趙偉東，郭寶玲，鄭祥洲*，湯水榮，孟磊，張玉樹(shù)

（1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570228；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所/福建省植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350013）

近年來(lái)，隨著溫室氣體急劇增加，極端氣候等一系列重大全球性的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，引起人們廣泛關(guān)注[1-2]。增溫潛勢(shì)最高的N2O 不僅能引起溫室效應(yīng)，還會(huì)對(duì)臭氧層造成嚴(yán)重破壞，甚至威脅地球生物健康[3-4]。研究表明，農(nóng)田土壤是N2O 的重要排放源，每年農(nóng)田的N2O 排放量占全球N2O 總排放量的43%以上[5-6]。同時(shí)，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)也具有巨大的固碳減排潛力[7]。因此，降低農(nóng)田土壤N2O 排放對(duì)緩解氣候變化、提高氮肥利用率等具有極其重要的意義。施肥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的農(nóng)田管理措施之一，在提升土壤肥力的同時(shí)也影響著農(nóng)田N2O 排放，而在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中不同施肥種類(lèi)和不同施肥量對(duì)N2O 排放的影響存在較大差異[8-11]。普遍認(rèn)為施入氮肥會(huì)促進(jìn)土壤N2O 的排放[8，12-13]。通過(guò)合理的施肥管理不僅能夠培肥土壤，而且對(duì)緩解土壤N2O 排放也具有積極意義[11，14]。施肥是補(bǔ)充土壤無(wú)機(jī)氮和影響N2O排放的最直接的驅(qū)動(dòng)因子。農(nóng)田土壤常年高氮投入導(dǎo)致土壤氮過(guò)剩的問(wèn)題已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，氮肥的過(guò)量施用顯著提高nirK 和nosZ 基因拷貝數(shù)[15-16]，引起N2O 排放量增加[17]。然而，Yin 等[18]的研究卻表明高氮投入降低nirS 基因拷貝數(shù)。秸稈還田具有提高土壤碳儲(chǔ)量，增加土壤肥力[19]，降低土壤N2O 排放的作用[14，20]。但裴淑瑋等[21]的研究結(jié)果表明秸稈還田顯著增加了農(nóng)田N2O 排放。由此可見(jiàn)，高氮投入和秸稈還田對(duì)土壤N2O 排放的影響均未得到共識(shí)。土壤水分是影響土壤N2O 排放的重要環(huán)境因素之一[22]。水分可以改變土壤微生物生存環(huán)境，進(jìn)而影響N2O 排放。有研究報(bào)道，在低水分條件下，土壤N2O 排放主要由硝化作用主導(dǎo)，而在高水分條件下則是由反硝化作用主導(dǎo)[23-26]。徐華等[27]認(rèn)為水分通過(guò)改變土壤中O2濃度、溫度和底物濃度等條件，能在很大程度上改變自養(yǎng)型細(xì)菌的組成，進(jìn)而影響土壤N2O 排放。而Qin 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，增加土壤水分含量主要影響含nirK 和nosZ 基因微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控N2O的排放。水分含量調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而決定硝化作用和反硝化作用的相對(duì)強(qiáng)度及N2O 的排放。因此，不同水分條件下土壤N2O 排放的微生物機(jī)制尚未得到統(tǒng)一結(jié)論，還需結(jié)合土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等進(jìn)一步探索。

南方地區(qū)是我國(guó)主要的水稻生產(chǎn)基地，高溫多雨的氣候條件造就了普遍的水旱輪作種植模式。煙-稻輪作是我國(guó)福建省水旱輪作的典型模式之一，為保證兩季作物的產(chǎn)量，通常投入大量化學(xué)肥料，從而容易引起硝態(tài)氮淋溶和N2O 排放加劇等一系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題。通常情況下，氮過(guò)量會(huì)降低土壤pH，并且增加N2O 排放，而秸稈添加能緩解土壤酸化，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，降低N2O 排放。輪作過(guò)程中的干濕交替導(dǎo)致兩季土壤水分存在很大差異，這不僅會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而且對(duì)N2O 排放也具有很大影響。不同水分條件下，N2O 排放對(duì)不同肥料投入的響應(yīng)還需進(jìn)一步驗(yàn)證?；诖耍驹囼?yàn)以水-旱輪作長(zhǎng)期定位試驗(yàn)土壤為研究對(duì)象，設(shè)置60%持水量（WHC）和淹水兩個(gè)水分條件，用來(lái)模擬煙葉季和水稻季的田間水分狀況，研究不同水分對(duì)長(zhǎng)期定位不同施肥量土壤N2O 排放的影響，以期為亞熱帶地區(qū)稻田溫室氣體減排提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

田間原位監(jiān)測(cè)試驗(yàn)地建于2008 年，位于中國(guó)福建省三明市將樂(lè)縣古鏞鎮(zhèn)張公村（26°44'53″N，117°26'48″E）。該地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為18.9 ℃，年平均降水量為1 667~1 880 mm，年均日照約1 736 h；土壤母質(zhì)為花崗巖，土壤腐殖質(zhì)層15~30 cm。監(jiān)測(cè)點(diǎn)處于山腰位置，坡度為8°。試驗(yàn)站點(diǎn)設(shè)置時(shí)耕層土壤平均pH 為5.31，有效磷20.5 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)（SOM）25.85 g·kg-1、全氮（TN）1.39 g·kg-1，銨態(tài)氮（和硝態(tài)氮含量分別為7.12 mg·kg-1和2.20 mg·kg-1。每年2月或3月種植煙草，7月種植水稻。樣地設(shè)置4 個(gè)處理，分別為不施肥（CK），推薦施肥（NPK），高氮施肥（NhPK），推薦施肥+水稻秸稈還田（NPKS），具體施肥量見(jiàn)表1。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)施肥處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)地塊（7 m×4 m），地塊用磚框隔開(kāi)。2021 年水稻季收獲后采用S 型采樣法多點(diǎn)采集表層土壤（0~15 cm），充分混勻后分為兩部分：一部分土壤于室溫下風(fēng)干并過(guò)2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定；另一部分土樣于4 ℃條件下低溫儲(chǔ)存，并在一周內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。

表1 煙?稻輪作模式下不同施肥處理及施肥量Table 1 Different fertilization rates in fertilization treatments under tobacco-rice rotation modes

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在4 種長(zhǎng)期不同施肥的基礎(chǔ)上，設(shè)置60%WHC（U）和淹水（F）2 個(gè)不同的水分條件，共8 個(gè)處理，每個(gè)處理稱取30 g 土壤（干基）于250 mL 三角瓶中，加入去離子水使水分含量達(dá)到50%WHC，25 ℃預(yù)培養(yǎng)1周，使土壤微生物充分激活。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將尿素溶液均勻施入到相應(yīng)處理的土壤中，使得每個(gè)處理添加的氮含量達(dá)到200 mg·kg-1，同時(shí)調(diào)節(jié)含水量，使每個(gè)長(zhǎng)期施肥處理土壤分別達(dá)到目標(biāo)水分，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，用透氣膜封口后于25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后的第1、3、5、7、10、14、21、28、32 天取樣測(cè)定N2O和無(wú)機(jī)氮濃度。

1.3 樣品采集

取氣時(shí)先將三角瓶連接帶有軟管和三通閥的橡膠塞，連接處已涂抹強(qiáng)力膠并晾干，保證裝置氣密性良好，利用配套的多孔抽真空裝置，連續(xù)置換空氣3次，每次不低于1 min，再次放入25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)6 h，然后用連接有三通閥的20 mL 針管進(jìn)行取氣，取氣時(shí)緩慢推拉針管3 次，使瓶?jī)?nèi)氣體混合均勻后再進(jìn)行取氣。取氣完畢后，向三角瓶中加入150 mL 1 mol·L-1KCl 溶液，190 r·min-1振蕩提取1 h 后過(guò)濾，得到的濾液用來(lái)測(cè)定濃度。培養(yǎng)結(jié)束后，均勻分取最后一天土壤樣品約10.00 g，?80 ℃冷凍保存，于兩周內(nèi)進(jìn)行熒光定量qPCR分析。

1.4 樣品分析與測(cè)定

土壤pH值采用水土比為2.5∶1的電位法測(cè)定；有效磷含量用1 mol·L-1NH4F 溶液浸提、鉬藍(lán)比色法測(cè)定；SOM 采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測(cè)定；TN 采用半微量開(kāi)氏法測(cè)定，具體測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。水溶性有機(jī)碳（DOC）含量采用有機(jī)碳氮分析儀（Shimadzu Corp，Kyoto，日本）測(cè)定；土壤最大持水量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[29]中的方法；含量采用1 mol·L-1KCl 溶液浸提后使用SKALAR 連續(xù)流動(dòng)分析儀（Skalar，Breda，荷蘭）測(cè)定；N2O 氣體濃度采用安捷倫氣相色譜儀（7890A，美國(guó)）測(cè)定。

采用MOBIO公司的土壤快速提取試劑盒（Power?SoilTMDNA Isolation Kits）進(jìn)行DNA 提取，提取步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后用超微量紫外分光光度計(jì)（（NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定OD260的值。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA片段，DNA樣品于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采用土壤中氨單加氧酶（AMO）基因，亞硝酸還原酶nirK、nirS 基因和氧化亞氮還原酶nosZ基因拷貝數(shù)分別表示氨氧化古菌（AOA）、氨氧化細(xì)菌（AOB）與nirK、nirS 和nosZ 反硝化菌，PCR 擴(kuò)增所用引物和反應(yīng)條件如表2 所示。定量分析采用SYBR GREEN I 法，反應(yīng)體系為20 μL，其中包括10 μL 2X ChamQ SYBR Color qPCR Master M，10 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL，0.4 μL 50 X ROX Reference Dy，2 μL Template（DNA），6 μL 無(wú)菌水。并使用10-1~10-8濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增（ABI 7300 型熒光定量PCR 儀，Applied Bio?systems，美國(guó)），最后根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算基因豐度。

表2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的引物和反應(yīng)條件Table 2 Amplification primers and reaction conditions for real-time quantitative PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

N2O排放通量的計(jì)算如公式（1）所示：

式中：F 為N2O 排放通量，μg·kg-1·h-1；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O-N的密度；dc/dt為單位時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體濃度增加量，10-6·h-1或10-9·h-1；V 為培養(yǎng)瓶中氣體的有效空間體積，m3；m為培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的烘干土質(zhì)量，kg；T為培養(yǎng)溫度，℃。

氣體累積排放量通過(guò)相鄰2 次培養(yǎng)時(shí)間的平均氣體排放通量與時(shí)間相乘后加權(quán)累積計(jì)算，如公式（2）所示：

式中：Ci+1為第i 次和第i+1 次采樣期間的氣體累積排放量，mg·kg-1；Fi為第i次采樣時(shí)氣體瞬時(shí)排放通量；i為采樣次數(shù)；D為兩次采樣間隔時(shí)間，d。

數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值，采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用SPSS 27.0 軟件在Duncan（SSR）方法下分析不同水肥處理各指標(biāo)的差異顯著性，利用Ori?gin Pro 2022制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期不同施肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

如表3 所示，與CK 相比，各長(zhǎng)期施肥處理均顯著降低土壤pH，但顯著提高土壤有效磷和DOC 含量。各施肥處理下SOM 含量為NPK>NPKS>NhPK>CK（15.58~20.09 g·kg-1），相對(duì)于CK 處理，NPK 和NPKS處理均顯著增加SOM 含量。土壤TN 含量為NPKS>NhPK>NPK>CK（1.05~1.26 g·kg-1），統(tǒng) 計(jì) 分 析 表 明NPKS 處理下TN 含量顯著高于其他施肥處理。碳氮比（C/N）為NPK>NhPK>NPKS>CK（8.66~10.57），NPK顯著高于其他處理。與CK 相比，長(zhǎng)期不同施肥各處理均顯著降低土壤含量，NhPK 和NPKS 均顯著提高土壤含量（P<0.05）。

表3 長(zhǎng)期不同田間施肥處理土壤理化性質(zhì)Table 3 Soil properties of different treatments after long term experiment

2.2 土壤

含量 的動(dòng)態(tài)變化

整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，60%WHC 下NH+4-N 含量變化范圍為13.17~196.83 mg·kg-1，各處理土壤NH+4-N 動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致（圖1a），UNPK 和UNhPK 處理于培養(yǎng)第3 天左右達(dá)到峰值，UCK 和UNPKS 處理于培養(yǎng)第5 天達(dá)到峰值，5 d 后均轉(zhuǎn)變?yōu)橄陆第厔?shì)。培養(yǎng)的7~28 d 時(shí)，UCK 處理NH+4-N 含量顯著高于其他處理。淹水條件下NH+4-N 含量變化范圍為0~138.85mg·kg-1，各處理土壤變化趨勢(shì)高度趨同（圖1b），除UNPKS 第3 天達(dá)到峰值外，其他處理皆于培養(yǎng)第5天達(dá)到峰值，5 d后轉(zhuǎn)變?yōu)橄陆第厔?shì)。14~32 d，F(xiàn)CK 處理含量顯著高于其他處理。氮肥添加會(huì)明顯提高土壤含量，大量的由土壤硝化作用轉(zhuǎn)化為。整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，60%WHC 下含量變化范圍為9.92~267.17 mg·kg-1，各處理土壤動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)大致相同（圖1c），除UNPK處理于第21 天達(dá)到峰值外，其他處理含量均一直增加至培養(yǎng)結(jié)束。3~32 d，UCK處理含量顯著低于其他處理。淹水條件下含量變化范圍為4.65~162.60 mg·kg-1，淹水各處理土壤變化趨勢(shì)高度相似（圖1d），F(xiàn)CK和FNPK處理在第21天達(dá)到峰值，而FNhPK 和FNPKS 處理在第28 天達(dá)到峰值，第10天后整體變化幅度逐漸增大。10~32 d，F(xiàn)CK處理含量顯著低于其他處理?？傮w而言，60%WHC 下各施肥處理和含量的變化幅度均顯著大于對(duì)應(yīng)的淹水各施肥處理。

圖1 兩種不同水分條件下各施肥處理和含量動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Dynamic changes ofandcontent per fertilization treatment under two different moisture conditions

2.3 土壤N2O排放通量和累積排放量

60%WHC 條件下，N2O 排放通量（以N 計(jì)）的變化范圍為0.05~5.13 μg·kg-1·h-1（圖2a）。UCK 處理在第7 天和第28 天分別出現(xiàn)兩次峰值，且第7 天的N2O 排放通量更高；UNPK和UNhPK處理均在第28天出現(xiàn)峰值，而UNPKS 處理僅在第14 天顯示出微弱的峰值，隨后一直呈降低趨勢(shì)，直至培養(yǎng)結(jié)束。淹水條件下，N2O 排放通量（以N 計(jì)）的變化范圍為0.03~73.61 μg·kg-1·h-1；各處理N2O排放通量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致（圖2b）。除FNhPK 處理在第10 天達(dá)到峰值外，其他處理皆于培養(yǎng)第14 天達(dá)到峰值，隨后一直處于下降狀態(tài)，直至培養(yǎng)結(jié)束；3~21 d，F(xiàn)NPKS 處理略高于其他處理?？傮w而言，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，淹水條件下各施肥處理N2O 排放通量峰值均遠(yuǎn)高于60%WHC 對(duì)應(yīng)的各施肥處理。

圖2 兩種不同水分條件下各施肥處理N2O排放動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamic changes of N2O emissions per fertilization treatment under two different moisture conditions

60%WHC 條件下，至培養(yǎng)結(jié)束，各處理N2O 累積排放量達(dá)到0.56~1.44 mg·kg-1（圖3a）。與UCK 相比，UNPK、UNhPK、UNPKS 處理的N2O 累積排放量分別降低了45%、38%、61%，均顯著低于UCK 處理；UNPKS顯著低于其他施肥處理。淹水條件下，至培養(yǎng)結(jié)束，各處理N2O 累 積排放量為14.89~20.70 mg·kg-1（圖3b）。與FCK 相比，F(xiàn)NPK 和FNPKS 處理N2O 累積排放量分別提高了10%和18%，而FNhPK 降低了12%?？傮w而言，淹水各施肥處理N2O 累積排放量大于60%WHC 各施肥處理，淹水條件顯著促進(jìn)了各施肥處理的N2O 排放。土壤N2O 排放和無(wú)機(jī)氮相關(guān)性分析結(jié)果表明，在兩種水分條件下，土壤N2O 累積排放量均與含量呈正相關(guān)（P<0.01）（圖4）。

圖3 兩種不同水分條件下各施肥處理土壤N2O累積排放量Figure 3 Cumulative emission of N2O from per fertilization treatments under two different moisture conditions

圖4 兩種不同水分條件下土壤N2O累積排放量和含量的相關(guān)性Figure 4 Correlation between cumulative N2O emissions andcontent under two different moisture conditions

2.4 微生物功能基因豐度

60%WHC 培養(yǎng)結(jié)束后，不同施肥處理下土壤（干土）的AOA和AOB基因拷貝數(shù)分別為8.06×106~1.54×107copies·g-1和1.14×107~1.75×107copies·g-1（表4）。與UCK相比，UNPK、UNhPK、UNPKS處理的AOA基因拷貝數(shù)分別提高48%、42%、25%，AOB 基因拷貝數(shù)分別提高17%、1%、35%。相比于UCK，UNPK、UNhPK含量呈負(fù)相關(guān)，與處理顯著提高AOA 基因拷貝數(shù)，UNPKS 處理顯著提高AOB 基因拷貝數(shù)。淹水條件培養(yǎng)結(jié)束后，不同處理AOA 和AOB 基因拷貝數(shù)分別為1.45×107~3.59×107copies·g-1和1.35×107~3.00×107copies·g-1（表4）。與FCK 相比，F(xiàn)NPK、FNhPK、FNPKS 的AOA 基因拷貝數(shù)分別提高60%、13%、26%，AOB 基因拷貝數(shù)分別提高55%、41%、49%。相比于FCK 處理，F(xiàn)NPK、FNhPK、FNPKS 均顯著提高了AOA 和AOB 基因拷貝數(shù)；與FNPK 相比，F(xiàn)NhPK、FNPKS 顯著降低AOA 基因拷貝數(shù)，F(xiàn)NhPK 顯著降低AOB 基因拷貝數(shù)?？傮w而言，淹水條件各施肥處理AOA 和AOB 基因拷貝數(shù)分別為60%WHC各處理的1.80~2.49倍和1.19~2.19倍。

表4 不同水分條件下各施肥處理微生物相關(guān)功能基因豐度Table 4 Abundance of microbial functional genes under different water conditions under different fertilization treatments

60%WHC 培養(yǎng)結(jié)束后，不同處理的nirK、nirS 和nosZ 基因拷貝數(shù)分別為8.78×106~1.23×107、1.79×107~3.42×107、5.78×107~7.90×107copies·g-1（表4）。 與UCK 相比，UNhPK、UNPKS 處理的nirK 基因拷貝數(shù)分別降低28%和10%，UNPK、UNhPK、UNPKS 的nirS 基因拷貝數(shù)分別降低19%、91%、71%；UNPK 和UNPKS處理的nosZ 基因拷貝數(shù)分別提高9% 和7%，而UNhPK 處理降低24%。各處理中nosZ 基因拷貝數(shù)均顯著高于nirK和nirS基因拷貝數(shù)，分別提高0.84~0.87倍和0.52~0.74 倍。與UCK 相比，UNhPK 處理均顯著降低nirK、nirS 和nosZ 基因拷貝數(shù)，說(shuō)明氮肥過(guò)量施入使得反硝化相關(guān)功能基因豐度減??；UNPKS的nirS基因拷貝數(shù)顯著低于UCK和UNPK處理，說(shuō)明秸稈添加顯著減少nirS 基因拷貝數(shù)；與此同時(shí)UCK、UNPK、UNPKS 處理的nosZ 基因拷貝數(shù)相對(duì)于nirK 和nirS 均具有較高水平。60%WHC 下，氮過(guò)量施肥均顯著降低nirK、nirS 和nosZ 基因拷貝數(shù)，推薦施肥配施秸稈處理顯著降低nirS基因拷貝數(shù)。淹水下培養(yǎng)結(jié)束后，不同處理nirK、nirS 和nosZ 基因拷貝數(shù)分別為1.01×107~1.18×107、3.41×107~5.43×107、7.06×107~8.65×107copies·g-1（表4）。與FCK 相比，F(xiàn)NPK、FNhPK 和FN?PKS 處理的nirK 基因拷貝數(shù)分別提高15%、5%和1%，F(xiàn)NPK、FNhPK、FNPKS 處理的nirS 基因拷貝數(shù)分別降低60%、52%、47%；FNPK 和FNhPK 的nosZ 基因拷貝數(shù)分別降低7%和7%，而FNPKS 處理提高12%。FCK 處理的nirS 基因拷貝數(shù)顯著高于其他處理，說(shuō)明肥料投入和秸稈配施都顯著降低nirS 基因拷貝數(shù)。總體而言，淹水條件下各施肥處理nirS基因拷貝數(shù)是60%WHC的1.19~2.00倍。

3 討論

3.1 長(zhǎng)期施肥處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

施肥是提升土壤肥力的有效措施，而土壤理化性質(zhì)是評(píng)價(jià)土壤是否健康的重要指標(biāo)[30]。本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期不同施肥處理降低輪作土壤pH（表3），這與方凱等[31]的研究一致，長(zhǎng)期化肥和化肥配施秸稈處理均降低土壤pH。鄒湘等[32]的研究也表明，與不施肥相比，長(zhǎng)期NPK 和NPKS 施肥處理也顯著降低土壤pH。這可能是由于氮肥的施入，雖然可以暫時(shí)提高土壤pH 值，但土壤中NH+4-N 轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮時(shí)，釋放大量的H+，長(zhǎng)期氮肥投入造成土壤酸化，進(jìn)而土壤pH 降低?；逝涫┙斩捊档屯寥纏H，可能由于秸稈中含有微生物代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物代謝過(guò)程產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致土壤酸化[33]。長(zhǎng)期NPKS 處理提高SOM 和TN 含量（表3），這與方凱等[31]和郝耀旭等[34]的研究結(jié)果一致，化肥配施秸稈處理提升SOM 和TN 含量。然而本研究中，長(zhǎng)期NPK處理也顯著增加了SOM含量（表3），這可能是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮肥的施入在增加作物產(chǎn)量的同時(shí)，也增加了作物凋落物、根茬殘?bào)w和根分泌物，在刺激土壤微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，促進(jìn)了土壤腐殖質(zhì)的分解，故而SOM 含量增加[35]。但本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期NPK處理并未顯著增加土壤TN含量，這就導(dǎo)致長(zhǎng)期NPKS處理C/N含量低于NPK處理。

3.2 輪作系統(tǒng)土壤各施肥處理N2O 排放及相關(guān)功能基因?qū)λ值捻憫?yīng)

土壤水分是調(diào)控土壤硝化和反硝化作用相對(duì)強(qiáng)度與N2O 排放的重要因素[38]。硝化作用通常偏好于好氧環(huán)境，而反硝化作用更偏好于厭氧環(huán)境[39-40]。本研究表明，淹水顯著降低各施肥處理土壤的硝化作用強(qiáng)度，而且顯著增加N2O 排放（圖1、圖2 和圖3）。這與李平等[41]的研究結(jié)果相似，即淹水顯著抑制硝化作用的進(jìn)行，但顯著增加N2O 的排放。本研究中，F(xiàn)CK、FNPK、FNhPK、FNPKS各處理和含量變化幅度均顯著小于UCK、UNPK、UNhPK、UNPKS，說(shuō)明淹水顯著降低硝化作用的強(qiáng)度；但培養(yǎng)第32 天時(shí)FCK、FNPK、FNhPK、FNPKS 處理土壤的AOA 和AOB基因拷貝數(shù)分別是UCK、UNPK、UNhPK、UNPKS 處理土壤的1.80、2.34、2.49、1.84 倍和1.19、2.19、1.98、1.53倍，淹水各施肥土壤氨氧化微生物功能基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于60%WHC 各施肥處理，這可能由于土壤中氨氧化微生物具有耐低氧條件的特性，AOA 和AOB 拷貝數(shù)較大，但氨氧化微生物活性較低[42]。有研究指出，當(dāng)土壤水分大于60%WHC 時(shí)，硝化作用的強(qiáng)度逐漸降低，反硝化作用的強(qiáng)度隨水分增加而增加[43]。土壤水分含量主要通過(guò)影響含nirK 和nosZ 基因微生物的群落結(jié)構(gòu)，刺激部分小豐度微生物的生長(zhǎng)，調(diào)控N2O的排放強(qiáng)度[28]。但本研究第32 天培養(yǎng)完畢時(shí)淹水處理各施肥土壤nirS 基因拷貝數(shù)顯著高于60%WHC 對(duì)應(yīng)的各施肥處理，這可能由于土壤C/N 及其對(duì)施肥的響應(yīng)能力差異所導(dǎo)致。本研究中淹水各施肥土壤（nirK+nirS）/nosZ比值顯著大于60%WHC對(duì)應(yīng)的各施肥處理，淹水各施肥土壤透氣性降低，O2向土壤中擴(kuò)散被表層淹水限制，從而促進(jìn)了反硝化作用，增加了土壤N2O排放[44-45]。

有研究表明，施用氮肥會(huì)增加土壤N2O排放[46-47]，秸稈添加降低土壤N2O 排放[48-49]。但本研究結(jié)果顯示，UCK 處理N2O 累積排放量均大于其他施肥處理，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期不施肥改變了土壤質(zhì)地，降低了土壤透氣性，隨著土壤中少量的O2被消耗，形成反硝化作用更喜好的厭氧環(huán)境，從而觸發(fā)了反硝化作用的發(fā)生，從（nirK+nirS）/nosZ 比值角度也可看出，UCK 處理的（nirK+nirS）/nosZ 比值雖然低于FCK，但顯著高于UNPK、UNhPK 和UNPKS 處理。淹水各施肥處理N2O排放沒(méi)有顯著差異，這與湯宏等[50]和朱啟林等[51]的研究結(jié)果均不一致。淹水條件下N2O 的排放主要由反硝化作用主導(dǎo)[23]。本研究中培養(yǎng)第32 天時(shí)FNPK、FNhPK、FNPKS處理的（nirK+nirS）/nosZ 比值無(wú)顯著差異，這表明淹水時(shí)施肥處理反硝化作用強(qiáng)度無(wú)顯著差異，導(dǎo)致N2O 排放量無(wú)顯著差異。李彬彬等[52]的研究表明，土壤起始C/N越低，N2O排放量越高。FCK處理N2O 排放量較高主要是CK 處理土壤C/N 較低所致。60%WHC 水分條件下，推薦施肥配施秸稈處理顯著降低N2O 排放量，這與柴凱斌[14]的研究結(jié)果一致?？赡茉蚴牵海?）秸稈還田增加了土壤中SOM 含量，為微生物提供了能量，可固定更多的無(wú)機(jī)氮[53-54]；（2）秸稈還田刺激土壤中的礦質(zhì)氮微生物活性，進(jìn)而減少硝化和反硝化作用的底物[55-56]；（3）培養(yǎng)32 d 時(shí)，UNPKS處理的（nirK+nirS）/nosZ 比值顯著低于其他處理，UN?PKS 處理減弱土壤反硝化作用，減少N2O 的排放。綜上所述，淹水抑制了不同施肥的響應(yīng)，且增加了土壤N2O的排放。

4 結(jié)論

（1）本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施肥降低土壤pH，推薦施肥配施秸稈處理增加SOM 和TN 含量；相比于推薦施肥，高氮施肥和推薦施肥配施秸稈處理降低土壤C/N。

（2）與不施肥相比，60%WHC 條件下，推薦施肥提高AOA 基因拷貝數(shù)，高氮施肥提高AOA 基因拷貝數(shù)，降低nirK、nirS 和nosZ 基因拷貝數(shù)，推薦施肥配施秸稈提高AOB 基因拷貝數(shù)，降低nirS 基因拷貝數(shù)；淹水條件下，3 種施肥處理均提高AOA 和AOB 基因拷貝數(shù)，均降低nirS的基因拷貝數(shù)。

（3）淹水條件劇烈增加N2O 排放，對(duì)溫室氣體減排造成不利影響，而且抑制了不同施肥的響應(yīng)，尤其降低秸稈添加的減排效果。

（4）綜合兩種水分條件對(duì)不同定位長(zhǎng)期施肥輪作土壤N2O 排放的影響，水稻秸稈還田對(duì)煙-稻輪作系統(tǒng)中烤煙季溫室氣體減排具有積極意義。