陳雅嬌 李濤 許潑實★

《中國心血管健康與疾病報告2021》顯示我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)3.3 億，其中腦卒中1 300萬、冠心病1 139 萬、高血壓2.45 億，心血管病的發(fā)病率與致死率高居疾病榜首，防控形勢依然嚴(yán)竣。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、中風(fēng)和猝死等心腦血管疾病的主要病理因素。AS 是由血脂代謝異常引起、多種因素參與的病理生理過程［1］，其形成的機制復(fù)雜，尚未完全闡明。因此，進一步從內(nèi)皮細胞（Endothelial cells，ECs）和血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）改變、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、免疫氧化應(yīng)激等領(lǐng)域探討AS 的發(fā)生發(fā)展機制尤為重要。miRNAs 作為細胞粘附、增殖、脂質(zhì)攝取及炎癥介質(zhì)生成等過程的重要調(diào)控因子，為研究AS 形成機制提供新的分子視角。

1 miRNA 在AS 發(fā)病機制中的作用

1.1 miRNAs 概述

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是進化保守、約18～24 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，結(jié)合特定靶mRNA 序列的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR），通過阻斷mRNA 翻譯和/或促進mRNA 降解導(dǎo)致蛋白表達減少。據(jù)估計，60%的蛋白質(zhì)編碼基因直接受miRNAs 調(diào)控?，F(xiàn)已在人類發(fā)現(xiàn)超過2 000 種miRNAs，由于每種miRNA 可以調(diào)節(jié)多個基因的表達，且每個特定的基因可被多個miRNAs 調(diào)節(jié)，因此miRNAs 是調(diào)控多種病理生理過程基因表達的關(guān)鍵靶點［2］。鑒于miRNAs 的固有特性，其作為AS 各個階段mRNA 和蛋白表達的關(guān)鍵調(diào)控因子已得到臨床和病理研究的支持。

1.2 miRNA 與ECs 功能異常

AS 病變始于血管內(nèi)膜，內(nèi)膜脂質(zhì)累積引起ECs 激活伴通透性變化，并發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，包括異常遷移、增殖及黏附分子等表達改變，這些改變又刺激炎癥細胞在內(nèi)皮下和內(nèi)膜中粘附和遷移，引起ECs 受損，繼而出現(xiàn)脂質(zhì)點、脂質(zhì)條紋、粥樣斑塊和復(fù)合病變，導(dǎo)致AS 的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs 參與AS 病變過程中ECs 功能的調(diào)控，包括衰老、凋亡及氧化還原過程等。在AS 患者血漿中，miR-34a 的表達水平顯著升高，并下調(diào)Sirtuin-1（SIRT1）基因的表達促使ECs 衰老［3］。SIRT1作為長壽的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，保護細胞免受氧化和毒性應(yīng)激來阻止應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老，這說明miR-34a 參與了ECs 衰老過程的調(diào)控。多種調(diào)控ECs 凋亡的miRNAs 也參與到AS 進程中。miR-34a 不僅可以參與上述ECs 衰老調(diào)控，還可以靶向B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）基因抑制氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的ECs 凋亡，促進ECs 增殖，延緩AS的進展［3］。miRNAs 還可通過調(diào)控氧化還原平衡來影響ECs 的功能。一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，eNOs）、NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）等是維持細胞氧化還原平衡的必須酶。在ECs 中，miR-155 能夠下調(diào)eNOS3基因的表達影響細胞氧化還原平衡［4］。miR-146a 通過靶向在缺血和炎癥應(yīng)激期間對血管系統(tǒng)發(fā)揮保護作用的NOX基因來對抗ECs 的氧化［5］。

1.3 miRNAs 與VSMCs 功能異常

VSMCs 表現(xiàn)出顯著的表型可塑性，即從收縮狀態(tài)去分化為合成狀態(tài)，同時增加增殖和遷移能力，這是AS 進展的關(guān)鍵步驟。越來越多的研究表明，miRNAs 對于調(diào)節(jié)VSMCs 的表型轉(zhuǎn)換及增殖、遷移至關(guān)重要。一些miRNAs 對VSMCs 的增殖和遷移發(fā)揮促進作用。如miR-21 直接靶向SPRY1基因促進VSMCs 去分化為合成表型，增加VSMCs 增殖和遷移能力［6］。此外，miR-491-5p 也能夠促進VSMCs 的增殖及遷移［7］，這些miRNAs共同促進AS 發(fā)展。然而一些miRNAs 對VSMCs 的增殖和遷移發(fā)揮抑制作用。在AS 模型中miR-145的表達下調(diào)，通過細胞骨架組織的改變來調(diào)節(jié)VSMCs 對球囊損傷的增殖反應(yīng)，并促進VSMCs 收縮，抑制增殖性表型［8］。AS 斑塊中發(fā)生血管內(nèi)膜鈣化，同時伴隨著細胞壞死、炎癥反應(yīng)等，對AS 產(chǎn)生極大的影響。在ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化細胞模型中，miR-33a-5p 表達顯著下調(diào)，并通過靶向甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）基因抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMC 鈣化［9］。在血管鈣化的細胞模型中，利用miR-27a-3p 抑制物處理細胞，導(dǎo)致鈣化增加，且激活的轉(zhuǎn)錄因子3（Activating transcription factor 3，ATF3）蛋白增加，說明miR-27a-3p 通過調(diào)控ATF3基因表達減少血管的鈣化［10］。

1.4 miRNA 與膽固醇代謝

膽固醇是AS 病變各階段的關(guān)鍵參與者，膽固醇穩(wěn)態(tài)對細胞生理學(xué)至關(guān)重要，膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致其在細胞內(nèi)積累。膽固醇代謝多個階段都受到miRNAs 的調(diào)控，如膽固醇的生物合成。miR-122 是第一個被發(fā)現(xiàn)參與膽固醇代謝的miRNA，抑制miR-122 的表達導(dǎo)致小鼠體內(nèi)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（Sterol-regulatory element binding proteins-1，SREBP1），脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）等膽固醇合成相關(guān)基因表達下調(diào)，膽固醇水平顯著降低［11］。miR-185 直接靶向SREBP2基因，抑制SREBP2 蛋白的表達，調(diào)節(jié)膽固醇生物合成途徑［12］。

miRNAs 通過靶向低密度脂蛋白受體（Low-Density Lipoprotein Receptor，LDLR）調(diào)控膽固醇生物攝取。肝臟中LDLR 促進循環(huán)中LDL 顆粒的清除，是血漿膽固醇水平的主要調(diào)節(jié)因素。在小鼠體內(nèi)抑制miR-128-3p 的表達可以增加循環(huán)中標(biāo)記LDL 的清除率并降低血漿LDL-C 的水平［13］。miR-224 和miR-520d 均可以通過LDLR 調(diào)控LDL-C 的水平［14］。

此外，miRNAs 還參與調(diào)控膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運。膽固醇不能在肝外被降解，必須運輸?shù)礁闻K重新使用和外排，這個過程稱為膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運（Reverse Cholesterol Transport，RCT）。細胞膽固醇外排受ATP 轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控，包括三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ATP-binding cassette transporterG1，ABCG1）。研究發(fā)現(xiàn)miR-33a 和miR-33b 是膽固醇和脂肪酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［15］。miR-33 的過度表達抑制ABCA1 蛋白表達，并減少了細胞內(nèi)膽固醇向Apo-A1 流出。而抑制miR-33 表達導(dǎo)致ABCA1 蛋白表達增加，血漿HDL 水平升高，促進AS 消退。

1.5 miRNA 與炎癥反應(yīng)

AS 被認為是一種慢性炎癥性疾病，炎癥是AS過程中病理變化的共同基礎(chǔ)。在AS 發(fā)展過程中，局部的微環(huán)境會發(fā)生復(fù)雜的變化，并且伴隨著多種免疫細胞浸潤，尤其是單核細胞源性巨噬細胞、樹突狀細胞等。巨噬細胞是AS 病變中最豐富的白細胞亞群，微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細胞啟動不同的激活程序，分化為經(jīng)典促炎表型（M1 表型）和抗炎表型（M2 表型），AS 的進展主要與M1 型巨噬細胞的激活有關(guān)［16］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-92 通過調(diào)控Kruppel 樣因子4（Kruppel like factor 4，KLF4）基因抑制巨噬細胞活化、誘導(dǎo)其從促炎性M1 向抗炎性M2 表型極化從而緩解AS 形成。miR-92 對巨噬細胞促炎性激活有增強作用，miR-92 抑制處理的巨噬細胞表現(xiàn)出M2 型生物標(biāo)志物增加的特性［17］。樹突狀細胞通過感應(yīng)和呈遞斑塊中的抗原，參與先天性免疫和適應(yīng)性免疫。miR-155 通過阻斷促炎細胞因子的分泌和減少樹突狀細胞表面分子CD40 和CD83 的表達減弱ox-LDL 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［18］。除炎癥細胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子同樣參與到整個AS 過程中。Toll 樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）是先天免疫反應(yīng)中模式識別受體的典型代表，它能刺激促炎細胞因子釋放，促進泡沫細胞形成。在ox-LDL 誘導(dǎo)的THP-1 細胞中，miR-140-5p 的表達明顯降低，miR-140-5p 下調(diào)TLR4基因表達，抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的THP-1 細胞炎癥因子釋放［19］。miR-217 也可以下調(diào)TLR4基因發(fā)揮其對炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用，發(fā)揮抗AS 的功能［20］，為抑制AS 發(fā)展提供了新的思路。過氧化物酶體增殖物活化受 體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能是將體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)變化等轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號。在AS 小鼠模型中，過表達miR-130a 促進炎癥因子的表達，同時抑制PPARγ 基因表達，上調(diào)NF-κB蛋白表 達水平［21］，即miR-130a 過表達調(diào)控PPARγ 基因誘導(dǎo)NF-κB 增加炎癥因子的水平，促進AS 發(fā)展。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）在AS 炎癥基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)中至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124 在AS 小鼠中表達量顯著改變，在ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細胞中，用miR-124 模擬物處理細胞，巨噬細胞內(nèi)促炎癥因子分泌減少，抗炎因子表達增加［22］。

如前所述，miRNAs 參與AS 形成多過程，具體研究不同miRNAs 調(diào)控的不同過程，有助于對AS的發(fā)病機制進行完善。參與AS 病理生理過程調(diào)控的miRNAs 均可能作為調(diào)控AS 的分子靶點，成為診斷、治療AS 的重要策略。

2 miRNA 作為AS 診斷標(biāo)志物

miRNAs 可以在血液、尿液等體液穩(wěn)定存在，且部分miRNA 在AS 不同病理階段細胞或組織特異性表達，這使得它們非常適合成為非侵入性生物標(biāo)志物。冠心病患者循環(huán)中miR-21、miR-92a 等水平增加，其中miR-21 在AS 患者血清增加最為顯著。且miR-21 的表達在有癥狀和無癥狀的斑塊之間具有顯著差異，提示miR-21 可作為區(qū)分有無癥狀斑塊負荷的潛在生物標(biāo)志物［23］。此外，監(jiān)測循環(huán)miRNAs 的水平可作為評估疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)，在AS 患者中，miR-223 和miR-126 表達降低導(dǎo)致其相關(guān)靶基因活性增加，從而使AS 斑塊纖維帽穩(wěn)定性顯著降低，因此miR-223 和miR-126 在評估頸動脈斑塊破裂的風(fēng)險中有重要臨床應(yīng)用價值［24］。miRNAs 在體液中廣泛存在且樣本較易采集。因此其作為診斷AS 標(biāo)志物具有廣闊前景，但仍需大量的研究尋找高靈敏度、高特異性的標(biāo)志miRNAs。

3 miRNA 作為AS 治療新靶點

miRNAs 不僅為理解AS 發(fā)病機制提供了一個新視角，還極大可能成為治療AS 新靶點。幾類基于RNA 的治療藥物正處于臨床開發(fā)階段，可分為miRNA 模擬物和miRNA 抑制劑。

miRNA 抑制物是單鏈的，其設(shè)計用于靶向mRNA，通過強烈結(jié)合阻斷mRNA 的功能。臨床前研究表明，通過全身遞送靶向miR-33 的反義寡核苷酸增加ABCA1 的表達，減少了AS 小鼠斑塊負荷［25］。小干擾RNA（siRNA）與目標(biāo)mRNA 互補結(jié)合時，可以實現(xiàn)RNA 的敲低。在小鼠體內(nèi)沉默miR-351 可以有效緩解小鼠AS，其相關(guān)靶基因siRNA 的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了miR-351 沉默誘導(dǎo)的細胞凋亡下降、脂質(zhì)積累減少和氧化應(yīng)激水平降低［26］。

使用miRNAs 模擬物遞送是另一種有吸引力的治療方法，miRNA 模擬物是合成的雙鏈小RNA分子，以補充在疾病狀態(tài)下丟失的miRNAs 表達。例如，在載脂蛋白E-小鼠主動脈內(nèi)膜和血漿中，miR-181b 表達顯著下調(diào)，miR-181b 模擬物的全身遞送使其表達增加2～3 倍，與對照組相比可顯著減少AS 形成［27］。體外培養(yǎng)的ECs 轉(zhuǎn)染miR-126-5p模擬物，ECs 增殖明顯且凋亡減少［28］，有望成為治療AS 的新策略。

4 總結(jié)與展望

miRNAs 調(diào)節(jié)AS 過程的作用引起人們廣泛關(guān)注，近年來此方面的研究迅速增加，并取得巨大進展。但基于miRNAs 的基因表達調(diào)控在生理和病理狀態(tài)下仍存在許多問題。在AS 中，許多針對不同蛋白質(zhì)和mRNA 的miRNAs 已經(jīng)被研究，但是在病理狀態(tài)驗證這些靶標(biāo)是極具挑戰(zhàn)的，因為miRNAs調(diào)節(jié)不同細胞類型和不同生物體的異質(zhì)性，需要進一步考慮多個基因之間的組合或特定的相互作用，這在AS 生理和病理狀態(tài)下的作用非常重要。為開發(fā)基于miRNAs 的治療方法，重要的是考慮一組miRNAs 在AS 系統(tǒng)內(nèi)是否具有協(xié)同作用。此外，miRNAs 在AS 發(fā)生發(fā)展過程中新調(diào)控機制的不斷涌現(xiàn)，給AS 診斷、治療及預(yù)后帶來新的希望。