李玲玲 朱原野 張盛培 李 河

（南方人工林病蟲(chóng)害防控國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林生物資源與有害生物綜合管理湖南省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，主要種植于我國(guó)南方14 個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)），至今已有兩千多年的栽培歷史（陳永忠等, 2013）。近年來(lái)，我國(guó)油茶種植面積持續(xù)增加，油茶籽產(chǎn)量不斷提高，截至2019 年全國(guó)油茶種植面積達(dá)到453.3 萬(wàn)hm2，油茶籽產(chǎn)量達(dá)267.9 萬(wàn)t。油茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展對(duì)維護(hù)我國(guó)糧油安全、推動(dòng)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，鞏固油茶產(chǎn)區(qū)農(nóng)民脫貧致富成果具有重要作用（張立偉等,2021）。但隨著油茶種植面積的迅速增加，各類(lèi)油茶病害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，其中油茶炭疽病是危害油茶最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重阻礙了油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前已報(bào)道的油茶炭疽病的病原菌主要有：膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、果生炭疽菌（C.fructicola）、暹羅炭疽菌（C. siamense）、山茶炭疽菌（C.camelliae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、博寧炭疽菌（C.boninense）、（C. henanense）、哈銳炭疽菌（C. horri,C.nymphaeae）（Liet al., 2018；李河等, 2015；2017；Liet al., 2020）。

復(fù)合侵染是指2 種或2 種以上的病原物共同侵染寄主植物引起病害的現(xiàn)象。目前研究表明，在馬鈴薯（Solanum tuberosum）、蠶豆（Vicia faba）、甜瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays），番茄（Lycopersicon esculentum）等多種植物中存在由病原物復(fù)合侵染引起的病害，Li 等（2021）研究表明，番茄褪綠病毒（ToCV）和番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）復(fù)合侵染番茄時(shí)具有協(xié)同增效作用，導(dǎo)致番茄病害嚴(yán)重度指數(shù)高，莖高和莖重降低。錢(qián)恒偉等（2017）研究發(fā)現(xiàn)甘薯莖枯病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）復(fù)合侵染引起的。吳會(huì)杰等（2021）研究報(bào)道黑點(diǎn)根腐病菌（Monosporascus cannonballus）和鐮孢菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）復(fù)合侵染引起甜瓜根腐病。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在分離油茶炭疽病病原菌的過(guò)程中，除炭疽屬之外，總能分離出擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）和鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌。進(jìn)一步致病性測(cè)定結(jié)果表明，擬盤(pán)多毛孢屬和鏈格孢屬真菌都是油茶的致病菌。由此筆者推測(cè)，油茶炭疽病可能存在炭疽菌和其他致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。

油茶炭疽病的防治措施主要是化學(xué)防治。曹志華等（2012）發(fā)現(xiàn)10%苯醚甲環(huán)唑WG 對(duì)油茶炭疽病病原菌的室內(nèi)毒力最強(qiáng)；陳紹紅等（2007）室內(nèi)和田間試驗(yàn)表明，撲菌清、葉斑凈和寶寧對(duì)油茶炭疽病的防治效果較好；王義勛等（2014）田間試驗(yàn)結(jié)果表明，40%氟硅唑乳油2 000 倍液或10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑4 500 倍液對(duì)油茶炭疽病的防治效果較好。但是，一種殺菌劑對(duì)不同屬甚至同屬不同種病原菌的抑制活性存在較大差異，如氟吡菌酰胺對(duì)牡丹炭疽病菌的抑制作用較好，但對(duì)辣椒炭疽病菌則沒(méi)有抑制作用（徐娜娜等，2021；高楊楊，2021）；代森錳鋅對(duì)鏈格孢（Alternaria alternata）具有抑制作用，但對(duì)炭疽病菌（C.gloeosporioides）和新擬盤(pán)多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）幾乎沒(méi)有抑制作用（馮寶珍等，2019；曹志華等，2012；溫浩等，2019）。前期研究發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病斑中除炭疽菌以外，可能還存在其他致病菌，防治多種病菌復(fù)合侵染的油茶炭疽病目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，為了有效防治油茶炭疽病，亟需篩選能同時(shí)殺死或抑制病斑中多種致病菌的殺菌劑。

本研究采用組織分離法對(duì)油茶炭疽病復(fù)合病菌進(jìn)行分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行種類(lèi)鑒定，通過(guò)復(fù)合侵染試驗(yàn)探究致病菌之間的關(guān)系，并對(duì)致病力強(qiáng)的復(fù)合病菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選，以期為全面合理有效的防治油茶炭疽病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集與菌株分離

油茶炭疽病病葉于2020 年6—10 月采集自湖南長(zhǎng)沙、瀏陽(yáng)、益陽(yáng)、湘潭、廣西南寧、廣東東莞，海南澄邁及江蘇南京8 個(gè)地區(qū)的油茶成林。采用Cai 等（2009）組織分離法分離病原菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基及供試藥劑

供試培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基；AEA 培養(yǎng)基。

供試藥劑：96%咪鮮胺原藥、95%苯醚甲環(huán)唑原藥、98%啶酰菌胺原藥、96%氟吡菌酰胺原藥，98%嘧菌酯原藥，97%啶氧菌酯原藥，均由濟(jì)南一農(nóng)化工有限公司提供。99%水楊肟酸（SHAM）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 柯赫氏法則驗(yàn)證

采用李河等（2017）、Maharachchikumbura 等（2016）和Woudenberg 等（2013）的方法對(duì)分離獲得的油茶病原真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和柯赫氏法則驗(yàn)證，確定油茶炭疽病斑中的致病菌種類(lèi)。

1.4 分子生物學(xué)分析

采用CTAB 法（Xuet al., 1996）提取致病菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用通用引物ITS1/ITS4（序列見(jiàn)表1）對(duì)所有致病菌的ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，初步分析致病菌種類(lèi)，進(jìn)一步用特異性基因擴(kuò)增測(cè)序。炭疽菌屬菌株由ITS 和ApMat基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，擬盤(pán)多毛孢屬、新擬盤(pán)多毛孢屬及假擬盤(pán)多毛孢屬菌株由ITS、TUB2和EF-1α 基因聯(lián)合建樹(shù)分析，鏈格孢屬菌株由ITS 和Histone-3 基因聯(lián)合建樹(shù)分析，所有引物序列和PCR 擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。參考菌株序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。采用CLUSTAL W 進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA 7 軟件構(gòu)建N-J(neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉檢驗(yàn)重復(fù)1 000 次。

表1 引物序列和PCR 擴(kuò)增程序Tab. 1 Primer sequence and PCR cycling conditions

1.5 復(fù)合侵染試驗(yàn)

將油茶炭疽病斑中分離出的主要復(fù)合致病菌作為供試菌株，用打孔器（Φ=4 mm）在生長(zhǎng)良好的菌落邊緣切取菌餅。參考錢(qián)恒偉等（2017）和張永樂(lè)等（2018）的方法，采用有傷接種的方式，將菌餅接種在油茶嫩葉和蘋(píng)果果實(shí)上，共設(shè)3 個(gè)處理，1）先接種炭疽菌屬菌，再接同種菌株；2）先單獨(dú)接種擬盤(pán)多毛孢屬或新擬盤(pán)多毛孢屬病菌，再接種同種菌株；3）復(fù)合接種，即先接種炭疽菌屬病菌，再接種擬盤(pán)多毛孢屬或新擬盤(pán)多毛孢屬病菌。待首次接種油茶葉片和蘋(píng)果果實(shí)開(kāi)始出現(xiàn)病斑后，去除所有接種菌塊，再接種同種或不同種真菌，置于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 天。每個(gè)處理重復(fù)6 次，無(wú)菌PDA 作為對(duì)照。觀察葉片和蘋(píng)果果實(shí)發(fā)病情況并記錄病斑大小。

1.6 殺菌劑毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定6 種殺菌劑對(duì)油茶致病菌的抑菌活性，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)得到供試藥劑對(duì)不同致病菌的有效濃度范圍。啶酰菌胺和氟吡菌酰胺為10、25、50、75、100 μg·mL-1；嘧菌酯和啶氧菌酯為0.005、0.01、0.02、0.04、0.16、5、25，50 μg·mL-1；咪鮮胺為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg·mL-1；苯醚甲環(huán)唑?yàn)?.125、0.25、0.5、1.5、3、4.5 μg·mL-1。從活化3 天的菌落邊緣切取菌餅（Φ=4 mm），分別接種到含有咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的PDA 平板，含有嘧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM、啶氧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM 的AEA 平板上，28 ℃培養(yǎng)4 天。分別以含甲醇的PDA 培養(yǎng)基、含甲醇和10、25 μg·mL-1SHAM的AEA 培養(yǎng)基為對(duì)照，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.7 數(shù)據(jù)處理

Excel 軟件計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，DPS 軟件計(jì)算有效抑制中濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶炭疽病斑中絲狀真菌致病性測(cè)定及形態(tài)特征

采用組織分離法，從油茶炭疽病病葉樣本中分離獲得186 株絲狀真菌，通過(guò)回接實(shí)驗(yàn)測(cè)定它們的致病性，發(fā)現(xiàn)這些菌均能引起油茶葉片發(fā)病。根據(jù)形態(tài)特征，可初步將這些菌分為三大類(lèi)：第一類(lèi)130 株，在PDA 平板上菌落圓形，邊緣整齊，菌絲生長(zhǎng)初期為白色絨狀，后期轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑驕\褐色。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓或一端稍尖，單孢，無(wú)隔膜，無(wú)色；第二類(lèi)為50 株，PDA 平板上菌落近圓形，白色，后期菌落中央呈淺褐色，由中央向外擴(kuò)展，有的呈輪紋狀，培養(yǎng)后期在PDA 培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生黑色油狀黏液，即為分生孢子堆。分生孢子為紡錘形或梭形，5 個(gè)細(xì)胞，有隔膜，頂端和基部細(xì)胞顏色淺，多為透明狀，中間3 個(gè)細(xì)胞顏色較深，多為褐色，頂端有2～4 根無(wú)色透明的附屬絲，基部有1 根短柄；第三類(lèi)6 株，PDA平板上菌落圓形，中央墨綠色絨狀，邊緣白色，氣生菌絲濃密。分生孢子褐色或黃褐色，棍棒狀、倒梨形或卵形，有1～5 個(gè)橫隔膜，0～3 個(gè)縱斜隔膜，多數(shù)具有喙。根據(jù)菌株的形態(tài)特征，初步鑒定第一類(lèi)為炭疽菌屬真菌，第二類(lèi)為類(lèi)擬盤(pán)多毛孢屬真菌，第三類(lèi)為鏈格孢屬真菌，進(jìn)一步需要采用分子生物學(xué)方法確定。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)186 株菌株分別進(jìn)行不同基因擴(kuò)增測(cè)序，將獲得的序列與GenBank 中已知種序列進(jìn)行比對(duì)分析，并下載參考菌株構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，130株炭疽菌屬菌株聚為6 個(gè)分支（圖略），占總分離菌株的69.9%，其中56 株以99%的支持率與果生炭疽菌參考菌株聚為1 支，在湖南、海南、廣西，廣東和江蘇采樣點(diǎn)均有分布；6 株以99%的支持率與C. aeschynomenes參考菌株聚為1 支，全部采自湖南；40 株以98%的支持率與暹羅炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自湖南、海南、廣西和廣東；9 株以99%的支持率與膠胞炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自江蘇和湖南兩地；14 株以98%的支持率與山茶炭疽菌參考菌株聚為1 支，分布在湖南和廣東兩地；5 株為未知種Colletotrichumsp.。18 株擬盤(pán)多毛孢屬菌株，占總分離菌株的9.7%，其中3 株與秤鉤風(fēng)擬盤(pán)多毛孢菌（P. diploclisia）參考菌株聚為1 支，1 株與P. humus參考菌株聚為一支，1 株與P. parva參考菌株聚為一支，2 株與玫瑰紅擬盤(pán)多毛孢(P. rosea)參考菌株聚為一支，11 株為未知種Pestalotiopsissp.；4 株假擬盤(pán)多毛孢屬菌株聚為2 個(gè)分支，占總分離菌株的2.2%，其中1 株以100%的支持率與Pseudo. camelliae-sinensis參考菌株聚為1 支，3株為未知種Pseudopestalotiopsissp.；28 株新擬盤(pán)多毛孢屬菌株，占總分離菌株的15.6%，其中2 株與Neo.saprophyta參考菌株聚為1 支，3 株與Neo. cubana參考菌株聚為1 支，23 株為未知種Neopestalotiopsissp.。6 株鏈格孢屬菌株聚為3 個(gè)分支，占總分離菌株的3.2%，其中2 株以100%的支持率與鏈格孢參考菌株聚為1 支，1 株與細(xì)極鏈格孢參考菌株聚為一支，3 株未知種Alternariasp.。因此，基于形態(tài)學(xué)特征和rDNAITS、ApMat、TUB2，EF-1α 和Histone-3基因序列分析，可以確定油茶炭疽病斑中的致病菌有炭疽菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬、新擬盤(pán)多毛孢屬、假擬盤(pán)多毛孢屬和鏈格孢屬真菌。

2.3 油茶炭疽病同一病斑分離出多種致病菌

對(duì)106 個(gè)病斑分離出的致病菌種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離出單一炭疽病菌的病斑55 個(gè)，而能同時(shí)分離出炭疽病菌和其他致病菌的病斑有51 個(gè)，占總分離病斑的48.1%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，油茶炭疽病斑復(fù)合致病菌的組合方式有7 種，分為炭疽菌屬（同屬不同種）真菌；炭疽菌屬和擬盤(pán)多毛孢屬或新擬盤(pán)多毛孢屬或假擬盤(pán)多毛孢屬或鏈格孢屬真菌；炭疽菌屬，擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬或鏈格孢屬真菌。其中炭疽菌屬和新擬盤(pán)多毛孢屬，炭疽菌屬和擬盤(pán)多毛孢屬致病菌這2 種組合方式最多，占總復(fù)合菌株病斑的41.2%和27.5%（圖1），分布在湖南、海南、廣西、廣東和江蘇樣品采集地，說(shuō)明復(fù)合菌株共同侵染的現(xiàn)象廣泛發(fā)生在我國(guó)油茶種植區(qū)；其次是炭疽菌屬（同屬不同種），占總復(fù)合菌株病斑的15.7%，分布在湖南，廣東和海南。試驗(yàn)結(jié)果表明，油茶炭疽病中存在炭疽菌屬真菌和其它致病菌復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

圖1 病斑分離出的致病菌組合方式Fig. 1 Combination pattern of pathogens isolated from symptomatic diseased tissues

2.4 油茶炭疽病斑中存在復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象

根據(jù)油茶炭疽病斑中分離出的復(fù)合致病菌，將炭疽菌屬和擬盤(pán)多毛孢屬，炭疽菌屬和新擬盤(pán)多毛孢屬，炭疽菌同屬不同種這3 種分離率最多的組合方式致病菌回接到油茶上，進(jìn)行復(fù)合侵染試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，炭疽病菌和擬盤(pán)多毛孢屬真菌接種油茶葉片5 天，復(fù)合接種的葉片發(fā)病程度較只接同種炭疽菌的更嚴(yán)重，統(tǒng)計(jì)分析表明病斑直徑對(duì)比組間存在顯著差異（圖2A，2B，2C）；炭疽病菌和新擬盤(pán)多毛孢屬真菌復(fù)合接種的病斑顯著大于只接同種炭疽菌（圖2D，2E，2F）；不同種炭疽菌復(fù)合接種的病斑大小與只接同種炭疽病菌差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象。為探究在其他寄主植物上是否也存在類(lèi)似的現(xiàn)象，筆者在蘋(píng)果果實(shí)上進(jìn)行了復(fù)合侵染試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，炭疽病菌和新擬盤(pán)多毛孢屬真菌先后復(fù)合接種的病斑大于只接同種炭疽菌的病斑，統(tǒng)計(jì)分析差異顯著（圖2G，2H），說(shuō)明在其他寄主植物中也存在炭疽屬真菌和其它致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，油茶炭疽病斑中的炭疽菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬真菌之間存在復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象。

圖2 油茶葉片和蘋(píng)果復(fù)合接種致病力測(cè)定Fig. 2 Symptoms of oil-tea leaves and apples after compound inoculation of pathogens

2.5 不同殺菌劑對(duì)油茶炭疽病復(fù)合病菌的抑制作用存在差異

6 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽病致病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對(duì)炭疽菌屬和新擬盤(pán)多毛孢屬致病菌幾乎沒(méi)有抑制作用，在50 μg·mL-1供試濃度下，菌絲生長(zhǎng)抑制率在12.7%～43.3%之間（表2）。咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤揖鷮佟M盤(pán)多毛孢和新擬盤(pán)多毛孢屬致病菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，EC50在0.011～0.555 μg·mL-1之間（表3）。嘧菌酯和啶氧菌酯對(duì)擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬真菌具有一定的抑制作用，EC50在0.007～0.020 μg·mL-1之間，但這2 種殺菌劑在50 μg·mL-1供試濃度下對(duì)炭疽菌的抑制作用較差。且同一殺菌劑對(duì)不同炭疽菌的抑制作用存在差異，嘧菌酯和啶氧菌酯對(duì)山茶炭疽菌C.camelliae的抑制作用強(qiáng)于果生炭疽菌C. fructicola、暹羅炭疽菌C. siamense 和膠胞炭疽菌C. gloeosporioides，這表明山茶炭疽菌對(duì)這兩種殺菌劑更為敏感。試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的6 種殺菌劑中，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)τ筒杼烤也?fù)合病菌的毒力較強(qiáng)，其次是嘧菌酯和啶氧菌酯，而啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對(duì)復(fù)合病菌幾乎沒(méi)有抑制作用。

表3 4 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定①Tab. 3 Toxicity test of four fungicides against pathogens of Camellia oleifera

3 討論

3.1 油茶炭疽病菌的種類(lèi)與分布

本研究分離獲得186 株致病菌，其中130 株為炭疽菌，56 株為果生炭疽菌，分離率最高，其次是暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌和膠胞炭疽菌，這與李河等報(bào)道的果生炭疽菌是油茶炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌的結(jié)果一致（李河等，2014；2017；Li, 2019）。在樣本采集地湖南、海南、廣西，廣東和江蘇等地均發(fā)現(xiàn)存在果生炭疽菌，說(shuō)明這類(lèi)病原菌分布范圍廣，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，這與李河等（2014）報(bào)道的結(jié)果一致。除果生炭疽菌以外，江蘇省只分離出膠胞炭疽菌，廣西省和海南省只分離出暹羅炭疽菌，14 株山茶炭疽菌中13 株來(lái)自于廣東省，這是否與病原菌種類(lèi)的分布存在地理區(qū)域差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 植物病害中存在病原菌復(fù)合侵染現(xiàn)象

目前關(guān)于由多種病毒復(fù)合侵染引起植物病害的報(bào)道較多，如番茄褪綠病毒ToCV 和番茄黃化曲葉病毒TYLCV 復(fù)合侵染番茄植株，且影響與寄主和昆蟲(chóng)媒介的互作（Ontiveroset al., 2021）。趙麗玲等（2020）報(bào)道了中國(guó)南瓜曲葉病毒SLCCNV 和野茼蒿黃脈病毒CraYVV 復(fù)合侵染引起水茄發(fā)病，并發(fā)現(xiàn)在CraYVV 發(fā)生區(qū)域，病毒SLCCNV 與CraYVV 存在協(xié)同作用。在真菌引起的植物病害中也存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。張永樂(lè)等（2018）對(duì)山東省茶褐枯病病原菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病害是由圍小叢殼菌山茶專(zhuān)化型（Glomerella cingulatef. sp.camelliae）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）復(fù)合侵染引起的。錢(qián)恒偉等（2017）對(duì)青島市甘薯莖枯病的病原菌尖孢鐮刀菌和細(xì)極鏈格孢進(jìn)行了致病力研究，結(jié)果表明，這2 種病原菌均可引起甘薯莖枯病，且病原菌混合接種較單獨(dú)接種的發(fā)病率高，致病力強(qiáng)。李培琴等（2021）研究表明互隔交鏈孢（Alternaria alternata）和芍藥生擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis paeoniicola）既可單獨(dú)侵染也可復(fù)合侵染引起皇帝陵側(cè)柏葉枯病，且二者病原菌復(fù)合侵染比單獨(dú)接種時(shí)的發(fā)病率高，發(fā)病程度也更為嚴(yán)重。本研究對(duì)油茶炭疽菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬致病菌進(jìn)行復(fù)合侵染試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合接種較先后均接種炭疽病菌的致病力強(qiáng)，發(fā)病程度更嚴(yán)重，這與李培琴等報(bào)道的Alternaria alternata和Pestalotiopsis paeoniicola復(fù)合侵染引起黃帝陵側(cè)柏葉枯病更嚴(yán)重的結(jié)果一致，表明油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象，這些病原在復(fù)合侵染過(guò)程中可能存在一定的互作，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。蘋(píng)果復(fù)合侵染試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，炭疽病菌、擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬致病菌之間極可能存在協(xié)同作用，在其它寄主植物內(nèi)可能也存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。

3.3 殺菌劑種類(lèi)與病原菌抑菌效果的關(guān)系

甲氧基丙烯酸酯（QoI）類(lèi)、琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類(lèi)及甾醇脫甲基抑制劑(DMI)類(lèi)殺菌劑是目前使用最多的三類(lèi)殺菌劑，具有抗菌譜廣，活性高等特點(diǎn)（嚴(yán)明，2016）。DMI 類(lèi)殺菌劑被廣泛應(yīng)用于炭疽病的防治。徐從英等（2021）報(bào)道了咪鮮胺對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌C. siamense的抑制活性最好。劉霞等（2013）研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對(duì)核桃炭疽病菌C.gloeosporioides的防治效果較好。本研究結(jié)果表明，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)τ筒杼烤也【–. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）均具有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)這兩種殺菌劑對(duì)油茶擬盤(pán)多毛孢和新擬盤(pán)多毛孢致病菌也具有較強(qiáng)的室內(nèi)毒力。由于DMI 類(lèi)殺菌劑作用位點(diǎn)單一，容易產(chǎn)生抗性，后續(xù)可考慮與甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑復(fù)配使用。QoI 類(lèi)和SDHI 類(lèi)殺菌劑均為線粒體呼吸抑制劑，通過(guò)阻礙電子傳遞，影響細(xì)胞能量的合成和供給，從而抑制菌絲生長(zhǎng)。徐娜娜等（2021）研究表明氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對(duì)牡丹炭疽病菌C. gloeosporioides的抑制活性較強(qiáng)，EC50值分別為0.013 8 μg·mL-1和0.032 4 μg·mL-1。這與高楊楊（2021）報(bào)道的辣椒炭疽菌（C. gloeosporioides、C. fructicola等）對(duì)氟吡菌酰胺和啶酰菌胺表現(xiàn)天然不敏感的結(jié)果不一致。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對(duì)油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）的抑制活性較弱，表明不同寄主植物的同種病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性具有差異性。

本試驗(yàn)測(cè)定了6 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬和新擬盤(pán)多毛孢屬致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，研究結(jié)果為油茶炭疽病的防治提供參考，但本試驗(yàn)工作均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，環(huán)境條件較為穩(wěn)定，而田間施藥會(huì)受到多種因素如溫度、降雨等因子影響，藥劑的防治效果可能會(huì)有差異，因此本試驗(yàn)結(jié)果還需田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

對(duì)湖南、海南、廣西，廣東和江蘇5 地油茶成林葉部炭疽病斑的致病菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病同一病斑能分離出多種致病菌，并發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象；進(jìn)一步對(duì)油茶炭疽病斑中多種致病菌進(jìn)行防治藥劑篩選，結(jié)果表明咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好，可作為防治油茶炭疽病的首選殺菌劑。