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復(fù)合凝聚法制備槲皮素微膠囊及其表征

2023-08-12 06:36李丹汪秀妹梁杰劉濤林國(guó)榮陳程
食品研究與開(kāi)發(fā) 2023年15期
關(guān)鍵詞:壁材微膠囊槲皮素

李丹,汪秀妹,梁杰,劉濤,林國(guó)榮,陳程

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 莆田 351100)

槲皮素是一種生物類黃酮,具有抗氧化、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)及心血管和增強(qiáng)免疫力等功效,還可應(yīng)用于多種疾病的防治,是一種作用廣泛的天然膳食化合物[1]。其存在于日常食物和植物中,主要來(lái)源于柑橘類水果、洋蔥、蕎麥、甘藍(lán)、西紅柿、茶以及紅酒等[2]。槲皮素被吸收利用的方式為水解成苷元進(jìn)入腸腔,以糖苷的形式被腸細(xì)胞吸收[3]。然而,槲皮素由于其黏膜通透性低、水溶性低、口服生物利用度低的缺點(diǎn)[4],導(dǎo)致其在食品醫(yī)藥中的廣泛應(yīng)用受到限制。

微膠囊技術(shù)可利用壁材將芯材包埋,以保護(hù)功能性成分免受高酸度、氧壓力、水分等的影響,近年來(lái)在食品、化妝品、制藥工業(yè)的實(shí)際應(yīng)用越來(lái)越廣泛[5]。復(fù)合凝聚法制備微膠囊是兩種高分子溶液在合適的pH值條件下形成相反電荷,從而形成靜電吸引,將芯材分散在壁材溶液中,相反電荷的壁材相互交聯(lián)后,溶解度降低,壁材在芯材附近凝聚形成微膠囊[6]。復(fù)合凝聚法制備微膠囊一般分為四步,一是制備兩種生物聚合物的水溶液,調(diào)節(jié)溶液pH 值高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn);二是將疏水性芯材與生物聚合物的水溶液混合均質(zhì),形成乳液;三是調(diào)節(jié)體系的溫度或者pH 值等因素誘導(dǎo)形成復(fù)合凝聚;四是使用交聯(lián)劑或者高溫固化凝聚體系[7-8]。蛋白質(zhì)-多糖是在食品中運(yùn)用最廣泛的復(fù)合凝聚的壁材[9]。蛋白質(zhì)在低于等電點(diǎn)時(shí)帶正電荷,高于等電點(diǎn)時(shí)帶負(fù)電荷,蛋白質(zhì)與多糖的復(fù)合凝聚通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)與多糖的酸度系數(shù)(ionization constant,pKa)之間,在這個(gè)pH 值范圍內(nèi),當(dāng)存在陽(yáng)離子或陰離子多糖時(shí),帶相反電荷的蛋白質(zhì)和多糖會(huì)發(fā)生靜電吸引,導(dǎo)致形成絡(luò)合物或凝聚物[9]。

在微膠囊的制備過(guò)程中壁材的選擇至關(guān)重要,壁材的性質(zhì)可以影響所得微膠囊的物理、化學(xué)性質(zhì)以及包埋效果[10]。大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)來(lái)源易得,在食品中運(yùn)用廣泛,它是由pI 為6.4 的7S 球蛋白和pI 為4.8 的11S 球蛋白組成,當(dāng)pH 值低于pI時(shí),大豆分離蛋白帶正電荷[11]。明膠(gelatin,G)是一種相對(duì)廉價(jià)的多肽鏈結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),酸法水解明膠的pI 為4.5~6.0,堿法水解明膠的pI 為7~9[12]。果膠(pectin,P)是一種抗氧化性好,生物相容性好的天然帶負(fù)電荷的多糖[13]。阿拉伯膠(gum arabic,GA)是一種兩親性的天然陰離子多糖[14],基于阿拉伯膠的強(qiáng)乳化性和高濃度下的低黏性,明膠-阿拉伯膠是運(yùn)用最廣泛的微膠囊壁材體系[15]。海藻酸鈉(sodium alginate,ALG)因其生物相容性和膠凝性,而具有較高的運(yùn)用價(jià)值,它是帶負(fù)電荷的多糖,pKa 值為3.38~3.65[12]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)能夠通過(guò)催化形成酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng),從而促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖體系共價(jià)鍵的形成,從而達(dá)到固化復(fù)合凝聚體系的目的[16]。

目前已有研究利用殼聚糖-玉米醇溶蛋白[17]、殼聚糖-海藻酸鈉[18]作為復(fù)合凝聚法的壁材包埋槲皮素,但未見(jiàn)以明膠-果膠、明膠-阿拉伯膠、明膠-海藻酸鈉、大豆分離蛋白-果膠、大豆分離蛋白-阿拉伯膠、大豆分離蛋白-果膠包埋槲皮素進(jìn)行對(duì)比的研究。本文采用復(fù)合凝聚法將SPI、G 兩種優(yōu)質(zhì)蛋白分別結(jié)合P、GA和ALG 3 種多糖制成6 種不同微膠囊壁材包埋槲皮素,在TGase 的作用下固化微膠囊體系,將槲皮素包埋。通過(guò)對(duì)槲皮素微膠囊微觀結(jié)構(gòu)、產(chǎn)率、包埋率、化學(xué)鍵變化、晶體結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性等進(jìn)行比較,篩選出包埋槲皮素的較佳壁材。對(duì)產(chǎn)率最高的微膠囊的胃腸液釋放趨勢(shì)及貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行分析,以期為擴(kuò)大復(fù)合凝聚法制備槲皮素在食品醫(yī)藥輸送體系中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠(食品級(jí)):商水縣富源明膠有限公司;大豆分離蛋白(食品級(jí)):臨沂山松生物制品有限公司;阿拉伯膠(食品級(jí)):天津?yàn)I海捷成專類化工有限公司;海藻酸鈉(食品級(jí)):連云港天天海藻工業(yè)有限公司;果膠(分析純):北京索萊寶科技有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(120 U/g):泰興市東圣生物科技有限公司;單甘酯(食品級(jí)):佳力士添加劑(海安)有限公司;槲皮素(分析純):阿拉丁生物科技有限公司;槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.5%):合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;甲醇(色譜純):薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市予華儀器有限公司;FJ-200 高速分散均質(zhì)機(jī):上海標(biāo)本模型廠;KQ-600KDE 高功率超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;H1850R 醫(yī)用離心機(jī):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;TENSOR Ⅱ傅里葉紅外光譜儀:德國(guó)布魯克公司;SU8010 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:日本日立公司;XRD-6100 X 射線衍射儀:日本島津公司;SDT650 熱重分析儀:美國(guó)沃特斯公司;LC1100 高效液相色譜儀:美國(guó)安捷倫公司。

1.3 微膠囊的制備

1.3.1 復(fù)合凝聚壁材最佳配比及最適pH 值的確定

蛋白質(zhì)-多糖的混合比例是兩種生物聚合物由靜電作用產(chǎn)生相分離的重要參數(shù),pH 值影響蛋白質(zhì)所帶電荷的屬性,從而控制蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合凝聚物的形成[9]。G-P、G-GA 和G-ALG 復(fù)合凝聚的最佳配比和最適pH 值的選擇參考文獻(xiàn)[19-21]的方法。SPI-P、SPIGA 和SPI-ALG 復(fù)合凝聚的最佳配比及最適pH 值的選擇參考文獻(xiàn)[22-24]的方法。6 種組合壁材最佳配比及復(fù)合凝聚最適pH 值見(jiàn)表1。

1.3.2 復(fù)聚物的制備

參照Dong 等[25]的方法并加以修改,分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白質(zhì)溶液和多糖溶液,并將蛋白質(zhì)及多糖溶液的pH 值調(diào)整為7,以便于后續(xù)試驗(yàn)操作中調(diào)整反應(yīng)體系的pH 值。將制好的1%蛋白質(zhì)溶液及多糖溶液按表1 中的配比混勻并調(diào)整pH 值。混合溶液在45 ℃下以640 r/min 攪拌反應(yīng)20 min。冷水浴降溫至30 ℃后置于冰水浴冷卻至15 ℃以下,保持30 min。將混合溶液pH 值調(diào)整為6,放入4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置24 h,使復(fù)聚物沉淀分層。4 200 r/min 離心15 min、抽濾,將沉淀放入-80 ℃預(yù)先冷凍12 h,再使用真空冷凍干燥機(jī)凍干,得復(fù)聚物成品。

1.3.3 槲皮素微膠囊的制備

參考廖霞等[18]的工藝流程并稍作修改。蛋白質(zhì)+乳化劑→混合→加槲皮素→高速剪切乳化→加多糖→反應(yīng)→固化→冷凍干燥→成品。

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白質(zhì)溶液和多糖溶液,并將蛋白質(zhì)溶液及多糖溶液的pH 值調(diào)整為7。3 倍蛋白質(zhì)質(zhì)量的單甘酯按單甘脂∶去離子水為1∶20(g/mL)于60°C 去離子水中充分溶解,然后將單甘酯溶液加入1%蛋白質(zhì)溶液中,640 r/min 攪拌20 min,使蛋白質(zhì)溶液與單甘酯充分混合。以芯壁質(zhì)量比1∶1 加入槲皮素,640 r/min 攪拌20 min,使蛋白質(zhì)與芯材初步混勻,再轉(zhuǎn)入10 000 r/min 均質(zhì)機(jī)下高速剪切4 min,使蛋白質(zhì)與槲皮素充分結(jié)合,完成乳化。1%多糖溶液按比例加入混合乳化液中,調(diào)整為最適pH 值,640 r/min 攪拌20 min,進(jìn)行復(fù)合凝聚。冷水浴降溫至30 ℃后置于冰水浴冷卻至15 ℃以下,保持30 min。將混合溶液pH 值調(diào)整為6。加入1/4 蛋白質(zhì)質(zhì)量的TGase 作為固化劑,放入4 ℃冰箱24 h,4 200 r/min 離心15 min、抽濾,于-80 ℃預(yù)先冷凍12 h,再使用真空冷凍干燥機(jī)凍干,得微膠囊成品。

1.4 微膠囊的表征

1.4.1 微膠囊光學(xué)顯微鏡觀察

以400 倍的放大倍數(shù)初步觀察6 種槲皮素微膠囊濕囊的形態(tài)特征。

1.4.2 微膠囊掃描電子顯微鏡觀察

使用導(dǎo)電膠粘取少量待測(cè)樣品粉末并固定在掃描電子顯微鏡載物臺(tái)上,對(duì)載物臺(tái)上的樣品表層進(jìn)行噴金處理。加速電壓設(shè)置為3.0 kV,觀察槲皮素及槲皮素微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.3 微膠囊中槲皮素產(chǎn)率及包埋率測(cè)定

制備完成的6 種槲皮素微膠囊采用高效液相色譜法分別測(cè)定微膠囊中總槲皮素含量以及微膠囊表面槲皮素含量,以此來(lái)計(jì)算復(fù)合凝聚微膠囊的產(chǎn)率及包埋率。流動(dòng)相中的有機(jī)相和水相分別采用甲醇溶液和0.1%磷酸溶液,兩相配比為6∶4,樣品注射體積為20 μL,洗脫速度設(shè)置為1.0 mL/min,柱溫設(shè)置為28 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為374 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:制備100.0、75.0、50.0、25.0、10.0、5.0 μg/mL 的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品,各梯度溶液中槲皮素含量使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),檢測(cè)峰面積為縱坐標(biāo)(y)作圖。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=56.105x-3.441 9,R2=0.999 9。

準(zhǔn)確稱取0.5 g 的微膠囊粉末溶解于50 mL 甲醇溶液,在25 ℃、360 W 功率下超聲破碎30 min 破壞微膠囊結(jié)構(gòu),以提取微膠囊中總包埋的槲皮素。再使用醫(yī)用離心機(jī)對(duì)提取液進(jìn)行離心(4 ℃、10 000 r/min、10 min),收集上清液。

采用Morselli 等[26]研究的方法并加以修改,測(cè)定微膠囊表面槲皮素的含量。槲皮素微膠囊的產(chǎn)率及包埋率的計(jì)算公式如下。

式中:Y 為產(chǎn)率,%;E 為包埋率,%;Z 為總槲皮素含量,μg/mL;S 為微膠囊表面槲皮素含量,μg/mL;B 為微膠囊引入的槲皮素量,μg/mL。

1.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將槲皮素、壁材、復(fù)聚物以及槲皮素微膠囊進(jìn)行紅外光譜掃描。掃描范圍:4 000~400 cm-1;樣品掃描時(shí)間22 s;分辨率15 cm-1。

1.4.5 X 射線衍射(X-ray diffraction,XRD)分析

將待測(cè)樣品平鋪于XRD 樣品板,使用X 射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描,分析槲皮素、壁材、復(fù)聚物以及槲皮素微膠囊的結(jié)晶度。2θ 衍射角范圍:5°~50°;掃描速度:2°/min。

1.4.6 熱重分析

在剛玉坩堝中稱量10 mg 待測(cè)樣品,然后使用熱重分析儀對(duì)槲皮素微膠囊的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析,繪制其加熱釋放曲線。熱范圍為25~500 ℃,以氮?dú)鉃榇祾邭猓魉僭O(shè)置為20 mL/min,加熱速率10°C/min。

1.4.7 微膠囊體外模擬消化

參考Li 等[23]的方法制備模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)。SGF 和SIF 中的槲皮素釋放率的計(jì)算公式如下。

式中:R1為SGF 階段槲皮素釋放率,%;R2為SIF階段槲皮素釋放率,%;Q1為模擬胃消化結(jié)束時(shí)釋放的槲皮素含量,μg/mL;Q0為微膠囊加載的槲皮素總量,μg/mL;Qt為t 時(shí)釋放的槲皮素量,μg/mL;Q2為腸消化結(jié)束時(shí)槲皮素含量,μg/mL。

1.4.8 G-GA 微膠囊貯藏穩(wěn)定性

在4、25、45 ℃3 個(gè)溫度條件下分別放置槲皮素和G-GA 槲皮素微膠囊。避光貯藏30 d,每隔5 d 對(duì)槲皮素及G-GA 槲皮素微膠囊分別取樣,采用1.4.3 的方法計(jì)算槲皮素的保留率R,計(jì)算公式如下。并以阿夫拉米(Avrami)公式(6)對(duì)槲皮素微膠囊的釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。

對(duì)公式兩邊取對(duì)數(shù)可得:

式中:Q 為第n 天槲皮素含量,μg/mL;q 為第0 天槲皮素含量,μg/mL;R 為槲皮素在釋放后的保留率,%;k 為釋放速率常數(shù);n 為釋放機(jī)理參數(shù);t 為微膠囊貯藏時(shí)間,h。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各組試驗(yàn)樣品平行測(cè)試3 次,使用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)初步整理計(jì)算,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,利用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊顯微鏡觀察結(jié)果

為了初步觀察微膠囊是否形成,采用顯微鏡觀察微膠囊濕囊的形態(tài)。6 種壁材制成的微膠囊顯微鏡圖見(jiàn)圖1。

圖1 6 種不同壁材包埋的槲皮素微膠囊顯微鏡圖(×400)Fig.1 Images of quercetin microcapsules embedded with 6 different wall material combinations(×400)

由圖1 可知,微膠囊在顯微鏡下呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu),微膠囊在顯微鏡下的不同形態(tài)可能與壁材的差異性有關(guān)。

2.2 微膠囊的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

槲皮素及槲皮素微膠囊掃描電鏡圖見(jiàn)圖2。

圖2 槲皮素及微膠囊掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy images of quercetin and microcapsules

由圖2a 可以看出,槲皮素的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)集束狀的針形晶體結(jié)構(gòu),分布雜亂無(wú)序。由圖2b~g 可以看出,槲皮素微膠囊大多呈現(xiàn)橢球形和不規(guī)則的棱柱形結(jié)構(gòu),微膠囊結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)明顯的槲皮素針狀晶體結(jié)構(gòu),表明槲皮素被成功包埋,其中以G-GA 微膠囊的表面最為平整光滑。

2.3 微膠囊中槲皮素包埋率及產(chǎn)率結(jié)果

6 種槲皮素微膠囊的產(chǎn)率及包埋率見(jiàn)表2。

表2 6 種槲皮素微膠囊的產(chǎn)率及包埋率Table 2 Yields and embedding rates of six quercetin microcapsules %

由表2 可知,同種多糖作為復(fù)合凝聚一種壁材的條件下,以明膠作為蛋白質(zhì)壁材的微膠囊產(chǎn)率要高于以大豆分離蛋白作為壁材的微膠囊,其中產(chǎn)率及包埋率最高的為G-GA 微膠囊,分別為(63.76±0.51)%和(66.98±0.38)%。槲皮素較低的產(chǎn)率及包埋率推測(cè)是槲皮素的疏水性及化學(xué)不穩(wěn)定性導(dǎo)致的。在微膠囊制作過(guò)程中,由于均質(zhì)、超聲乳化等步驟也會(huì)導(dǎo)致槲皮素分解損失。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

通過(guò)傅里葉紅外光譜的掃描分析,可以測(cè)定出物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及其具有的特征化學(xué)鍵[27]。槲皮素及壁材、復(fù)聚物、6 種微膠囊的紅外光譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 槲皮素及壁材、6 種復(fù)聚物、6 種微膠囊的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of quercetin and wall materials,six wall material combinations,and six microcapsules

對(duì)比圖3a 和圖3b 的壁材及相應(yīng)的復(fù)聚物紅外圖譜,可以看出復(fù)聚物的紅外光譜相較于壁材并沒(méi)有產(chǎn)生新的特征峰,類似于蛋白質(zhì)與多糖圖譜的簡(jiǎn)單疊加,但有部分吸收峰位置和強(qiáng)度發(fā)生了變化。明膠和大豆分離蛋白的譜帶在相應(yīng)的復(fù)聚物中的紅外光譜圖中均發(fā)生了藍(lán)移,證明復(fù)聚物的形成是由于發(fā)生了靜電相互作用。以明膠和大豆分離蛋白作為蛋白質(zhì)壁材的復(fù)聚物分別在3 273 cm-1和3 293 cm-1附近出現(xiàn)寬峰,是羥基的—OH 伸縮振動(dòng),表明復(fù)聚物由于羥基的—OH 發(fā)生締合作用形成氫鍵,且明膠相較于大豆分離蛋白作為蛋白質(zhì)壁材在形成復(fù)聚物的過(guò)程中氫鍵作用更強(qiáng)。

根據(jù)圖3c 可以看出,槲皮素微膠囊與圖3a 中槲皮素的紅外光譜的特征峰相似,表明微膠囊中含有槲皮素物質(zhì)。由圖3c 可以看出,包埋的槲皮素的酚羥基的伸縮振動(dòng)從3 275 cm-1向3 280~3 297 cm-1移動(dòng),表明壁材與槲皮素之間通過(guò)氫鍵相互作用結(jié)合。微膠囊的紅外光譜中從1 048~1 654 cm-1范圍內(nèi)也可觀察到與芳香族化合物的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)有關(guān)的吸收峰,這表明槲皮素可能通過(guò)疏水相互作用和氫鍵等化學(xué)作用包埋在微膠囊中,而不是簡(jiǎn)單的物理混合[28]。

2.5 X 射線衍射分析

X 射線衍射是研究晶體三維結(jié)構(gòu)和分子特性之間關(guān)系的一種重要分析手段,因此X 射線在多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子的晶體結(jié)構(gòu)分析等方面具有廣泛的應(yīng)用[29]。槲皮素及壁材、6 種復(fù)聚物、6 種微膠囊的XRD光譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 槲皮素及壁材、6 種復(fù)聚物、6 種微膠囊的XRD 光譜圖Fig.4 XRD spectra of quercetin and wall materials,six wall material combinations,and six microcapsules

由圖4a 可知,5 種壁材中阿拉伯膠、大豆分離蛋白和果膠在2θ=20°處出現(xiàn)1 個(gè)寬峰,此處為無(wú)定形處,物質(zhì)的特征峰在此處越寬,表明物質(zhì)的無(wú)定形程度越高[30],大豆分離蛋白還在43.91°出現(xiàn)尖峰,海藻酸鈉在31.50°和45.26°出現(xiàn)尖峰,這說(shuō)明大豆分離蛋白和海藻酸鈉晶體強(qiáng)度較低。果膠在2.0°~40.28°多處出現(xiàn)尖峰,槲皮素在10.54°~43.96°出現(xiàn)多個(gè)特征結(jié)晶峰,表明其結(jié)晶程度高。

由圖4b 可知,6 種復(fù)聚物中除G-P 復(fù)聚物在37.66°和43.91°兩處出現(xiàn)尖峰外,均在2θ=20°附近形成了1 個(gè)寬峰,結(jié)果表明,多糖分子鏈被蛋白質(zhì)分子緊密吸收,導(dǎo)致分子間相互作用(靜電吸引和氫鍵)在蛋白質(zhì)和多糖之間形成非晶態(tài)復(fù)合物,這與紅外光譜分析結(jié)果一致。此外,G-GA 復(fù)聚物形成的形狀平緩且峰形較寬,表明其晶體強(qiáng)度低,其包埋槲皮素的能力要高于其他5 種復(fù)聚物。

對(duì)比圖4c 以及圖4a 中的槲皮素曲線,可以看出6 種微膠囊在2θ=20°均形成寬峰,表明微膠囊呈現(xiàn)無(wú)定形結(jié)構(gòu),微膠囊的結(jié)晶度相較于槲皮素有了明顯的降低,說(shuō)明槲皮素成功被微膠囊所包埋。但微膠囊的峰形相較于復(fù)聚物更陡峭和尖銳,說(shuō)明微膠囊包埋槲皮素后,體系的晶體強(qiáng)度增大,這從側(cè)面印證了槲皮素成功被微膠囊包埋。

2.6 熱重分析

熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA)是可以反應(yīng)一定溫度條件下,測(cè)量樣品的質(zhì)量與溫度變化關(guān)系的曲線。而微商熱重分析曲線(differential thermogravimetric analysis,DTG)是記錄隨溫度變化而導(dǎo)致質(zhì)量損失的劇烈程度的曲線,DTG 曲線的峰值點(diǎn)對(duì)應(yīng)TGA 曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn),能夠準(zhǔn)確反映不同階段質(zhì)量損失的劇烈程度。TGA 與DTG 曲線的結(jié)合分析,能夠在一定程度上闡釋物質(zhì)的熱穩(wěn)定性及熱分解特性[30]。6 種槲皮素微膠囊的熱重分析曲線及相應(yīng)的一階微分曲線見(jiàn)圖5。

圖5 6 種微膠囊的熱重分析曲線和一階微分曲線Fig.5 Thermogravimetric curves and first-order differential curves of six microcapsules

由圖5 可知,在加熱至100 ℃左右時(shí),微膠囊樣品均出現(xiàn)了不同程度的水分蒸發(fā),根據(jù)DTG 曲線吸熱峰可知SPI-ALG 微膠囊水分損失最為劇烈,而G-GA 微膠囊水分損失程度最小。隨著溫度繼續(xù)升高,在100~300 ℃時(shí),微膠囊樣品開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的分解,其中G-GA 微膠囊的熱穩(wěn)定性最好,分解程度最低。當(dāng)溫度超過(guò)300 ℃后,3 種以明膠為壁材的微膠囊樣品均發(fā)生劇烈分解,形成DTG 曲線中最陡的倒峰,其中GGA 微膠囊的倒峰緩于G-P 微膠囊及G-ALG 微膠囊。3 種以大豆分離蛋白作為壁材的微膠囊,則在300 ℃和400 ℃兩處產(chǎn)生較為劇烈的分解。這表明明膠的熱穩(wěn)定性要優(yōu)于大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性,而以明膠為壁材的微膠囊中,G-GA 微膠囊的熱穩(wěn)定性最好。

2.7 G-GA 微膠囊體外模擬消化分析

G-GA 槲皮素微膠囊體外胃腸液模擬消化槲皮素的釋放曲線見(jiàn)圖6。

圖6 G-GA 槲皮素微膠囊體外胃腸液模擬消化槲皮素的釋放曲線Fig.6 Release curve of G-GA quercetin microcapsules after simulated digestion in gastrointestinal fluid in vitro

由圖6 可知,0~2 h 的胃液消化過(guò)程中,槲皮素釋放緩慢且釋放程度低,胃液消化2 h 后的槲皮素釋放率為9.01%,這表明G-GA 槲皮素微膠囊在低pH 值下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,槲皮素保留率高。胃液消化2 h 后轉(zhuǎn)移進(jìn)腸液環(huán)境消化,出現(xiàn)槲皮素突釋現(xiàn)象,轉(zhuǎn)移到腸液環(huán)境消化1 h 后,槲皮素釋放率達(dá)(39.32±2.62)%。在腸液環(huán)境消化的4 h 后,槲皮素釋放率達(dá)(68.69±1.38)%,而6~8 h 的釋放速率逐漸趨于平緩,最終體外胃腸液8 h 釋放率為(73.39±3.75)%。結(jié)果表明,G-GA 槲皮素微膠囊在胃液消化環(huán)境有著較高的穩(wěn)定性,而在腸液消化環(huán)境中則有著較高的釋放率。槲皮素微膠囊在胃液環(huán)境中的低釋放率是由于壁材的復(fù)合凝聚過(guò)程在酸性環(huán)境下進(jìn)行,蛋白質(zhì)與多糖通過(guò)靜電相互作用結(jié)合,故在酸性環(huán)境下能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。當(dāng)轉(zhuǎn)入堿性環(huán)境時(shí),蛋白質(zhì)和多糖之間的靜電相互作用被破壞,同時(shí)蛋白質(zhì)被胰蛋白酶水解,復(fù)合凝聚層遭到破壞,槲皮素快速釋放。但是由于蛋白質(zhì)中含有不同的帶電粒子區(qū)域,蛋白質(zhì)和多糖之間的靜電相互作用并不是在同一時(shí)間被破壞,局部區(qū)域中仍有靜電相互作用存在,因而微膠囊的復(fù)合凝聚層并不是突然破壞的,而是呈現(xiàn)出階梯釋放的效果[31]。

2.8 G-GA 微膠囊貯藏穩(wěn)定性分析

溫度對(duì)槲皮素和G-GA 的微膠囊貯藏穩(wěn)定性影響見(jiàn)圖7。

圖7 溫度對(duì)槲皮素和G-GA 微膠囊貯藏穩(wěn)定性的影響和微膠囊的釋放動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 Effect of temperature on storage stability of quercetin and G-GA microcapsules and release kinetics curve of microcapsules

由圖7 可知,槲皮素及G-GA 微膠囊的保留率均隨溫度的增加和貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在貯藏30 d后,在4 ℃貯藏條件下槲皮素和G-GA 微膠囊的保留率分別為(93.59±0.24)%和(97.36±0.27)%;在25 ℃貯藏條件下,槲皮素及G-GA 微膠囊穩(wěn)定性均有不同程度的降低,但總體損失較少,貯藏30 d 后的保留率分別為(92.13±0.19)%和(96.70±0.17)%。當(dāng)貯藏溫度為45 ℃的較高溫度時(shí),高溫促使槲皮素的分子活化能增強(qiáng),分子熱運(yùn)動(dòng)加快[32],以及微膠囊壁材形成的膜壁空隙增大,槲皮素?fù)p失速率加快,導(dǎo)致槲皮素及G-GA微膠囊的保留率均產(chǎn)生了較大程度的下降。結(jié)果表明,微膠囊結(jié)構(gòu)對(duì)槲皮素具有保護(hù)作用,能夠延緩槲皮素的損失,并且槲皮素應(yīng)避免貯藏于高溫環(huán)境。

不同溫度下的槲皮素微膠囊釋放機(jī)理參數(shù)及釋放速率常數(shù)見(jiàn)表3。

表3 不同溫度下的微膠囊釋放機(jī)理參數(shù)及釋放速率常數(shù)Table 3 Release parameters and release rate constants of microcapsules at different temperatures

由表3 可知,G-GA 微膠囊在各溫度下各回歸方程的R2均在0.93 以上,與Avrami 公式較吻合,可解釋核心材料的釋放規(guī)律。釋放機(jī)理參數(shù)n 為0.54 代表擴(kuò)散限制動(dòng)力學(xué),n 為1 時(shí)代表一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[33]。G-GA微膠囊在貯藏溫度為4、25、45 ℃下釋放機(jī)理參數(shù)n 分別為1.715 0、1.506 0 和1.665 4,均大于1,表明G-GA微膠囊的釋放不再屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。同時(shí),45 ℃相較于4 ℃貯藏溫度下G-GA 微膠囊的釋放速率常數(shù)k 有較高提升,說(shuō)明低溫貯藏(4 ℃)同樣能夠有效緩解槲皮素微膠囊中槲皮素的損失。

3 結(jié)論

傅里葉紅外光譜和X 射線衍射結(jié)果表明,槲皮素成功被微膠囊化,槲皮素由結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形態(tài)且被復(fù)合凝聚的壁材所包裹。微膠囊的產(chǎn)率及包埋率結(jié)果表明G-GA 作為壁材為較適于包埋槲皮素的方案。熱重分析結(jié)果表明,槲皮素微膠囊有較好的熱穩(wěn)定性,其中G-GA 槲皮素微膠囊的熱穩(wěn)定性最佳。槲皮素微膠囊呈現(xiàn)球形、橢球形,徑粒大小普遍較為均一,槲皮素被膜結(jié)構(gòu)包裹于球形結(jié)構(gòu)中。體外胃腸液模擬消化結(jié)果表明,G-GA 槲皮素微膠囊在胃液環(huán)境中能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在腸液環(huán)境中能緩慢釋放,大大提高了槲皮素的生物利用率。微膠囊貯藏試驗(yàn)結(jié)果表明,G-GA槲皮素微膠囊能有效提高槲皮素在室溫儲(chǔ)存環(huán)境中的保留率。

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