胡 靚 邢蒙恩 房鴻嫄 劉瀚予 杜志琦 王 楠 孫艷梅 范文忠 馮立超

（1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 吉林 132101；2. 北華大學(xué) 吉林 132013）

樺潛葉蜂（Profenusa thomsoni）最早在古北區(qū)英國、日本發(fā)現(xiàn)為害白樺（Betulaplatyphylla），隨后傳播至北美地區(qū)，發(fā)生大規(guī)模為害（Britton, 1924；Ross, 1936）。以幼蟲潛食葉肉為害白樺葉片，嚴(yán)重時造成葉片脫落，葉片受害率達(dá)90%以上（Benson, 1959）。相關(guān)的研究報道，成蟲活動受溫度和相對濕度影響較大，溫度為21 ～ 22 ℃和相對濕度70 %時最適宜產(chǎn)卵，行動活躍（Martin, 1960）。在加拿大及美國阿拉斯加地區(qū)，幼蟲取食至6 齡后脫葉，在3～12 cm 土層內(nèi)或落葉層近地表做土繭進(jìn)入前蛹期（Digweedet al., 2009）。因此，樺潛葉蜂以老熟幼蟲脫葉進(jìn)入樹盤周圍土壤內(nèi)做土繭，土壤生境對翌年春季成蟲羽化出土具有重大影響。同時，通過對不同區(qū)域樺潛葉蜂為害率調(diào)查結(jié)果表明，在城市中的白樺比城郊村莊及天然林為害率更高（Digweedet al., 1997），這可能是由人類活動及地理隔離等的多重因素所主導(dǎo)，形成城市集中分布模式（Digweedet al., 2004）。同時，文獻(xiàn)記載樺潛葉蜂主動擴(kuò)散能力較弱（Digweedet al ., 1997）。在防控研究中，其中姬蜂科 （Ichneumonidae） 的Lathrolestes thomsoni和Lathrolestes soperi2 種寄生蜂在加拿大等地區(qū)可以有效地控制該害蟲為害（Andersenet al., 2021），土壤中的寄生性真菌和捕食性線蟲對樺潛葉蜂控制較差（Progaret al., 2015）。因此，研究樺潛葉蜂土壤中越冬蟲態(tài)習(xí)性及生態(tài)環(huán)境因子對其生存的影響，對于入侵性害蟲的防控具有重要意義。

目前，對樺潛葉蜂土壤中生活習(xí)性相關(guān)研究較少，且未見土壤理化性質(zhì)對其生存影響相關(guān)報道。鑒于此，本文研究土中越冬的幼蟲與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性，探討土壤越冬樺潛葉蜂對土壤性質(zhì)的適應(yīng)性，明確土壤環(huán)境因子（含水量、溫度、化學(xué)性質(zhì)）對樺潛葉蜂生存及發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 物種基因鑒定及生物學(xué)特性觀察

為明確吉林地區(qū)入侵的白樺潛葉蜂分類地位，通過形態(tài)特征與DNA（COI）序列比對，鑒定物種。采集成蟲（孤雌生殖）3 頭，用QIAGEN Blood & Tissue 試劑盒 （德國），根據(jù)無損法提取DNA（Taekulet al., 2014），保留提取過DNA 的樣品作為憑證標(biāo)本，供形態(tài)鑒定。使用徠卡DVM6 體視鏡、聯(lián)用Axiocam 506 color 數(shù)碼照相系統(tǒng)（德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）對憑證標(biāo)本拍攝，結(jié)果保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院。

獲得全基因組DNA 后，采用線粒體基因COI 通用引物（COI-F: 5' -CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'和COI-R: 5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'）COI 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（Simonet al., 1994）。擴(kuò)增體系為25 μL：PCR Master Mix(2×)12.5 μL，DNA 模板1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。PCR 產(chǎn)物取5 μL 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，由上海生工生物工程有限公司采用桑格測序法 （Thermo ScientificTMGeneRuleTMr DNA Ladder Mix 測序儀，美國）進(jìn)行雙向測序。獲得的原始序列在Geneious 軟件中進(jìn)行拼接并檢查是否含終止密碼子，排除假基因。對COI 序列與Wei，Taeger，Hari 等所發(fā)表的物種基因序列進(jìn)行比對分析（Weiet al., 2006；Taeger, 2010；Haris,2021）。在MEGA 軟件中使用MUSCLE Alignment 算法對序列進(jìn)行并對，并用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹。

2020 年5—8 月，在實驗室內(nèi)和野外采用對比觀察法調(diào)查記錄蟲體生物學(xué)特性。實驗室內(nèi)使用恒溫培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置為（20 ± 1）℃，相對濕度75%，光周期模擬野外為白晝 : 黑夜 = 12 h∶12 h；在5 個培養(yǎng)箱內(nèi)分別移入10 組盛有白樺林下原位土壤培養(yǎng)盒（長30 cm×寬20 cm×深15 cm），記錄成蟲羽化時間。羽化后成蟲于養(yǎng)蟲籠內(nèi)使用新鮮白樺葉進(jìn)行飼養(yǎng)，觀察并記錄產(chǎn)卵、幼蟲生活史等特性。同時，在白樺林內(nèi)觀察記錄對比觀察野外潛葉蜂為害情況。

1.2 試驗設(shè)計

選取吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院白樺種植林、吉林市綠化管理處第一苗圃白樺種植林，面積各5 000 m2，2 地相距4.8 km，進(jìn)行野外調(diào)查，試驗區(qū)遠(yuǎn)離大型工廠、居民建筑群等。試驗保護(hù)區(qū)寬10 m，采用平行行法于地表設(shè)置60 目尼龍網(wǎng)罩，樣方長30 cm×寬20 cm×深15 cm（Soperet al., 2015），相鄰樣點間隔10 m，采樣點網(wǎng)罩布置圖（圖1），每個試驗區(qū)各設(shè)置36 個采樣點。

圖1 潛葉蜂土壤越冬后成蟲羽化定量觀察Fig. 1 Quantitative observation of leaf miner adult emergence after overwintering

1.3 不同發(fā)育階段蟲量統(tǒng)計

越冬前老熟幼蟲及越冬后羽化成蟲統(tǒng)計。于采樣地點設(shè)置面積大小一致的網(wǎng)籠布置于地表，在老熟幼蟲集中脫葉階段，統(tǒng)計網(wǎng)籠內(nèi)掉落的幼蟲數(shù)量。入土5 天后，采集網(wǎng)罩樣方毗鄰區(qū)域樹盤周圍面積大小相同的土壤樣品，每樣地區(qū)域共采集36 個。采用顯微鏡鏡檢土壤中幼蟲數(shù)量，統(tǒng)計越冬前土壤內(nèi)做土繭幼蟲數(shù)量。春季越冬后成蟲羽化出土階段，統(tǒng)計網(wǎng)罩采樣點處成蟲羽化量。每天統(tǒng)計樣方網(wǎng)罩內(nèi)成蟲羽化出土數(shù)量直至無成蟲出土。

1.4 土壤理化性對樺潛葉蜂生存影響

為研究土壤含水量對樺潛葉蜂幼蟲化蛹及成蟲羽化的影響，于2020 年5 月白樺展葉初期，土壤平均溫度為15 ℃左右時設(shè)2 個試驗區(qū)。在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院設(shè)置的樣地內(nèi)采用人工灑水車對白樺進(jìn)行澆水，間隔3 天澆水1 次，參考吉林市5—6 月年平均降水量，每次澆水6.8 L·m-2，至成蟲羽化。每天測定2個樣地不同樣點土壤15 cm 深處土壤含水量變化。以吉林市綠化管理處第一苗圃白樺樣地處理作為對照，不進(jìn)行澆灌水處理。分別采集2個試驗地0～15 cm 的土壤各36 份，每份500 g，待用，采用常規(guī)試驗方法進(jìn)行測試。

采用碳氮分析儀Vario MACRO cube 測定土壤全氮（TN）和全碳（TC）（德國Elementar 分析傳感系統(tǒng)股份有限公司）；采用ICP-AES 9800 測定土壤總磷（TP）（日本島津公司）。采用玻璃指示電極法[瑞士梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]測定土壤酸堿度（pH）（Spitzeret al., 2011）；土壤含水量（SWC）采用烘干法（105±1） ℃烘干12 h 至恒重（Wilke，2005）；土壤地溫計用于檢測采樣點內(nèi)土壤溫度（ST）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用t檢驗（Holm-?ídák analysis method for multiple comparisons）比較2 分布地白樺林內(nèi)樺潛葉蜂羽化量差異性，顯著性差異水平（P＜0.01）；采用相關(guān)性分析方法（correlation analysis）分析樺潛葉蜂土壤內(nèi)越冬存活量與土壤含水量的相關(guān)性關(guān)系，同時結(jié)合冗余分析RDA（redundancy analysis）分析土壤理化性質(zhì)對樺潛葉蜂的生存影響，采用蒙特卡洛檢驗 （Monte Carlo methods）檢驗對羽化的影響是否顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種鑒定

采用形態(tài)學(xué)與線粒體DNA 細(xì)胞色素氧化酶亞基（COI）基因序列片段對比相結(jié)合進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果見圖2。

圖2 樺潛葉蜂相近屬系統(tǒng)發(fā)育樹及成蟲鑒定特征Fig. 2 Leaf miner phylogenetic tree and adult identification characteristics

形態(tài)特征：雌性，成蟲頭部黑褐色，觸角絲狀11 節(jié)。前翅第3臀脈與第一臀脈遠(yuǎn)離；后翅第一緣室和臀室為開室；翅基片為黑色。中胸盾片中葉突具側(cè)毛；第一腹節(jié)背板后緣弧形彎曲，亞中部最寬。鋸狀產(chǎn)卵器，橙黃色—深褐色，具明顯的弧形鋸齒。卵，初產(chǎn)白色，于葉片表皮內(nèi)吸水膨脹后呈半透明，大小為0.5 mm；孵化過程顏色逐漸變深，孵化前為棕色。幼蟲：初孵幼蟲長1 mm。頭部棕褐色，三角形；背腹扁平，前突，重度硬化。前胸寬于頭部，腹面有一個大的中央和2個側(cè)面的深棕色斑紋。蟲體自前胸至腹部逐漸變細(xì)，透明可見腸道。中胸和后胸腹側(cè)有小的橢圓形棕色斑紋。胸部和腹部的氣門呈棕色，突出。老熟幼蟲體呈圓柱形，暗白色，半透明。蛹：化蛹于幼蟲分泌物黏貼所形成的土繭內(nèi)，蛹長4～5 mm，復(fù)眼紅棕色，頭部半透明白色，體軀呈淡黃色。末期逐漸變成藍(lán)灰色，最后變成黑色。

經(jīng)成蟲COI 序列測定，SC855_1基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中Profenusa thomsoni序列100%的相似度 (圖2)。

生活史及習(xí)性：樺潛葉蜂在吉林地區(qū)年發(fā)生2 代。6 月上旬，始見羽化的成蟲，在白樺的下層幼嫩葉片以幼兒蟲潛葉危害；6 月下旬至7 月上旬，第一代幼蟲大多數(shù)幼蟲脫葉落入淺土層中，少數(shù)于葉片內(nèi)化蛹，并羽化出成蟲，繼續(xù)危害白樺中、上部嫩葉，8 月下旬至9 月上旬，以老熟幼蟲脫葉入土，主要在5～10 cm 做土繭越冬；世代不整齊。觀察發(fā)現(xiàn)，在干旱年份直至降雨成蟲才陸續(xù)羽化。

成蟲喜樹冠下層葉片產(chǎn)卵，卵產(chǎn)于葉片上表皮和柵欄層之間，平均每葉4～6 枚卵，偶有10 枚卵以上。成蟲蟲口密度大，全部葉片均會被產(chǎn)卵，多蟲在同一葉片產(chǎn)卵，但新葉不會被利用?？諝庀鄬穸雀哂?0%，溫度20～25 ℃利于成蟲產(chǎn)卵。第2代成蟲羽化后逐漸向樹冠中、上層葉片產(chǎn)卵。卵孵化時間為10 天。幼蟲共6 齡；老熟幼蟲脫葉后掉落至地表，在土壤縫隙及淺土層中做土繭。

2.2 樺潛葉蜂土壤中不同發(fā)育階段蟲量變化

樺潛葉蜂老熟幼蟲脫葉入土量、入土后做繭量及成蟲羽化量變化見圖3。

圖3 不同區(qū)域樺潛葉蜂幼蟲越冬階段及越冬后蟲體存活量Fig. 3 Overwintering stages and post-overwintering survival of P.thomsoni larvae in different regions

通過對冬前土壤中幼蟲做繭情況調(diào)查表明，越冬前2樣地白樺林土壤內(nèi)平均做繭率分別86.47%和89.26%，在2樣地內(nèi)老熟幼蟲做繭量無差異（P＞0.05）；翌年春季澆水處理后，澆水樣地（Plot 2）成蟲羽化量極顯著高于對照樣地（Plot 1）羽化量（P＜0.01）(圖3)。

2.3 土壤理化性對樺潛葉蜂的影響

試驗地人工澆水及對照處理，樺潛葉蜂成蟲羽化量對比分析見圖4。

圖4 土壤含水量及溫度與樺潛葉蜂羽化量關(guān)系Fig. 4 P. thomsoni eclosion in relation to soil water content and temperature

不同試驗區(qū)樣方的土壤含水量對羽化的影響分析，差異極顯著（P＜0.01）（圖4a）；成蟲羽化量與土壤含水量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01,R=0.85）（圖4b）。對照樣地內(nèi)土壤含水量低，樺潛葉蜂成蟲羽化量受到抑制。土壤pH、氮含量與羽化量正相關(guān)（圖5a）；人工澆水處理提高了土壤含水量，對成蟲羽化具有顯著促進(jìn)作用（P＜0.01），而土壤化學(xué)性質(zhì)對成蟲羽化量影響較?。▓D5b）。

圖5 土壤理化性質(zhì)對樺潛葉蜂羽化作用Fig. 5 Effect of soil physicochemical properties on adults eclosion

3 討論

3.1 氣候因子對樺潛葉蜂分布決定作用

樺潛葉蜂在北美地區(qū)每年發(fā)生1 代，以孤雌生殖形式完成繁殖（Digweed, 2006）。在吉林地區(qū)每年發(fā)生2 代，第一代化蛹于葉片上表皮和柵欄層之間，第2代化蛹于土壤內(nèi)。通過對吉林市區(qū)及周邊山區(qū)、人工林及天然次生林白樺危害情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)僅在市區(qū)內(nèi)2個區(qū)域發(fā)生為害，發(fā)生面積約為12 hm2，分布范圍受限的主要原因是其傳播主要途徑為人為傳播，而主動飛行擴(kuò)散能力較弱（Digweedet al., 2009；Digweedet al., 2004）。因此，樺潛葉蜂為害發(fā)生的主要區(qū)域與人類活動頻繁或集中性有關(guān)。

吉林地區(qū)（42°—44°N）冬季平均溫度比阿拉斯加和加拿大（54°—71°N）高，土壤內(nèi)越冬溫度對樺潛葉蜂越冬的致死率會降低。適應(yīng)低溫生存的昆蟲在高溫區(qū)生存受到抑制，限制了物種分布區(qū)域（Coulsonet al., 1996；Irwinet al., 2000）。因此，樺潛葉蜂在北半球由高緯度向低緯度地區(qū)入侵過程中，隨著溫度升高，其分布區(qū)域可能會受限。在本研究中，土壤溫度幾乎未影響成蟲羽化，可能是由于春季土層溫度維持在10～15 ℃，此溫度區(qū)間有利于大多數(shù)土壤動物生存（Sulkavaet al., 1996）。在冬季，森林土壤內(nèi)10 cm 土層內(nèi)溫度在-3 ℃以上（Weigelet al., 2021），由于動物體內(nèi)代謝及其他生理變化對機(jī)體組織的保護(hù)，此溫度并未對大多數(shù)土壤動物構(gòu)成死亡威脅（Sulkavaet al.,2003）。水分是生物體的必要物質(zhì)，適宜的土壤含水量是維持土壤動物生存的基本條件；遇干旱脅迫時，絕大多數(shù)土壤動物都會改變自身生存狀態(tài)，通過降低代謝速率等生理活動，進(jìn)入休眠、滯育等生存狀態(tài)，以最大程度的適應(yīng)土壤環(huán)境（Danks, 2000；Holmstrup,2014）。春夏交替季節(jié)是樺潛葉蜂成蟲羽化出土的時間，在本研究中，受降水影響，2020 年5—6 月吉林地區(qū)降水量嚴(yán)重減少，土壤表層含水量嚴(yán)重降低，平均含水量不足14%。人工澆水處理區(qū)，土壤含水量維持在14.3%～30.8%之間，直接改變了樺潛葉蜂羽化時間，提高羽化量。以上結(jié)果表明，溫度升高導(dǎo)致水分的加速散失，對冬季生存的節(jié)肢動物構(gòu)成嚴(yán)重威脅（Everattet al., 2015）。因此，土壤含水量在干旱季節(jié)決定了樺潛葉蜂對生存選擇，土壤含水量是限制蟲口密度的關(guān)鍵抑制因子。

3.2 土壤化學(xué)性質(zhì)及生物因子對樺潛葉蜂生存影響

白樺林下土壤其他化學(xué)性質(zhì)幾乎不影響樺潛葉蜂越冬幼蟲成活率，這可能是由于老熟幼蟲脫葉入土做土繭期間分泌黏液類物質(zhì)，將周圍土壤顆粒黏聚于體軀外表形成土繭，而本身并不直接與土壤長期接觸，且體壁分泌黏液所形成的保護(hù)層直接隔離外部土壤與體軀直接接觸（Martin, 1960），因此，對其生存影響較弱。本研究表明，在自然條件下，土壤含水量與樺潛葉蜂的成蟲羽化量和羽化時間相關(guān)，含水量相對較高的區(qū)域羽化量大，羽化時間提前；相反羽化量降低，羽化時間延長。此外，由于土壤內(nèi)復(fù)雜的地下生存環(huán)境條件；盡管土壤化學(xué)性質(zhì)如pH、碳、氮、磷等物質(zhì)對樺潛葉蜂影響較小，但天敵及微生物對進(jìn)入前蛹的蟲體的捕食或寄生作用，也是制約翌年成蟲羽化的影響因素之一（Progaret al., 2015；Soperet al., 2019；Sch?nroggeet al., 1992）。

本研究通過對土壤含水量控制，明確樺潛葉蜂越冬蟲態(tài)對水分的適應(yīng)性。在相對可控的土壤環(huán)境條件下，通過樹盤土壤翻耕，破壞土繭周圍土壤水分環(huán)境，對削減蟲口密度具有一定的作用。對于人為傳播等控制措施，加強(qiáng)對土壤、白樺苗木調(diào)運等檢疫措施，以及合理使用殺蟲劑。由于本研究樣地處于同一區(qū)域并無差異，因此溫度對成蟲羽化的作用并未體現(xiàn)。樺潛葉蜂在吉林地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)為害白樺，受其研究范圍受限，對于樺潛葉蜂的擴(kuò)散、大面積發(fā)生為害等與當(dāng)?shù)貧夂颉讟逶耘嗲闆r、生態(tài)環(huán)境以及寄生性微生物和天敵等關(guān)系研究需進(jìn)一步開展。

4 結(jié)論

樺潛葉蜂是一種入侵性有害生物，主要危害白樺，在吉林地區(qū)每年發(fā)生2 代，以幼蟲在土壤內(nèi)越冬。土壤理化性質(zhì)是決定樺潛葉蜂翌年成蟲發(fā)生量關(guān)鍵影響因素，含水量相對較高的土壤促進(jìn)了樺潛葉蜂越冬蟲態(tài)的發(fā)育，而相對干旱的土壤抑制成蟲羽化，羽化時間延長。