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山核桃寡核苷酸探針開發(fā)及其應(yīng)用*

2023-08-09 03:01:50黃堅(jiān)欽王克濤夏國華張啟香徐川梅
林業(yè)科學(xué) 2023年5期
關(guān)鍵詞:寡核苷酸原位雜交薄殼

苑 軻 黃堅(jiān)欽 王克濤 夏國華 張啟香 徐川梅

(浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

山核桃屬(Carya)是胡桃科(Juglandaceae)的一個重要的屬,是珍貴的經(jīng)濟(jì)林樹種,具有極高經(jīng)濟(jì)價值,特別是其中的山核桃(Carya cathayensis)和薄殼山核桃(C. illinoinensis),在浙江省干果產(chǎn)業(yè)中占重要的地位。山核桃屬包括約18 個種,分為北美山核桃種和東亞山核桃種兩大組,其中北美山核桃種約11 個種,包括薄殼山核桃、卵形山核桃(C. ovata)及佛羅里達(dá)山核桃(C. floridana)等,主要分布在北美;中國山核桃種約6 個種,包括山核桃、云南山核桃(C. tonkinensis)、湖南山核桃(C. hunanensis)、 大別山山核桃(C.dabieshanensis)、貴州山核桃(C. kweichowensis)及喙核桃(C. sinensis)等,分別分布于浙江、云南、湖南、安徽及貴州等省的偏遠(yuǎn)山區(qū)(Zhanget al.,2013;劉茂春等,1984)。目前,山核桃屬植物相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究多為在染色體計(jì)數(shù)及傳統(tǒng)的核型分析等初級細(xì)胞遺傳學(xué)水平,大部分山核桃種的細(xì)胞遺傳學(xué)研究尚未開展(Chenet al.,1993;呂芳德等,2002;徐川梅,2017)。山核桃屬植物染色體數(shù)目較多,且染色體形態(tài)較小,一些染色體極易斷裂,染色體斷片與一些小染色體在形態(tài)上非常相似,極難區(qū)分,嚴(yán)重干擾山核桃屬植物染色體計(jì)數(shù)(徐川梅,2017)。山核桃屬植物染色體物理標(biāo)記非常缺乏,已成為制約山核桃屬植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究的技術(shù)瓶頸。

寡核苷酸熒光原位雜交技術(shù)(oligonucleotide fluorescence in situ hybridization, Oligo-FISH)是一項(xiàng)新的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH),該技術(shù)以長約幾十堿基的單鏈寡核苷酸為探針,可實(shí)現(xiàn)對基因組、染色體和特定染色體區(qū)段進(jìn)行精確鑒定和分析,具有簡單、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)(Hanet al.,2015;Duet al.,2017;Brazet al.,2018)。根據(jù)序列來源特點(diǎn),寡核苷酸探針可分為單拷貝序列寡核苷酸探針和重復(fù)序列寡核苷酸探針兩種類型,其中單拷貝序列寡核苷酸探針主要依據(jù)一些染色體序列信息進(jìn)行設(shè)計(jì)和開發(fā),目前水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)及楊樹(Populusspp.)等物種已實(shí)現(xiàn)單條染色體單拷貝寡核苷酸探針庫的開發(fā)及染色體涂染(Liuet al.,2019;Albertet al.,2019;Yuet al.,2021;Xinet al.,2020);第二類為重復(fù)序列寡核苷酸探針,這類探針主要基于對植物全基因組測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析,根據(jù)高度重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)序列核心元件進(jìn)行設(shè)計(jì)和開發(fā),目前小麥(Triticum aestivum)及花生(Arachis hypogaea)等物種已有很多報道(Duet al.,2016;2018),并在染色體研究和染色體工程育種領(lǐng)域得到大量利用。山核桃已完成全基因組測序工作,測序結(jié)果表明,其基因組大小為706.43 Mb,基因組中重復(fù)序列元件約占53.67%,說明山核桃具備開發(fā)重復(fù)序列寡核苷酸探針的潛力(Huanget al.,2019)。本研究利用生物信息學(xué)方法分析山核桃基因組中的重復(fù)序列,為山核桃開發(fā)出重復(fù)序列類型的寡核苷酸探針,并利用所開發(fā)的寡核苷酸探針對薄殼山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及喙核桃等山核桃種染色體進(jìn)行分析,以期該研究結(jié)果為其他山核桃品種相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山核桃、湖南山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃7 個不同的山核桃種,其中山核桃主要分布在浙江省天目山山脈,大別山山核桃主要分布在安徽省大別山一帶,湖南山核桃主要分布在湖南省,云南山核桃主要分布在云南省哀牢山區(qū),貴州山核桃和喙核桃主要分布在貴州省內(nèi),薄殼山核桃由美國引種,種植在浙江農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)。9—11 月山核桃成熟季節(jié),從不同山核桃種產(chǎn)地收集山核桃、湖南山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃的種子,采樣信息見表1。

表1 供試材料Tab. 1 Materials used for this study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培育及處理 將7 個不同山核桃種的種子,整齊的擺放到濕潤的細(xì)沙中,24 ℃條件下催芽生根,待種子根長到3~5 cm 時,剪取不同山核桃種的嫩根,利用0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉和0.1%的秋水仙素的混合液進(jìn)行預(yù)處理,根尖利用固定液(甲醇:乙酸=3:1,v/v)進(jìn)行固定,放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色體標(biāo)本制備及制片預(yù)處理 染色體標(biāo)本制備參照陳瑞陽等(2003)的方法略進(jìn)行改進(jìn)。利用ddH2O 和0.075 mol·L-1的KCl 對根尖進(jìn)行前低滲處理,之后轉(zhuǎn)入2.5%纖維素和果膠酶的混合液中37 ℃酶解2~2.5 h。酶解結(jié)束后,加入固定液制成懸浮細(xì)胞,進(jìn)行染色體滴片。利用相差顯微(Olympus BX51)對染色體制片進(jìn)行觀察和篩選,然后利用10 mg·mL-1的RNase A、4%(質(zhì)量百分比)的胃蛋白酶和多聚甲醛等對制片進(jìn)行預(yù)處理,之后進(jìn)行熒光原雜交實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 山核桃重復(fù)序列寡核苷酸探針設(shè)計(jì)和制備1)簡單重復(fù)序列寡核苷酸探針設(shè)計(jì),對于1~3 堿基重復(fù)的SSR 簡并起來約16 種,分別為A、G、AT、GC、AG、AC、AAC、AAG、AGG、ACT、CAT、CAC、ACG、CAG、AAT 和GCC,對于這16 種SSR 按照30 nt 長度直接合成,并在5'進(jìn)行熒光修飾。2)其他類型重復(fù)序列寡核苷酸探針設(shè)計(jì),利用Tandem Repeat Finder 軟件預(yù)測分析預(yù)測山核桃基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences)。具體參數(shù)為:匹配權(quán)重Match = 2;錯配懲罰分值Mismatch = 7;插入缺失懲罰分值Delta = 7;匹配概率PM = 80;插入概率PI = 10;最小比對得分Minscore = 50;重復(fù)片段最大長度MaxPeriod = 2 000。預(yù)測結(jié)果通過Perl 腳本進(jìn)行匯總分析,分別統(tǒng)計(jì)不同長度不同重復(fù)類型的重復(fù)序列在山核桃全基因組中的出現(xiàn)頻率。過濾Period size > 4,篩選超過3 個堿基的復(fù)雜重復(fù)序列。為了更容易檢測到熒光信號,根據(jù)此前經(jīng)驗(yàn),進(jìn)一步篩選Copy number > 100,且Period size * Copy number > 3 000 的重復(fù)序列,用于設(shè)計(jì)高重復(fù)度的復(fù)雜重復(fù)序列探針。另外,分別利用小麥的5S rDNA 序列和45S rDNA 與山核桃基因組序列進(jìn)行比對,根據(jù)比對結(jié)果,設(shè)計(jì)出山核桃的sht-5S 和sht-45S寡核苷酸探針序列,所有探針序列均在5'進(jìn)行FAM或TAMRA 熒光修飾。

1.2.4 山核桃屬寡核苷酸熒光原位雜交分析 山核桃寡核苷酸熒光原位雜交參照杜培(2017)的方法略進(jìn)行改進(jìn),每張制片配制15 μL 雜交液(1.5 μL 20×SSC、0.5 μL ssDNA、7.5 μL dFA、2.0 μL 50% DS、1.5 μL 探針,加ddH2O 補(bǔ)充總體積至15 μL),雜交液和制片經(jīng)變性處理后,37 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后,分別利用2×SSC 及1×PBS 進(jìn)行洗片,利用熒光顯微鏡100 倍油鏡對制片進(jìn)行觀察和拍照,每個山核桃種至少統(tǒng)計(jì)30 個細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃重復(fù)序列寡核苷酸探針篩選結(jié)果

利用山核桃中期染色體對近60 條不同類型的重復(fù)序列寡核苷酸探針進(jìn)行熒光原位雜交分析,結(jié)果表明,sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-5S 和sht-45S 等6 個寡核苷酸探針可在山核桃染色體上產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號,具體探針序列信息及修飾方式如表2 所示。 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上分布情況相似,有2 對信號位點(diǎn)存在,其中1 對位點(diǎn)信號較強(qiáng),另外1 對位點(diǎn)信號非常微弱,幾乎檢測不到,且這2 對信號均位于山核桃染色體的近著絲粒部位(圖1a1—a4),2 個較強(qiáng)的信號位點(diǎn)極易斷裂,特別是其中的1 個位點(diǎn),已從信號中間或近中間部位完全斷裂成2 段,如圖1 虛線所示。sht-5S 是基于5Sr DNA 序列設(shè)計(jì)出的寡核苷酸探針,主要包括sht-5S-1,sht-5S-2 和sht-5S-3 等3 條不同的序列,這3 條序列等比例混合后,可在山核桃染色體上產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(圖2a1),且sht-5S 產(chǎn)生的熒光信號與質(zhì)粒5S rDNA 的熒光信號完全重疊(圖2a1--a3),這說明,寡核苷酸探針sht-5S 在功能上可代替質(zhì)粒5S rDNA 探針進(jìn)行使用。非常有趣的是,sht-5S 僅在單條山核桃染色體上產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號,主要位于染色體的近著絲粒部位,另1 條同源染色體的對應(yīng)位置并未檢測到相應(yīng)的熒光信號(圖2a1, a2)。sht-45S 是基于45S rDNA 序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針,主要包括sht-45S-1、sht-45S-2、 sht-45S-3、sht-45S-4、sht-45S-5、sht-45S-6、sht-45S-7 及sht-45S-8 等8 條不同的序列,結(jié)果表明,8條序列中,僅sht-45S-5 可在山核桃染色體上產(chǎn)生微弱的熒光信號,所產(chǎn)生的熒光信號如圖3a1 和a2 虛線圈所示,但這8 條序列等比例混合使用時,所產(chǎn)的熒光信號明顯增強(qiáng)(圖3a3),進(jìn)一步觀察,可以發(fā)現(xiàn),sht-45S 在山核桃染色體上有2 個信號位點(diǎn)存在,主要位于1 對同源染色體的近著絲粒部位,且其中1 個信號位點(diǎn)極易在中間或近中間部位斷裂成2 段,如黃色箭頭所示(圖3a3),導(dǎo)致山核桃大量細(xì)胞中出現(xiàn)3 個明亮的信號位點(diǎn)。雙色熒光原位雜交結(jié)果證實(shí),寡核苷酸探針sht-45S 產(chǎn)生的熒光信號與質(zhì)粒45S rDNA 熒光信號完全重疊(圖4a1—a3),且信號強(qiáng)度與45S rDNA 相似,這說明寡核苷酸探針sht-45S 寡核苷酸探針在功能上可以代替質(zhì)粒45S rDNA 探針進(jìn)行使用。

圖1 4 個不同寡核苷酸探針在山核桃染色體上的分布Fig. 1 The distribuiton of four oligo probes on the chromsome of C. cathayensis

圖2 寡核苷酸探針sht-5S (綠色)和5S rDNA 探針(紅色)在山核桃染色體上的共定位Fig. 2 Colocalization of oligo probe sht-5S (green) and plasmid probe 5S rDNA (red) on the chromsome of C. cathayensis

圖3 寡核苷酸探針sht-45S-5 在山核桃染色體上的分布Fig. 3 Distribuiton of oligo probe sht-45S-5 on the chromsome of C. cathayensis

圖4 寡核苷酸探針sht-45S (紅色)與質(zhì)粒45S rDNA(綠色)在山核桃染色體上的共定位Fig. 4 Colocalization of oligo probe sht-45S (red) and plasmid probe 5S rDNA (green) on the chromsome of C. cathayensis

表2 6 個不同寡核苷酸探針序列及修飾類型Tab. 2 The sequence and fluorescence modification information of six oligonucleotide probes

2.2 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上位置關(guān)系分析

由于寡核苷酸探針sht-2、 sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上的分布模式相似,為了進(jìn)一步對這4個不同寡核苷酸探針的位置關(guān)系進(jìn)行明確,我們對這4 個探針進(jìn)行了雙色熒光原位雜交分析。結(jié)果表明,山核桃染色體上sht-2 的2 對信號位點(diǎn)與sht-4 所產(chǎn)生的2 對信號位點(diǎn)在分布位置上完全重疊(圖5a1—a3),這說明,寡核苷酸探針sht-2 與sht-4 具有相同的功能。sht-3 與sht-4 在山核桃染色體上的雙色熒光原位雜交結(jié)果表明,sht-3 在山核桃染色體上產(chǎn)生的信號位點(diǎn)與sht-4 所產(chǎn)生的信號位點(diǎn)在位置上也完全重疊(圖5b1—b3),這說明寡核苷酸探針sht-3 與sht-4 具有相同的功能。sht-3 與sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明,sht-3 在山核桃染色體上的分布位置與sht-5 也完全重疊(圖5c1—c3)。以上結(jié)果說明,sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 雖然序列不同,但這4 個探針具有相同的功能,可作為1 個探針進(jìn)行使用。

圖5 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上共定位Fig. 5 Colocalization of oligo probe sht-2, sht-3, sht-4 and sht-5 on the chromsome of C. cathayensis

2.3 寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 在山核桃染色體上位置關(guān)系分析

因寡核苷酸探針sht-2,sht-3,sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上分布位置完全重疊,我們選擇sht-5 作為這4 個探針的代表,利用雙色熒光原位雜交技術(shù)分析了sht-5、sht-45S、及sht-5S 在山核桃染色體上的位置關(guān)系。sht-5S 和sht-45S 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明,sht-5S 和sht-45S 分別分布于山核桃的不同染色體上,在分布位置上沒有任何重疊(圖6a1-a3)。sht-45S 和sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明,sht-45S 的信號與sht-5 中1 對較強(qiáng)的信號位點(diǎn)完全重疊,也即sht-5 包含了全部sht-45S 的信號,因sht-45S 其中1 個信號位點(diǎn)從近中間部位斷開,我們實(shí)際觀察到3 個較強(qiáng)的信號點(diǎn)(圖6b1-b3)。sht-5S 與sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明,sht-5S 及sht-5 的信號是分布在山核桃的不同染色體上,彼此之間沒有任何重疊(圖6c1-c3)。

圖6 寡核苷酸探針sht-45S、sht-5S 及sht-5 在山核桃染色體上共定位Fig. 6 Colocalization of oligo probe sht-45S, sht-5S and sht-5 on the on the chromsome of C. cathayensis

2.4 寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 在6 個山核桃近緣種染色體上分布

寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 主要是根據(jù)山核桃基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行設(shè)計(jì)和開發(fā),為了進(jìn)一步驗(yàn)證這3 個探針的應(yīng)用范圍,我們分析了sht-5、sht-45S 及sht-5S 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃中期染色體上的分布,這6 個山核桃種染色體數(shù)目與山核桃相同,染色體數(shù)目均為2n=32。結(jié)果表明,sht-5 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃這4 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號,且信號分布模式與山核桃相似,均只有2 對強(qiáng)弱不同的信號位點(diǎn)存在,且其中一些染色體的信號位點(diǎn)也存在不同程度的斷裂,例如湖南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃其中1 條染色體在信號位點(diǎn)處斷裂成2 段,云南山核桃有2 條染色體發(fā)生了斷裂(圖7a1-a4),但sht-5 在薄殼山核桃和喙核桃2 個山核桃種染色體上沒有任何信號分布(圖7a5,a6)。

圖7 寡核苷酸探針sht-5 在6 個不同山核桃種染色體上的分布Fig. 7 The distribuiton of oligo probe sht-5 on the chromsome of six different Carya species

另外,寡核苷酸探針sht-45S 和sht-5S 在6 個山核桃近緣野生種上的分布情況與sht-5 不同,所分析的6個山核桃種中,除喙核桃外,寡核苷酸探針sht-45S 和sht-5S 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃、貴州山核桃及薄殼山核桃這5 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號(圖7,8)。其中,寡核苷酸探針sht-45S 在湖南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃3 個山核桃種染色體上的分布模式相似,均只有1對信號位點(diǎn)存在,且這對信號位點(diǎn)極易斷裂,例如大別山山核桃,其1 個sht-45S 信號位點(diǎn)已完全斷開,斷開的2 條染色體臂,其中1 條染色體臂保留了大部分sht-45S 熒光信號,另1 條斷開的染色體臂僅保留少量的sht-45S 熒光信號,如白色虛線所示(圖8a, c, d)。sht-45S 在云南山核桃染色體上有2 種不同的分布模式,第一種分布模式與山核桃情況相似,sht-45S 在云南山核桃染色體上有2 個信號位點(diǎn)存在,位于1 對同源染色體的近著絲粒處,且其中1 條染色體的sht-45S信號位點(diǎn)存在一定程度斷裂,如白色虛線所示(圖8b1),這種分布類型的細(xì)胞約占91.7%。第二種分布模式中,sht-45S 在云南山核桃染色體上有3 個信號位點(diǎn)存在,其中較強(qiáng)的1 對信號位點(diǎn)位于1 對同源染色體的近著絲粒處,第3 個位點(diǎn)非常微弱,有時甚至檢測不到,單獨(dú)位于1 條染色體的近著絲粒區(qū)域,如白色箭頭所示(圖8b2),另外,2 個較強(qiáng)的信號位點(diǎn)中,其中1 個位點(diǎn)極易斷裂,如圖中白色虛線所示(圖8b2),這種分布類型的細(xì)胞所占比例約為8.3%。sht-45S 在薄殼山核桃染色體上主要有2 對信號位點(diǎn)存在,位于2 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域,且其中1 對sht-45S 信號位點(diǎn)也存在一定程度的斷裂(圖8f)。

圖8 寡核苷酸探針sht-45S 在5 個不同山核桃種染色體上的分布Fig. 8 The distribuiton of oligo probe sht-45S on the chromsome of five different Carya species

sht-5S 在湖南山核桃染色體上有2 種不同的分布模式,第一種分布模式與山核桃相似,僅在其單條染色體上產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號,主要位于染色體的近著絲粒部位,另1 條同源染色體的對應(yīng)位置并未檢測到相應(yīng)的熒光信號(圖9a1),這種分布類型的細(xì)胞約占55.23%;第二種分布類型中,具有1 強(qiáng)1 弱2 個sht-5S信號位點(diǎn),位于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域,如圖9 a2 箭頭所示,這種分布類型的細(xì)胞約占44.77%。sht-5S 在云南山核桃及大別山山核桃分布情況相似,均只有1 對信號位點(diǎn)存在,分布于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域(圖9b,c),sht-5S 在貴州山核桃和薄殼山核桃染色體上的分布模式相似,具有1 強(qiáng)1 弱2 個sht-5S 信號位點(diǎn),如箭頭所示,位于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域(圖9d,e)。

圖9 寡核苷酸探針sht-5S 在5 個不同山核桃種染色體上的分布結(jié)果Fig. 9 The distribuiton of oligo probe sht-5S on the chromsome of five different Carya species

3 討論

在植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究中,熒光原位雜交技術(shù)是一項(xiàng)非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù),該技術(shù)在植物外源染色體鑒定、多倍體演化分析、染色體物理作圖及核型分析等方面發(fā)揮了重要的作用(Jiang,2019;Donget al.,2000;Caiet al.,2014;Heet al.,2015)。利用該技術(shù)對植物染色體進(jìn)行相關(guān)研究時,一般需要有充足合適的熒光探針,也即染色體物理標(biāo)記,染色體物理標(biāo)記的數(shù)量和種類在一定程度上對熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用的廣度和深度有著重要影響,例如水稻、黃瓜、玉米、小麥等一些農(nóng)藝植物,其染色體物理標(biāo)記數(shù)量和種類較多,因此其相關(guān)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)展也非常迅速,且相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于染色體物理標(biāo)記非常匱乏的一些物種。傳統(tǒng)的染色體物理標(biāo)記主要是通過篩選相應(yīng)的BAC 或TAC 文庫而獲得,開發(fā)過程不僅繁瑣,而且還需要有高精度的遺傳圖譜作參考,例如水稻、馬鈴薯等一些染色體特異物理標(biāo)記均是利用遺傳圖譜上的遺傳標(biāo)記去篩選相應(yīng)的BAC 文庫而獲得(Donget al.,2000;Chenget al.,2002)。對林木植物而言,多數(shù)林木植物童期長達(dá)10年或十年以上,很難大規(guī)模構(gòu)建遺傳作圖群體,目前大多數(shù)林木植物沒有相應(yīng)的遺傳圖譜,在染色體物理標(biāo)記開發(fā)方面存在較大難度,因此目前包括山核桃屬植物在內(nèi)的多數(shù)林木植物幾乎沒有可用的染色體物理標(biāo)記,這也成為制約林木植物細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展的技術(shù)瓶頸。本研究首次從山核桃基因組中成功開發(fā)出了sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-5S 和sht-45S 等6 個不同的寡核苷酸類型的染色體物理標(biāo)記,雖然開發(fā)的染色體物理標(biāo)記數(shù)量較少,但該研究結(jié)果使山核桃屬植物結(jié)束了無染色體物理標(biāo)記可用的歷史,同時也為山核桃屬植物建立了一種新的染色體物理標(biāo)記開發(fā)方法。

質(zhì)粒探針在進(jìn)行FISH 實(shí)驗(yàn)時,一般需要經(jīng)過質(zhì)粒提取、探針標(biāo)記等繁瑣步驟,且雜交時間較長,至少需要6 小時以上。與質(zhì)粒探針相比,寡核苷酸探針具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢,寡核苷酸探針不僅省去了質(zhì)粒提取和探針標(biāo)記等繁瑣步驟,而且雜交時間大幅度縮短,大部分寡核苷酸探針雜交2 小時即可檢測到清晰的熒光信號,有些寡核苷酸探針,例如小麥的寡核苷酸探針(GAA)10、花生的寡核苷酸探針DP-2 和 DP-4 等,雜交30 分鐘即可檢測到清晰的熒光信號 (Duet al.,2019;杜培,2017) ,這極大地提高了熒光原位雜交的效率。更重要的是寡核苷酸探針主要是根據(jù)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行開發(fā)和設(shè)計(jì),不需要相應(yīng)的遺傳圖譜作參照,也不需要篩選相應(yīng)的BAC 文庫,這為林木植物相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了一個新的研究方向。本研究中的sht-45S 和sht-5S 是基于山核桃基因組中的45S rDNA 和5S rDNA 序列所開發(fā)的2 個寡核苷酸類型的探針,不僅可代替質(zhì)粒探針45S rDNA 和5S rDNA對山核桃屬植物染色體進(jìn)行研究和分析,而且使山核桃屬植物相關(guān)的熒光原位雜交技術(shù)流程變得更加簡化和高效。

山核桃屬植物在地理分布上呈典型的間斷分布,間斷分布于北美和東亞地區(qū),一些分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果表明,包括薄殼山核桃在內(nèi)的12 個美國山核桃種聚為一大類,山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃、大別山核桃及喙核桃等一些中國山核桃種聚為另一大類,與山核桃屬植物間斷分布的地理格局完全吻合(Zhanget al.,2013;Huanget al.,2019)。本研究從山核桃基因組中所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-5,在5個中國山核桃種山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及大別山核桃染色體上均有信號分布,但在美國山核桃種薄殼山核桃染色體上卻沒有相應(yīng)的信號分布,這在一定程度上與山核桃屬植物間斷分布格局及相應(yīng)的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果存在一定的一致性。另外,sht-5 包含了sht-45S 的全部信號位點(diǎn),有趣的是,在薄殼山核桃染色體上檢測到了sht-45S 的信號位點(diǎn),卻未檢測到sht-5 的熒光信號,我們推測,因45S rDNA 在植物進(jìn)化過程中高度保守,在很多物種染色體上均可產(chǎn)生熒光信號(Roaet al.,2012),本研究所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-45S 是基于山核桃基因組中的45S rDNA 序列而獲得,具有較強(qiáng)的保守性,因此在薄殼山核桃染色體上產(chǎn)生了相應(yīng)的熒光信號,而sht-5 在山核桃屬植物中存在一定的分化,保守性沒有sht-45S 強(qiáng),因此在親緣關(guān)系較近的云南山核桃、大別山山核桃、湖南山核桃及貴州山核桃染色體上有分布,而在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的薄殼山核桃染色體上沒有分布。另外,本研究所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-5、sht-5S 和sht-45S 在喙核桃染色體上均未產(chǎn)生任何熒光信號,喙核桃在系統(tǒng)分類上,最初是歸屬到喙核桃屬(Annamocarya),后來一些研究者根據(jù)一些分子生物學(xué)研究結(jié)果,將其歸到山核桃屬(Manoset al.,2001;Zhanget al.,2013),根據(jù)我們的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果,我們推測喙核桃與山核桃存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,在系統(tǒng)分類上可能歸到喙核桃屬更為合適。

研究表明,植物染色體結(jié)構(gòu)變異在自然界中經(jīng)常發(fā)生,染色體結(jié)構(gòu)變異主要包括斷裂、融合、倒位、易位、重復(fù)和缺失等,例如苔屬植物(Carex)、菊屬植物(Reichardia)及蘭屬植物(Heterotaxis)等存在廣泛的染色體斷裂與融合現(xiàn)象(Chunget al.,2011;Moraeset al.,2016;Yakovlevet al.,2017)。本研究表明,山核桃、云南山核桃、大別山核桃、貴州山核桃、湖南山核桃及薄殼山核桃等山核桃種,其一些sht-5 或sht-45S 信號位點(diǎn)處存在明顯的斷裂現(xiàn)象,特別是其中的山核桃,其染色體上具有2 個(sht-45S)45S rDNA 信號位點(diǎn),分布于1 對同源染色體近著絲點(diǎn)上,但是其中1 條染色體易從45S rDNA 位點(diǎn)的中間或近中間位置斷開,斷開后的45S rDNA 片段變成2 個熒光信號較強(qiáng)的位點(diǎn),因此,在大量的細(xì)胞及染色體分裂相中觀察到3 個清晰明亮的45S rDNA 信號位點(diǎn)(約95%以上),這對我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀造成了極干擾,我們課題組曾經(jīng)將山核桃的45S rDNA 信號位點(diǎn)誤判成3 個(徐川梅,2017)。一些研究證實(shí),45S rDNA 是一個脆性位點(diǎn),該區(qū)域的DNA 重復(fù)序列極易斷裂,是一個重組熱點(diǎn)區(qū)域(Rochaet al.,2015),山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及大別山山核桃等山核桃種的45S rDNA 位點(diǎn)存在著不同程度的斷裂,說明這些山核桃種的45S rDNA 區(qū)域也是一個脆性區(qū)域。

理論上同源染色體在序列組成上是相同的,對應(yīng)的sht-5S(5S rDNA)分布模式也應(yīng)完全相同,但山核桃和湖南山核桃5S rDNA 表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性,只有1 條染色體上具有熒光信號,另1 條同源染色體上沒有檢測到任何熒光信號。一些研究證實(shí),其他一些植物中也存在5SrDNA 異質(zhì)分布現(xiàn)象,例如Philodendron bipennifolium具有3 個5S rDNA 位點(diǎn),2 個以成對形式位于1 對同源染色體的長臂近端處,另外1 個位點(diǎn)單獨(dú)位于1 條染色體的短臂處,Philodendron glaziovii2個5S rDNA 位點(diǎn)在形態(tài)大小及信號強(qiáng)度上存在極大差異(Vasconceloset al.,2018)。另外,我們課題組利用45S rDNA 和5S rDNA 對竹類植物染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時,發(fā)現(xiàn)5S rDNA 在部分竹種染色體上也存在一定的異質(zhì)性分布,例如金鑲玉竹(Phyllostachys aureosulcataf.spectabilis)及紫竹(Phyllostachys nigra)等竹種,具有3 個5S rDNA 位點(diǎn),明顯不對稱(數(shù)據(jù)即將發(fā)表)。一些研究者認(rèn)為染色體間不等交換、易位、DNA 序列刪除和丟失或者rDNA 區(qū)域染色體結(jié)構(gòu)的快速重排等均可導(dǎo)致rDNA 異質(zhì)性現(xiàn)象產(chǎn)生(Mondinet al.,2011)。因此,根據(jù)5S rDNA 在山核桃和湖南山核桃染色體上的分布結(jié)果,我們推測山核桃和湖南山核桃在染色體結(jié)構(gòu)上可能也發(fā)生過諸如插入、缺失、易位及不等交換等類型的染色體重組現(xiàn)象,進(jìn)而導(dǎo)致5S rDNA 在山核桃染色體上呈現(xiàn)出了一定的異質(zhì)性分布。另外,還有一些研究表明,山核桃和湖南山核桃存在一定的無融合生殖現(xiàn)象,因此,存在異質(zhì)分布的5S rDNA 可以通過母本穩(wěn)定的遺傳下去。

4 結(jié)論

本研究基于山核桃全基因組測序數(shù)據(jù),首次為山核桃開發(fā)出為sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-45S 及sht-5S 等6 個不同的寡核苷酸探針,這6 個探針在山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃等5 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號,可作為研究這5 個不同山核桃種染色體結(jié)構(gòu)的物理標(biāo)記。sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 雖然序列不同,但具有相同功能,可作為一個染色體物理標(biāo)記進(jìn)行使用。sht-45S 及sht-5S 是基于山核桃的45S rDNA 和5S rDNA 進(jìn)行設(shè)計(jì)和開發(fā),且sht-45S 和sht-5S 與質(zhì)粒探針45S rDNA 和5S rDNA 在山核桃染色體上的分布位置完全重疊,且信號強(qiáng)度也與質(zhì)粒探針相似,可用來代替45S rDNA 和5S rDNA 進(jìn)行使用。另外,根據(jù)sht-5、sht-45S 及sht-5S 在山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃等5 個山核桃種染色體上分布特點(diǎn),我們推測這5 個山核桃種的部分染色體在結(jié)構(gòu)上可能發(fā)生過一定斷裂或重接等遺傳變異。

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