孫雯可，王佳璐，劉鼎闊，李源，于曉雪*，李留安*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300392；2.鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司，天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300383）

L-肉堿（L-carnitine），又名肉毒堿、左卡尼汀，化學(xué)式為C7H15O3N，相對分子質(zhì)量為162.2，常溫下為白色，呈結(jié)晶粉末狀，在植物中含量少，主要存在于動物肝臟和骨骼肌內(nèi)[1]。L-肉堿具有多種生理功能：L-肉堿作為轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸到線粒體內(nèi)的載體，可通過促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，降低機(jī)體內(nèi)多余的脂肪含量[2-3]；L-肉堿可清除過氧化氫、超氧陰離子，保護(hù)內(nèi)源抗氧化酶系統(tǒng)，起到抗氧化作用[4-5]；外源補(bǔ)充L-肉堿可以減少氨基酸類添加劑和維生素的用量，提高飼料蛋白質(zhì)的利用率，從而動物體內(nèi)多余的氨基酸和相關(guān)活性離子可用來供給動物體其他生理活動。有研究證明，蛋雞日糧添加L-肉堿可改善生長期蛋雞的生產(chǎn)性能，提高產(chǎn)蛋量、雞蛋蛋品質(zhì)和種蛋的孵化率[6]；肉雞日糧添加L-肉堿有助于提髙肉雞的飼料利用率、降低死亡率[7]。L-肉堿在畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日益廣泛，建立準(zhǔn)確、快速、高靈敏度檢測生物樣品中L-肉堿含量的方法，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，L-肉堿的檢測方法有酶法測定法、分光光度色譜法、毛細(xì)管電泳色譜法[8]、液相色譜法等[9]。酶法測定方法易受干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；分光光度色譜法重復(fù)性差，不適合大批量樣本檢測[10]；毛細(xì)管電泳色譜法的操作程序復(fù)雜性較高[11]。目前，常用高效液相色譜法來檢測L-肉堿，但L-肉堿極性強(qiáng)，不易在色譜柱上保留，故本試驗采用反向色譜分離技術(shù)，通過優(yōu)化流動相組成和比例，改變流速及樣品提取方法，建立一種測定雞血漿中L-肉堿含量的高效液相色譜法，以期能夠快速簡便地檢測出雞血漿中的L-肉堿。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

雞血漿由華北柴雞翅下采血，抗凝處理，4 000 r/min離心取上清液獲得，-80 ℃凍存；乙腈、甲醇（均為色譜純）：德國Merck 公司；L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶生物科技有限公司；庚烷磺酸鈉：上海吉至生化科技有限公司；磷酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1260）：美國安捷倫公司；色譜柱ACE Excel 5 Super C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-100D）：昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)（H1850R）：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；0.22 μm濾膜：天津市南開區(qū)青創(chuàng)儀器儀表銷售商行。

1.2 反向色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 Super C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-5mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 流動相的選擇

考察3 種不同流動相對L-肉堿檢測結(jié)果的影響：1）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90（體積比）；2）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（體積比）；3）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）。

1.3.2 流速的選擇

0.4 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品在流速為0.6 mL/min 和0.7 mL/min 時分別進(jìn)樣，考察流速對L-肉堿分離效果的影響。

1.3.3 樣品處理方法

處理方法1：取200 μL 血漿，加入2 mL 乙腈，4 000 r/min 離心，取上清液于5 mL 容量瓶中，用純水定容，抽取1 mL 溶液經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)濾膜注射入進(jìn)樣瓶中，備用。

處理方法2：取200 μL 血漿，加入2 mL 乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比），后續(xù)步驟同處理方法1。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取20 mg L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，用20 mL 純水溶解，制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。準(zhǔn)確吸取不同量標(biāo)準(zhǔn)品儲備液分別至于5 mL 容量瓶中，加純水稀釋至刻度并搖勻，分別配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取20 μL 進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)由Microsoft Office Excel 軟件處理，數(shù)據(jù)為3 次測定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相選擇

不同流動相對色譜峰的影響如圖1 所示。

圖1 不同流動相條件試驗色譜圖Fig.1 Chromatograms of different mobile phase conditions

圖1A、B 可知，流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為4.364 min，但在此條件下檢測不出樣品中L-肉堿；圖1C、D 可知，當(dāng)流動相為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為11.278 min，但檢測不出樣品中L-肉堿；圖1E、F 可知，當(dāng)流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為10.039 min，檢測樣品中L-肉堿峰形良好；圖1G、H可知，在乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）的流動相條件下，標(biāo)準(zhǔn)品溶劑和樣品溶劑在10 min 處均無峰。因此后續(xù)試驗選擇乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）為流動相。

2.2 流速選擇

不同流速對色譜峰的影響如圖2 所示。

圖2 不同流速對L-肉堿色譜峰的影響Fig.2 Influence of different flow rates on the chromatographic peak of L-carnitine

由圖2 可知，在流速為0.6 mL/min 時，L-肉堿保留時間為10.094 min，峰形良好且能與雜峰完全分離；在流速為0.7 mL/min 時，L-肉堿保留時間為8.708 min，峰形不好，拖尾嚴(yán)重，故流速選定為0.6 mL/min。

2.3 不同前處理條件優(yōu)化

不同前處理條件對色譜圖的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同前處理方法提取L-肉堿對色譜峰的影響Fig.3 Effect of L-carnitine extraction by different pretreatment methods on chromatogram

由圖2 可知，用處理方法1 提取樣品，檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.075 min，峰面積響應(yīng)值為2.732 mAU；用處理方法2 提取樣品，檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.118 min，峰面積響應(yīng)值為4.076 mAU，峰形好，與雜質(zhì)完全分離。處理方法2 比處理方法1 提取的L-肉堿量高，故本試驗采用處理方法2：乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）進(jìn)行樣品處理。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

對配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測，線性試驗結(jié)果見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The diagram of standard curve

由圖4 可知，L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=402.35x-0.228 3（R2=0.999 8），表明L-肉堿在0.01～0.60 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.5 檢出限與定量限

L-肉堿的檢出限為0.005 mg/mL，定量限為0.017 mg/mL。

2.6 精密度

相同色譜條件下將0.6 mg/mL 的L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6 次，檢測精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Precision test results

如表1 所示，本方法精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.8%（n=6），精密度良好。

2.7 回收率

將加標(biāo)濃度為0.01、0.02、0.05 mg/mL 的雞血漿樣品分別進(jìn)樣3 次，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery rates

由表2 可知，L-肉堿的平均回收率在97.393%～98.703%，表明該前處理方法具有較高的回收率，能更準(zhǔn)確地反映血漿中肉堿的含量。

2.8 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性結(jié)果如表3 所示。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Results of stability

由表3 可知，該方法穩(wěn)定性RSD 為0.056%（n=5），表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.9 樣品分析

采用上述建立的方法對分離的血漿進(jìn)行前處理和分析，測得雞血漿中L-肉堿含量為0.284 mg/mL。

3 討論

3.1 檢測條件的優(yōu)化

L-肉堿的極性較強(qiáng)，在常規(guī)色譜系統(tǒng)中不易保留，但在酸性條件下，L-肉堿可以和離子對試劑反應(yīng)生成離子對，延長在色譜柱上的保留時間，且在波長為210 nm 時，檢測出最大吸收峰[12-13]。本試驗在考察流動相的pH 值對L-肉堿出峰時間的影響時，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，L-肉堿保留時間更長且檢測樣品中L-肉堿峰形良好，這與周文清[9]試驗結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)，改變流動相pH 值能夠改變物質(zhì)出峰時間，改善峰形，防止目標(biāo)峰拖尾。有機(jī)試劑洗脫能力強(qiáng)，在色譜系統(tǒng)中，有機(jī)相比例增大會縮短物質(zhì)保留時間。莫紫梅等[14]在檢測口服液中L-肉堿含量時發(fā)現(xiàn)，L-肉堿的保留時間隨著有機(jī)相比例增大而縮短，與本研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈比例為10%時，L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為11.278 min，當(dāng)乙腈比例為15%時，L-肉堿保留時間為10.039 min，但是在乙腈比例為10%時，檢測不出樣品中L-肉堿峰，乙腈比例為15%時，樣品中L-肉堿峰峰形良好，無雜峰干擾。綜合考慮峰形、物質(zhì)分離度、保留時間等因素，最終選擇流動相條件為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比）。

流速主要影響柱壓和出峰時間，提升流速會使出峰時間提前，整體分析時間變短，但柱壓也會隨之上升，柱壓過高則會導(dǎo)致漏液，并且目標(biāo)峰與雜峰不能很好地分離[15]。本試驗考察0.6 mL/min 和0.7 mL/min流速對L-肉堿出峰時間的影響，分析在不同流速進(jìn)樣時，L-肉堿峰形及出峰時間的區(qū)別。結(jié)果表明，流速變化對分離效果有明顯影響，當(dāng)流速為0.7 mL/min時L-肉堿保留時間為8.708 min，峰形拖尾；流速為0.6 mL/min 時，L-肉堿保留時間為10.094 min，峰形良好。綜合考慮峰形、柱壓和干擾峰等因素，最終選擇流速為0.6 mL/min。

3.2 樣品處理條件優(yōu)化

L-肉堿具有良好的水溶性，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等有機(jī)試劑[16-17]，且甲醇、乙腈具有沉淀蛋白的作用，可在去除雞血漿中蛋白質(zhì)的同時有效提取L-肉堿，但單一試劑提取效果不好[18]，因此本試驗比較了純乙腈和乙腈甲醇（9∶1，體積比）混合液兩種前處理方法，分析不同處理對L-肉堿提取量及峰形的影響。結(jié)果顯示，用純乙腈提取時，L-肉堿提取濃度為0.146 mg/mL，峰形拖尾且與雜峰距離較近；用乙腈甲醇（9∶1，體積比）混合液提取時，L-肉堿提取濃度為0.284 mg/mL，峰形好，能與雜質(zhì)完全分離。樣品處理時間影響檢測樣品數(shù)量，處理時間越短，檢測樣品數(shù)量越多，可大幅提高工作效率。目前提取血漿中L-肉堿的方法多為衍生化處理，步驟繁瑣，分析時間較長。唐笑等[19]在檢測羅非魚血漿中L-肉堿時，經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)后，用衍生試劑反應(yīng)90 min；丁峰等[20]、謝根英等[21]在提取病患血液中L-肉堿時，均采用衍生法進(jìn)行提取，反應(yīng)時間在1.5 h 左右。本試驗處理方法簡便且所用時間較短，綜合考慮提取量、峰形及分析時間，最終選擇樣品用乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）進(jìn)行處理。

4 結(jié)論

采用乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）提取雞血漿中L-肉堿，經(jīng)過色譜條件優(yōu)化，確定流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比），流速為0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量20 μL 的色譜條件，該方法精密度、回收率、穩(wěn)定性高，適合于雞血漿中L-肉堿的檢測。