李書磊 張 紅 李一博 袁潔瑩 謝非凡 王寒星 楚 杰 余瑞金

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院 楊凌 712100；2. 臨沂市檢驗檢測中心 臨沂 276699；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100）

我國是世界上唯一擁有最完整的泡桐屬（Paulownia）植物種群的國家，每年泡桐木材產(chǎn)量超過1 000 萬m3；桐木作為重要的工業(yè)用材，廣泛用于室內(nèi)建筑裝修及家具和工業(yè)建筑等行業(yè)，每年約有200 萬m3桐木制品出口日本、韓國等國家，桐木的生產(chǎn)利用已得到越來越多國家的青睞（常德龍等，2018）。然而在實際生產(chǎn)中，泡桐易變色的問題會使材色品質(zhì)降低，開展桐木漂白研究對提升桐木附加值及提高桐木品質(zhì)具有重要意義。

漂白預(yù)處理是木材材色改良的有效途徑之一，當(dāng)前木質(zhì)材料漂白主要采用化學(xué)試劑法和物理蒸煮法（曹惠敏等，2020；陸弘毅等，2021）。Shi 等（2018）利用酸和堿水溶液對木材進行熱處理，結(jié)果表明，隨著溫度升高，樣品亮度值降低，化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，半纖維素和木質(zhì)素有所降解；Wu 等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫漂白可以保持木質(zhì)細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)；也有學(xué)者應(yīng)用不同條件水熱處理進行木材漂白（劉志佳等，2009）。這些傳統(tǒng)漂白預(yù)處理方法為提高木材漂白效果及優(yōu)化木材漂白工藝提供了一定基礎(chǔ)，但目前采用的漂白預(yù)處理試劑多為含氯漂白劑，其使用中會產(chǎn)生二噁英化合物，從而造成環(huán)境毒性污染（許開紹等，2002）。張潤青等（2020）采用臭氧對非木質(zhì)纖維進行漂白和改性，該方法雖污染小但存在漂白成本高且工藝復(fù)雜等問題。為了進一步獲得綠色高效的木質(zhì)原料漂白效果，國內(nèi)外學(xué)者在原料脫色機理方面也相繼開展研究。有學(xué)者認(rèn)為，泡桐木材變色是多因素共同作用的結(jié)果，pH 是影響梓醇變色的主要因素，光照和氧氣同時作用可導(dǎo)致泡桐素和芝麻素變色（常德龍等，2018）；木質(zhì)素內(nèi)的羰基結(jié)構(gòu)有助于增加熱處理過程中的木材色度值，色度值受C—O 基團影響（曹惠敏等，2020）；且顯示與木質(zhì)素的O/C 比相反的趨勢（Zhanget al.，2018）。這些研究為桐木變色機理分析奠定了一定基礎(chǔ)，但對試劑脫色處理相關(guān)機理探索還有待進一步深入，尤其對綠色低碳預(yù)處理條件下不同脫色方法的研究還較為罕見。

生物酶因綠色、溫和、高效的特點，被認(rèn)為是一種具有較大發(fā)展前景的漂白方法。生物酶漂白主要通過降解材料中殘留的木質(zhì)素或增強紙漿的可漂性，減少紙漿漂白過程中的氯用量，從而減少漂白對環(huán)境的污染（盧慶華等，2013；馮嚴(yán)嚴(yán)，2014；潘夢麗等，2015；李峰等，2018）。當(dāng)前，采用生物酶預(yù)處理體系對桐木材料進行漂白還鮮見報道。鑒于此，本研究以蘭考泡桐（Paulownia elongata）為研究對象，探討二代生物復(fù)合酶對桐木的漂白效果和影響規(guī)律，獲得生物復(fù)合酶漂白桐木的最佳工藝參數(shù)，初步探明生物復(fù)合酶漂白桐木的機理，以期為桐木脫色和生物學(xué)改良及桐木制漿的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

蘭考泡桐樣品由國家林業(yè)和草原局泡桐研究中心提供。樣品洗凈、干燥，切成5.0 cm×5.0 cm×0.5 cm小塊，烘干，裝入密封袋并標(biāo)記名稱、日期等置于陰涼干燥處。

所用生物復(fù)合酶酶種為CTEC2，來源Novozymes，酶活147 FPU·mL-1；檸檬酸、碳酸鈣、溴化鉀、氫氧化鈉等，均為分析純。

所用儀器包括水浴鍋、電子天平、真空泵、干燥箱、離心機、紫外可見分光光度計、振蕩器、粉碎機、高壓滅菌鍋等；葡萄糖、木糖含量使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測。

1.2 預(yù)處理樣品制備

配制5 FPU·mL-1酶溶液，用檸檬酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。每塊樣品質(zhì)量約15 g，料液比1∶10。木塊經(jīng)絕干處理后置于試管中，加入已配制好的酶溶液搖勻，抽真空。水浴鍋溫度分別設(shè)30、50 和70 ℃。試管放入水浴鍋加熱，每15 min 搖勻1 次，直至分別反應(yīng)60、75、90 和105 min 后取出試管，抽濾。抽濾后用蒸餾水沖洗，置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，烘至絕干后裝入密封袋中。同時，設(shè)置1 組未經(jīng)預(yù)處理的平行試驗。

1.3 顏色測定

采用杭州彩譜科技有限公司生產(chǎn)的CS-820 可見光分光測色儀，照明光源為脈沖氙燈，測量波長范圍400～700 nm，波長間隔10 nm，反射測量D/8 結(jié)構(gòu)，操作溫度15～32 ℃，相對濕度不超過80%，反射測量孔徑為1.5 cm 的中孔徑。每塊樣品由邊緣向中心測量3個點，結(jié)果取平均值。

采用CIELab 表色系統(tǒng)，使用分光測色儀測量泡桐木材樣品表面預(yù)處理前后的明度L*、紅綠軸色品指數(shù)a*和黃藍(lán)軸色品指數(shù)b*。用脫色處理前后參數(shù)差值表示各參數(shù)變化，即ΔL*、Δa*、Δb*和色差ΔE*，計算公式如下：

式中：下標(biāo)t 表示脫色處理后；下標(biāo)u 表示脫色處理前。

1.4 主要化學(xué)組成測定

1.4.1 抽提物含量 濾紙折疊包好裝入的原料，置于索氏抽提器內(nèi)，量取200 mL 乙醇倒入索氏抽提器。水浴鍋95 ℃抽提16 h，直至抽提管中液體完全無色、透明。取出濾紙包置于通風(fēng)櫥中至乙醇揮發(fā)完全，再將其放入烘箱內(nèi)60 ℃烘至絕干后稱重，計算抽提物含量。

1.4.2 纖維素、半纖維素含量 參照美國國家可再生能源實驗室（national renewable energy laboratory，NREL）方法測定樣品三大素含量。首先稱取0.3 g 預(yù)處理樣品（未處理原料用苯醇進行索式抽提，以除去樹脂、色素等）于100 mL 旋蓋燒口瓶中，加入 3 mL 72% H2SO4，混合均勻后置于30±3 ℃水浴中保溫1 h，每隔10 min 攪拌搖勻1 次；然后向瓶中加入84 mL 蒸餾水（稀釋H2SO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)至4%），擰緊瓶蓋置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121 ℃下水解1 h。水解完成后，利用已稱重的G3 砂芯漏斗進行真空抽濾，分離殘渣和水解液，一部分水解液用于測定酸溶木質(zhì)素含量；另一部分水解液用碳酸鈣中和至中性，采用高效液相色譜（HPLC）HITACHI L-2000 分析其葡萄糖和木糖含量。分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87P，長×直徑為300 mm×7.8 mm，保護柱為Cation-H Refill Cartridges，長×直徑為30 mm×4.6 mm，檢測器為RID 示差折光檢測器。進樣量20 μL，流動相0.005 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫45 ℃。檢測結(jié)果為水解液單糖含量，六碳糖乘以0.9、五碳糖乘以0.88 即可換算出樣品纖維素和半纖維素含量。

1.4.3 木質(zhì)素含量 預(yù)熱紫外可見分光光度計20 min 后，開始稀釋濾液（稀釋后總體積1 mL 左右），搖勻，倒入溶液中，測定吸光度，顯示吸光度0.7～1.0范圍內(nèi)即為可行。采用該方法測定并記錄所有收集的濾液，按下式計算酸溶木質(zhì)素（acid-soluble lignin，ASL）含量：

式中：N為稀釋倍數(shù)；A為紫外吸收值；V為濾液吸收總體積（0.087 L）；15 為吸收系數(shù)（L·g-1cm-1）；W為酸解前樣品絕干質(zhì)量。

水解后殘渣用熱蒸餾水多次洗滌抽濾，直至10%BaCl2檢測濾液無白色沉淀生成后，置于事先用3%H2SO4浸泡潤洗、干燥并稱重的定量濾紙上。恒溫干燥箱內(nèi)105 ℃烘至恒重，稱重，總質(zhì)重扣除定量濾紙的質(zhì)量即為酸不溶木質(zhì)素質(zhì)量。

1.4.4 脫色率 采用分光光度法測定吸附前后溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算染料質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按下式計算脫色率：

式中：c0為處理前桐木溶液吸光度測定值；c為處理后桐木溶液吸光度測定值。

1.5 樣品熱重分析

熱重分析（thermo gravimetric analysis，TGA）/微分熱重（derivative thermo gravimetry，DTG）采用TGA/DSC3型熱重同步分析儀進行。樣品粉碎，過80 目篩，隨機稱取2 mg 進行分析。熱解溫度800 ℃，升溫速率20 ℃·min-1，同時加入20 mL·min-1流量氮氣。

1.6 電鏡掃描

采用TM4000 Plus 臺式掃描電鏡，電子束能量為15 kV。樣品粉碎，過80 目篩，使用導(dǎo)電膠粘取少量粉末固定在觀察臺上進行掃描，觀察預(yù)處理后樣品纖維微觀形態(tài)變化。

1.7 X 射線衍射

采用X 射線衍射（D8 ADVANCE A25）測定樣品纖維素結(jié)晶度，探究不同預(yù)處理條件對樣品結(jié)晶的影響。樣品粉碎，過200 目篩，稱取10 mg 進行測量。操作電壓40 kV，電流40 mA，掃描角度2θ 范圍5°～50°，銅靶。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理前后桐木顏色變化分析

未處理泡桐木材顏色參數(shù)為L*=60.70、a*=3.73、b*=16.60，預(yù)處理后顏色參數(shù)變化如表1 所示?？梢钥闯觯c未處理相比，生物酶預(yù)處理后的泡桐木材明度L*、紅綠軸色品指數(shù)a*、黃藍(lán)軸色品指數(shù)b*均有所提高，表明生物酶預(yù)處理可有效提高白度。由溫度分析可知，50 ℃預(yù)處理條件下樣品明度L*最大，紅綠軸色品指數(shù)a*和黃藍(lán)軸色品指數(shù)b*隨溫度升高而降低。在pH 變化條件下，紅綠軸色品指數(shù)a*和黃藍(lán)軸色品指數(shù)b*隨pH 升高而降低，當(dāng)pH 為7 時，樣品明度L*最大。隨著預(yù)處理時間延長，樣品明度L*越來越高，紅綠軸色品指數(shù)a*和黃藍(lán)軸色品指數(shù)b*越來越低?？紤]到明度L*是色差的主要影響因素，故在溫度50 ℃、pH 7、預(yù)處理時間105 min 條件下泡桐木材脫色效果最佳。

表1 預(yù)處理后脫色桐木的顏色參數(shù)Tab. 1 Color parameters of decolorization of paulownia after pretreatment

2.2 預(yù)處理前后桐木主要化學(xué)組分變化分析

由圖1 可知，經(jīng)生物復(fù)合酶預(yù)處理，泡桐木材主要化學(xué)組分均發(fā)生較明顯變化，纖維素相對含量有所增加，半纖維素、木質(zhì)素和抽提物含量有所降低。在溫度50 ℃、pH 為7 的條件下，主要化學(xué)組分相對含量變化最大，其中纖維素含量由49.11%增至59.87%，半纖維素含量由18.58%降至7.45%，酸溶木質(zhì)素含量由7.12%降至4.07%，酸不溶木質(zhì)素含量由24.64%降至20.42%，抽提物含量由3.24%降至2.09%。從pH分析可知，pH 為7 時泡桐木材主要化學(xué)組分相對含量變化最大，其次是pH 為5，pH 為3 時泡桐木材主要化學(xué)組分相對含量變化最小，原因在于pH 降低導(dǎo)致CTEC2 生物酶活性降低，從而引起其作用效果下降（Patelet al.，2019）；半纖維素、木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)復(fù)雜，比纖維素更易發(fā)生酸性水解（Pathaniaet al.，2016）。從溫度條件可知， 50 ℃預(yù)處理條件下泡桐木材主要化學(xué)組分相對含量變化最大，其次是30 ℃，70 ℃時泡桐木材主要化學(xué)組分相對含量變化最小，這可能是因為預(yù)處理溫度50 ℃時CTEC2 生物酶活性最好，作用效率最高（Patelet al.，2019）；而與30 ℃相比，70 ℃對酶活性影響更大，導(dǎo)致酶活性更低，進而降低酶對組分的作用效果。

圖1 生物復(fù)合酶預(yù)處理桐木主要化學(xué)組分變化情況Fig. 1 Main chemical components of paulownia under the condition of biological complex enzyme pretreatment

2.3 預(yù)處理前后桐木脫色率變化分析

由圖2 可知，在溫度50 ℃、pH 為3 的條件下，桐木脫色率最低，僅21.8%；在溫度30 ℃、pH 為7 的條件下，桐木脫色率達(dá)68.8%。50 ℃預(yù)處理條件下，pH由3 到7，桐木脫色率由21.8%升至49.9%；70 ℃預(yù)處理條件下，桐木脫色率變化幅度很小，基本保持不變。針對以上結(jié)果，有學(xué)者認(rèn)為桐木變色與抽提物有關(guān)，抽提物中酚類物質(zhì)是引起變色的重要原因（常德龍等，2018）；也有學(xué)者認(rèn)為主要是糖或有機酸在變色中起作用（祖勃蓀等，1998），此外還有花苷類（邱乾棟等，2013）；常德龍等（2006）指出，在真菌引起變色的泡桐木材中，半纖維素發(fā)生明顯降解，半纖維素含量發(fā)生變化導(dǎo)致桐木脫色。本研究提出的預(yù)處理前后桐木脫色率變化與前人觀點基本一致。

圖2 溫度和pH 對桐木脫色率的交互作用Fig. 2 Interaction of temperature and pH value on decolorization rate for paulownia of enzyme pretreatment

2.4 預(yù)處理前后桐木熱重變化分析

不同溫度和pH 預(yù)處理桐木的TGA 和DTG 曲線如圖3、4 所示，所有樣品的TGA 曲線變化趨勢基本一致，除溫度70 ℃和pH 為7 條件下樣品的熱穩(wěn)定性變化不明顯外，其他樣品熱穩(wěn)定性均有所提升。樣品質(zhì)量損失主要包括50～300 ℃的平穩(wěn)熱解階段、300～400 ℃的主要熱解階段和400～600 ℃的炭化階段。

圖3 不同溫度預(yù)處理桐木的TGA 和DTG 曲線Fig. 3 TGA and DTG curves at different temperatures

由圖3 可知，預(yù)處理后主要熱解階段樣品最大質(zhì)量損失速率均有所降低，最大質(zhì)量損失速率對應(yīng)的溫度有所增加，說明預(yù)處理可延長達(dá)到最大質(zhì)量損失速率的時間。在主要熱解階段，30 ℃和50 ℃條件下預(yù)處理樣品熱解失重峰溫度升高，熱穩(wěn)定性有所上升；70 ℃條件下預(yù)處理樣品與未處理樣品熱解溫度差別不大；不同溫度預(yù)處理樣品的熱解溫度由大到小依次為30 ℃、50 ℃和70 ℃。這與CTEC2 酶最適溫度有關(guān)，高溫時酶活性降低，導(dǎo)致其對木質(zhì)纖維的破壞程度降低（Patelet al.，2019）。綜上所述，桐木熱穩(wěn)定性變化預(yù)處理溫度依次為30 ℃＞50 ℃＞70 ℃。

由圖4 可知，在主要熱解階段，pH 變化導(dǎo)致桐木熱解溫度和速率發(fā)生變化，最大質(zhì)量損失速率有所降低。預(yù)處理樣品最大質(zhì)量損失速率對應(yīng)的溫度有所增加，說明pH 不同會導(dǎo)致桐木主要化學(xué)組分在熱解和成分轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生差異（楚杰等 ，2017）。pH 為3 和5 時，預(yù)處理桐木的熱解溫度有所升高，熱穩(wěn)定性有所提高；pH 為7 時，預(yù)處理桐木的熱解溫度變化不大。綜上所述，桐木熱穩(wěn)定性變化的預(yù)處理pH 依次為 3＞5＞7。

圖4 不同pH 預(yù)處理桐木的TGA 和DTG 曲線Fig. 4 TGA and DTG curves at different pH values

2.5 預(yù)處理前后桐木電鏡掃描圖像分析

預(yù)處理前后泡桐木質(zhì)纖維素組分變化示意如圖5所示。未經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素組分中層狀木質(zhì)素與半纖維素呈半包裹狀態(tài)，木質(zhì)素密實細(xì)胞覆蓋纖維素結(jié)構(gòu)細(xì)胞；經(jīng)生物酶預(yù)處理后， 木質(zhì)素細(xì)胞脫除，暴露出更多規(guī)則成束的纖維素細(xì)胞。

圖5 預(yù)處理前后泡桐木質(zhì)纖維素組分變化示意Fig. 5 Schematic diagram of changes in lignocellulose components before and after pretreatment

未處理樣品表面無明顯結(jié)構(gòu)破壞，木質(zhì)纖維較完整（圖6A）；溫度30 ℃時，不同pH 預(yù)處理樣品（圖6B、C 和D）木質(zhì)纖維表層結(jié)構(gòu)遭到破壞，木質(zhì)纖維素開始解體，纖維素互相分離，且隨著pH 升高，結(jié)構(gòu)變化明顯；溫度50 ℃時，不同pH 預(yù)處理樣品（圖6E、F 和G）木質(zhì)纖維素解體更加嚴(yán)重，纖維素分離更加顯著，且隨著pH 升高，結(jié)構(gòu)變化更加明顯；溫度70 ℃時，不同pH 預(yù)處理樣品圖6H、I、J）木質(zhì)纖維的變化趨勢與30 ℃和50 ℃預(yù)處理樣品一致，且隨著pH 升高，結(jié)構(gòu)變化更加顯著，但70 ℃預(yù)處理樣品的結(jié)構(gòu)變化不如50 ℃明顯?？梢姡瑥?fù)合生物酶能有效降解桐木的木質(zhì)纖維組分，破壞其木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)。

圖6 不同預(yù)處理桐木的SEMFig. 6 SEM images of enzyme pretreatment paulownia

2.6 預(yù)處理前后桐木X 射線衍射分析

預(yù)處理前后桐木X 射線衍射圖譜如圖7 所示，101、002 和040 峰是典型的纖維素Ⅰ的特征，其衍射角分別為16.02°、22°和34.76°。經(jīng)生物酶預(yù)處理后，101 峰衍射強度無明顯變化；但經(jīng)50 ℃預(yù)處理后，002 峰衍射強度明顯增強，說明此時半纖維素、木質(zhì)素等無定形區(qū)降解效率最高；040 峰尖銳程度明顯增大，且位置有所向右偏移，說明經(jīng)50 ℃預(yù)處理后，衍射強度明顯增強，纖維素結(jié)晶度增大，結(jié)晶區(qū)晶胞參數(shù)變小、晶面間距變小。

圖7 預(yù)處理前后桐木X 射線衍射圖譜Fig. 7 The X-ray diffraction spectrogram of paulownia sample before and after pretreatment

纖維素結(jié)晶度是由X 射線衍射測得的光譜峰高，計算公式如下：

式中：CI 為纖維素結(jié)晶度；I002為002 晶面的極大衍射強度，2θ 約22°；Iam為非結(jié)晶背景的衍射強度，2θ 約18°。

由表2 可知，未處理桐木樣品纖維素結(jié)晶度為16.91%，這主要是因為木質(zhì)素和半纖維素等部分無定形物質(zhì)的存在使得結(jié)晶度較低。經(jīng)生物酶預(yù)處理后，桐木樣品結(jié)晶區(qū)表面纖維素分子鏈中的低聚糖被溶出，無定形區(qū)活性基團裸露，半纖維素與生物酶發(fā)生反應(yīng)，部分木聚糖被降解，導(dǎo)致纖維素結(jié)晶度提高（楚杰等，2017）。生物酶降解，結(jié)晶度增加較為明顯的預(yù)處理條件為溫度50 ℃、pH 7，但由于酶的作用使纖維素結(jié)晶區(qū)發(fā)生部分水解，因此結(jié)晶度提升程度不大。

表2 不同預(yù)處理泡桐的纖維素結(jié)晶度①Tab. 2 Crystallinity calculation parameters

利用Scherer 公式（Segalet al.，1959）計算桐木結(jié)晶區(qū)尺寸，公式如下：

式中：D為結(jié)晶區(qū)長度或?qū)挾?；d為晶面層間距（nm）；B為衍射峰半寬，計算中需將其轉(zhuǎn)換為弧度；λ 為入射波波長（0.154 nm）；θ 為衍射角；K為衍射常數(shù)。

由表3 可知，預(yù)處理后樣品結(jié)晶區(qū)長度D增大，表明酶預(yù)處理能夠提高桐木結(jié)晶區(qū)尺寸，且在一定范圍內(nèi)隨溫度和pH 上升提高更加明顯，溫度70 ℃、pH為7 時D達(dá)最大。此外，預(yù)處理后樣品晶面層間距變小，但變化幅度較小，主要是因為桐木結(jié)晶區(qū)表面纖維素分子鏈中擁有的部分低聚糖溶解，導(dǎo)致細(xì)胞壁吸附能力變強，加速半纖維素與生物復(fù)合酶的反應(yīng)，從而使d減?。ǔ艿?， 2017）。

表3 不同預(yù)處理桐木結(jié)晶區(qū)大?、賂ab. 3 Calculation parameters of crystallization zone

3 結(jié)論

1） CTEC2 生物酶可使泡桐木材主要化學(xué)組分發(fā)生變化，最佳預(yù)處理條件為溫度50 ℃、pH 7，木材纖維素含量由49.11%增至59.87%，半纖維素含量由18.58%減至7.45%，酸溶木質(zhì)素含量由7.12%減至4.07%，酸不溶木質(zhì)素含量由24.64%減至20.42%，抽提物含量由3.24%減至2.09%。

2） CTEC2 生物酶預(yù)處理泡桐木材時，溫度50 ℃、pH 7、預(yù)處理時間105 min 的漂白效果最好，木材明度最大。

3） CTEC2 生物酶預(yù)處理泡桐木材可以提高其熱穩(wěn)定性（處理條件溫度70 ℃、pH 為7 時變化不明顯）。依據(jù)熱穩(wěn)定性高低排序的預(yù)處理溫度為30 ℃＞50 ℃＞70 ℃、pH 為3＞5＞7。CTEC2 生物酶預(yù)處理泡桐木材最大質(zhì)量損失速率對應(yīng)的溫度在不同溫度和pH 條件下均有所增加，預(yù)處理可延長達(dá)到最大質(zhì)量損失速率的時間。

4） CTEC2 生物酶預(yù)處理泡桐木材不僅能夠提高纖維素結(jié)晶度，使其結(jié)晶區(qū)尺寸增大，晶面層間距變小，而且能夠有效破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)，在相同溫度下，其作用隨預(yù)處理pH 提高而更加明顯。