊樣化為特征。研究表明,PCOS與高雄激素血癥、高胰島素血癥和胰島素抵抗(IR)、下丘腦-垂體-卵巢軸功能障礙有關[1-4]。多數女性在青春期時就已出現高雄激素血癥、胰島素抵抗和肥胖等傾向,部分甚至在此期即被確診為PCOS[4-6]。由于青春期女性的生殖、內分泌系統尚處于可塑造階段,若在此階段盡早干預,則有可能在青春期實現對PCOS的改善甚至逆轉。目前,臨床治療PCOS以調整月經周期及藥物促排卵等對癥治療為主[7]。

研究表明,針灸是治療PCOS女性生殖內分泌功能障礙的一種安全有效的方法[8]。臨床研究發(fā)現,針灸可提高PCOS患者的排卵率和妊娠率,調整月經周期,降低黃體生成素(LH)、LH/卵泡刺激素(FSH)比值、睪酮、空腹胰島素水平等[9]。本團隊前期研究發(fā)現,電針可改善青春期PCOS大鼠的動情周期、卵巢形態(tài)和異常的神經內分泌,其作用機制與改變下丘腦Kisspeptin表達和促性腺激素釋放激素(GnRH)釋放有關[10]?；诖?本研究通過建立青春期PCOS大鼠模型,觀察電針對青春期PCOS大鼠下丘腦和卵巢組織中雄激素受體(AR)、雌激素受體(ER)表達的影響,旨在進一步探究電針改善青春期PCOS神經內分泌異常的分子機制,現報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 選取清潔級(SPF)SD 大鼠14只[動物許可證號:SCXK(京)2016-0006],包括雌性大鼠10 只(體質量250g左右)及雄性大鼠4只(體質量280g左右),均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 藥物 雙氫睪酮(DHT)(貨號:SZBD263XV),由德國Sigma公司提供。

1.3 試劑與儀器 AR(貨號:A16200)、孕激素受體(PR)(貨號:A0321)、ER(貨號:A16668)抗體均購于中國武漢愛博泰克生物科技有限公司;RIPA 裂解液(強)(貨號:G2002-100)、BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:G2026)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(貨號:G5037)、SDSPAGE凝膠制備試劑(貨號:G2003)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號:G2013)、TBST 緩沖液(貨號:G0001)、吐溫-20(貨號:WGT8220)、甘氨酸(貨號:G5010)、三羥甲基氨基甲烷(貨號:G5009)、二抗稀釋液(貨號:G2009)、一抗稀釋液(貨號:G2025)、脫脂奶粉(貨號:G5002)、二抗(貨號:926-32111)、PBS 緩沖液(貨號:G0002-2L)、戊巴比妥(貨號:G5003)、4%多聚甲醛固定液(貨號:G1101-500ML)均購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司;針灸針(規(guī)格:0.16mm×25mm)購于無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司;電針儀(型號:AS-SUPER4S)購于德國Schwa-Medico公司;臺式高速離心機(型號:BDF-1600)購于北京市六一儀器廠。

2 實驗方法

2.1 分組與模型制備 青春期PCOS大鼠模型采用出生前雄激素化(PNA)大鼠,具體造模方法參照參考文獻[11]。將上述購入的大鼠雌、雄分籠飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心SPF 級屏障系統[設施證明號:SYXK(鄂)2016-0057]。實驗期間,大鼠自由飲食,溫度、光照和濕度均符合SPF 級動物房要求。整個實驗過程中動物的處理遵循華中科技大學動物研究委員會指南(倫理號:2298)。適應性喂養(yǎng)1周后,每日下午3時對雌性SD 大鼠行陰道涂片,在顯微鏡下觀察,若處于動情前期則與雄性SD 大鼠合籠。次日在顯微鏡下觀察陰道涂片,若有精子,則記為懷孕第1日。在大鼠懷孕第16日至第19日給予皮下注射0.3mL含3mgDHT 的小麻油或0.9%氯化鈉溶液。將注射DHT 的孕鼠誕下的雌性子鼠按照隨機數字表法分配為模型組(M 組)、電針組(EA 組)、假電針組(SA 組),注射0.9%氯化鈉溶液的孕鼠誕下的雌性子鼠則為正常組(N 組),每組8只。

2.2 干預方法 于雌性子鼠出生后第36 日開始干預。EA 組選取雙側足三里、雙側三陰交和氣海。腧穴定位標準參照參考文獻[12]。將子鼠固定于自制布袋中,露出后肢和腹部,將一次性無菌針灸針快速刺入相應穴位并捻轉,并在同側足三里、三陰交連接電針儀,通上強度為2 Hz、脈沖長度為0.3 ms、頻率為2mA的電流,使其肌肉輕微顫動。每日1 次,每次25min,連續(xù)治療5d后休息2d,重復該治療過程至其出生后第49日。SA 組選取4個非經非穴點施針,其中兩個為子鼠雙側足三里與陽陵泉連線的中點,另外兩個為關元旁開3寸。將子鼠固定于自制的布袋中并露出后肢和腹部,將針快速刺破皮膚后不捻轉,針刺深度＜5mm。將針接上電針儀但不接通電流,干預時間與電針組一致。同期M 組和N組亦被固定在自制布袋中,但不給予針刺處理,固定時間與其他兩組相同。

2.3 陰道涂片和動情周期觀察 分別于雌性子鼠出生后第29日至第49日早上8點行陰道涂片,并置于顯微鏡下觀察。根據細胞種類的不同或占比多少判定大鼠的動情周期[13]。大鼠動情周期包括動情前期、動情期、動情后期和動情間期,各階段特點如圖1所示。具體而言,動情前期以有核上皮細胞為主,偶爾伴有少量白細胞;動情期以無核角化細胞為主,白細胞和上皮細胞很少或顯微鏡下不可見;動情后期則白細胞、上皮細胞、角化細胞均能在顯微鏡下觀察到;動情間期以白細胞為主,顯微鏡下可見大量白細胞,或大量白細胞和上皮細胞。多囊卵巢綜合征大鼠常伴有紊亂的動情周期,并可見延長的動情間期。

圖1 大鼠動情周期各個階段陰道涂片顯微鏡下細胞形態(tài)特點(10X)

2.4 樣本采集 于雌性子鼠出生后第49 日采集樣本。用1%的戊巴比妥進行腹腔注射,子鼠深度麻醉后經腹主動脈采集血樣,離心30 min分離血清,存于-80 ℃冰箱待測。采集血樣后對子鼠實施處死,迅速收集子鼠下丘腦和卵巢組織,用錫箔紙包裝后放入-80 ℃冰箱。

2.5 卵巢組織形態(tài)學觀察 卵巢用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,縱向連續(xù)切成4μm 厚的切片。切片用蘇木精和伊紅染色,光鏡下觀察卵巢的組織形態(tài)學。

2.6 蛋白免疫印跡法 將下丘腦和卵巢組織溶解于含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液中,隨后以4℃的離心機(離心速度12000r/min)離心15min取上清液,上清液即為總蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度,根據蛋白濃度,按40 mg上樣量計算上樣體積。提取的蛋白樣品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳,電泳后將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上(孔徑0.22mm)。轉膜后的條帶用5%脫脂牛奶在封閉室溫下封閉60 min。隨后放入一抗孵育盒,4 ℃條件下過夜,一抗稀釋比例如下:β-actin,稀釋比為1∶5000;AR,稀釋比為1∶100;PR,稀釋比為1∶1000;ER,稀釋比為1∶100。第2 日,將條帶用TBST 緩沖液連續(xù)洗3次,每次10min,隨后用二抗孵育盒(稀釋比為1∶10000)在室溫下避光孵育90min,之后條帶用TBST 緩沖液避光連續(xù)洗3 次,每次10min。最后,在雙色紅外熒光成像系統odyssey(LICOR,美國)下掃膜,查看條帶。

2.7 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件分析數據。計量資料采用K-S檢驗,若符合正態(tài)分布且方差齊,以均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析進行組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 動情周期 N 組為正常的動情周期,包括動情間期、動情前期、動情期和動情后期。M 組動情周期無動態(tài)變化,動情期和動情前期明顯縮短,呈持續(xù)動情間期。EA 組與SA 組動情間期明顯縮短,動情期和動情前期延長。見表1。

表1 4組大鼠動情周期各階段時長(d)

3.2 卵巢組織形態(tài)學觀察 N 組在各個階段的卵泡和黃體均可見,卵泡內結構清晰,顆粒層較多,排列整齊;M 組可見多個囊性卵泡,卵泡的顆粒細胞層明顯減少,排列紊亂,且黃體少見;EA 組黃體和竇性卵泡較M組增多,囊性卵泡少見;SA組仍可見囊性卵泡。見圖2。

圖2 4組大鼠卵巢組織形態(tài)學變化

3.3 下丘腦中AR、ER 及PR 蛋白表達比較 4組大鼠下丘腦中AR、PR 蛋白表達總體比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。M 組下丘腦中AR 蛋白表達高于N組,ER 蛋白表達低于N 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。EA 組下丘腦中AR 蛋白表達低于M 組,ER 蛋白表達高于M 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。SA組下丘腦中AR、ER蛋白表達與M 組比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。4組大鼠下丘腦中PR蛋白表達總體比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3、表2。

表2 4組大鼠下丘腦中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白條帶灰度值與內參值的比值比較(±s)

表2 4組大鼠下丘腦中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白條帶灰度值與內參值的比值比較(±s)

注:1.N 組,正常組;M 組,模型組;EA 組,電針 組;SA 組,假 電針組;AR,雄激素受體;PR,孕激素受體;ER,雌激素受體。2.與N 組比較,△P＜0.05;與M 組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 AR/β-actin ER/β-actin PR/β-actin N 組 8 1.12±0.15 1.27±0.15 4.21±0.58 M 組 8 1.70±0.25△ 0.69±0.20△ 4.00±0.34 EA 組 8 1.16±0.19▲ 1.06±0.18▲ 4.08±0.58 SA 組 8 1.71±0.18 0.70±0.09 3.87±0.31

圖3 4組大鼠下丘腦中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白表達水平

3.4 卵巢中AR、ER 及PR 蛋白表達比較 4組大鼠下丘腦和卵巢中AR、ER 蛋白表達總體比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。M 組卵巢中AR 蛋白表達高于N 組,ER 蛋白表達低于N 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。EA 組卵巢中AR 蛋白表達低于M 組,ER 蛋白表達高于 M 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。SA 組卵巢中AR、ER 蛋白表達與M 組比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。4組大鼠卵巢中PR 蛋白表達總體比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖4、表3。

表3 4組大鼠卵巢中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白條帶灰度值與內參值的比值比較(±s)

表3 4組大鼠卵巢中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白條帶灰度值與內參值的比值比較(±s)

注:1.N 組,正常組;M 組,模型組;EA 組,電 針組;SA 組,假電針 組;AR,雄激素受體;PR,孕激素受體;ER,雌激素受體。2.與N 組比較,△P＜0.05;與M 組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 AR/β-actin ER/β-actin PR/β-actin N 組 8 1.28±0.20 2.15±0.13 0.91±0.10 M 組 8 1.89±0.15△ 1.52±0.19△ 0.78±0.17 EA 組 8 1.36±0.13▲ 2.09±0.19▲ 0.79±0.12 SA 組 8 1.66±0.20 1.56±0.18 0.90±0.05

圖4 4組大鼠卵巢中雄激素受體、孕激素受體、雌激素受體蛋白表達水平

4 討論

PCOS是一種常見的內分泌疾病,其特點是慢性無排卵和高雄激素血癥,臨床主要表現為月經周期不規(guī)律、多毛、痤瘡和不孕等。目前,西醫(yī)對本病的病因與發(fā)病機制尚未完全明確。PCOS歸屬中醫(yī)“不孕癥”“月經后期”“閉經”等范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩?“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長;二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時下,故有子?！睕_脈不盛,任脈不通,氣血無法順利下行,導致月經延期、稀發(fā);痰瘀阻滯沖任、胞宮,則卵泡成熟障礙;痰瘀阻滯胞宮,積而不去,形成癥瘕,導致卵泡排出障礙。朱虹麗等[14]通過查閱文獻探析PCOS的證型分布,結果顯示PCOS以腎虛為本,痰濕瘀阻為標,虛、痰、瘀貫穿本病的全過程,并影響著病情的發(fā)展。腎藏精,主生殖,腎氣的盛衰在天癸的產生中起主導作用。夏桂成[15]認為本病所處階段始終停留在經后期,其主要病理歸咎于腎陰癸水不足,卵子不能發(fā)育成熟,痰濕蘊阻,卵巢呈多囊樣改變。陰陽互根,陰虛日久及陽,腎陽虛衰,火不暖土,致脾陽不振,不能運化水液,水濕內停,濕聚成痰,痰濕壅盛,膏脂充溢于形體,表現為形體肥胖;同時痰濕阻礙機體氣血運行而成瘀,氣血不能下注于胞宮,表現為月經量少、月經后期、閉經甚至不孕;濕為陰邪,易傷陽氣,久則損及脾腎,故痰濕進一步導致腎虛加重,形成惡性循環(huán)。

針灸療法具有多靶點、多層次、整體調節(jié)的作用特點,在臨床上被廣泛用于治療各類不孕癥[8,16]。中醫(yī)認為,PCOS的基本病機是陰陽失衡、氣血失調及臟腑經絡功能障礙[17]。本研究主要觀察電針對青春期PCOS大鼠下丘腦和卵巢組織中性激素受體表達的影響,首先通過注射DHT 成功建立青春期PCOS大鼠模型,再選取足三里、三陰交和氣海進行電針操作。根據經絡腧穴理論,氣海為任脈穴,是一身之元氣聚集之處,可以調節(jié)全身氣機。三陰交是足三陰經交匯處,可以補益肝腎、健脾利濕,恢復氣血運行。足三里是足陽明胃經合穴、胃之下合穴,具有健運脾胃、補益后天之本和益氣養(yǎng)血之功。加用電針刺激以上三穴能進一步強化其調補肝脾腎、補益先后天之本、補益氣血、調節(jié)陰陽失衡、促進氣血運行的作用。研究結果顯示,經電針治療后,青春期PCOS大鼠動情周期紊亂及卵巢多囊形態(tài)均明顯改善,假電針雖能在一定程度上改善青春期PCOS大鼠動情周期,但對卵巢多囊形態(tài)無明顯影響,表明電針在改善青春期PCOS大鼠卵巢多囊形態(tài)方面明顯優(yōu)于假電針。

PCOS的神經內分泌特征是GnRH 和LH 的脈沖頻率和幅度升高。PNA 動物在青春期就表現出PCOS的神經內分泌特征,如GnRH 和LH 釋放頻率和水平明顯增加、高雄激素血癥等,是研究青春期PCOS下丘腦神經內分泌異常的理想模型[18]。因此,筆者采用PNA 大鼠作為青春期PCOS 模型。PCOS模型大鼠表現出不規(guī)則的動情周期和卵巢形態(tài)改變,包括動情間期持續(xù)時間延長、動情期減少、囊性卵泡增加、竇狀卵泡減少、排卵前卵泡及黃體數量減少等,表明模型大鼠卵泡發(fā)育障礙并排卵減少。此外,PCOS模型大鼠還表現出PCOS的神經內分泌特征,即血漿LH 水平的升高,下丘腦GnRH 的釋放增加[10]。在下丘腦弓狀核,Kisspeptin神經元是性激素的負反饋作用靶點,性激素通過與Kisspeptin神經元上的相應受體結合,反饋性抑制Kisspeptin 表達,進而抑制Kisspeptin-GPR54信號通路,降低GnRH 和LH 的分泌[19]。下丘腦中性激素受體表達異?？赏ㄟ^Kisspeptin-GPR54信號途徑導致GnRH 和LH 的異常分泌。TIANL等[20]對258例PCOS患者的AR 基因編碼外顯子進行測序分析,檢測到5個雜合子突變,即p.V3M、p.Q72R、p.S158L、p.S176R 和p.G396R,表明AR 的突變或異常表達與PCOS 的發(fā)生密切相關。出生前雄激素化的成年雌性大鼠中AR 的過度激活可導致GnRH 脈沖發(fā)生器過度活躍[21]。DOUMA Z 等[22]發(fā) 現PCOS 患 者ER 基 因 變 異(rs2234693、rs3798577、rs3020314和rs1256049)與LH、LH/FSH或雄激素水平升高相關,與代謝綜合征(rs9340799)和高血糖(rs3798577)相關性更為顯著。雌激素受體α亞型(ERα)敲除的雌性小鼠表現出血漿LH 水平顯著升高和GnRH mRNA表達增加[23]。以上研究表明,ER、AR的異常表達可導致PCOS的神經內分泌紊亂。

本研究結果顯示,PCOS 模型大鼠下丘腦中AR蛋白表達增加,ER 蛋白表達下降,而PR 則無變化,這為AR、ER 參與PCOS 異常的神經內分泌提供了證據。本課題組前期研究發(fā)現,電針可通過調節(jié)下丘腦Kisspeptin/GnRH 系統而改善青春期PCOS 大鼠的神經內分泌異常[10]。本研究結果顯示,EA 組下丘腦中AR 蛋白表達下調,ER 蛋白表達上升,進一步證明電針對青春期PCOS大鼠動情周期紊亂情況和卵巢多囊形態(tài)的改善作用可能與其調節(jié)下丘腦和卵巢中的AR 和ER 表達有關。電針通過糾正下丘腦中異常表達的AR 和ER,恢復性激素對Kisspeptin/GnRH/LH系統的負反饋調節(jié)作用,從而改善青春期PCOS的神經內分泌異常。ER 是維持卵巢顆粒細胞分化、卵泡和卵母細胞生長發(fā)育及排卵功能的關鍵受體[24]。本研究結果顯示,干預前青春期PCOS模型大鼠卵巢中ER 蛋白表達下降,表明卵巢中ER 蛋白表達下降與PCOS卵泡發(fā)育不良和排卵障礙有關[25]。此外,AR在卵泡發(fā)育調節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。有研究顯示,敲除AR 的大鼠生殖能力明顯下降,表現為卵泡發(fā)育不良、排卵減少及卵巢早衰[26-27]。然而,PCOS的卵巢局部雄激素水平過高或AR 表達異常增加雖然可以刺激更多始基卵泡進入生長周期,但卻可抑制卵泡的發(fā)育成熟及排卵,從而導致卵巢多囊樣改變[28]。本研究結果顯示,干預前青春期PCOS模型大鼠卵巢中AR 蛋白表達明顯增加;給予電針治療后,青春期PCOS模型大鼠卵巢中ER、AR 蛋白的異常表達均得到改善,表明電針治療可抑制AR、ER 在卵巢中的異常表達。

綜上所述,青春期PCOS模型大鼠的卵泡發(fā)育和排卵功能障礙與下丘腦和卵巢中ER、AR 的異常表達有關。電針可改善青春期PCOS 模型大鼠的排卵障礙,其作用機制可能與上調下丘腦和卵巢中ER 的表達,以及下調AR 的表達有關。本實驗結果部分闡釋了低頻電針治療PCOS 的作用機制,為電針改善PCOS提供了一定的實驗證據支持。然而本研究觀察指標較少,僅僅在蛋白水平探討了電針對下丘腦和卵巢性激素受體變化的影響,還需進一步的探究其基因表達,特別是下丘腦具體神經元核團和卵巢具體細胞中的表達變化。