趙紫汐 王司琪 李雪研，3 徐春雪 趙 曦 楊 蓓△

（中國醫(yī)科大學(xué)，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2 2019級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，3 2017級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)，沈陽 110122）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)病原因主要有2 個(gè)方面，胰島β 細(xì)胞損傷和胰島素抵抗，其中β 細(xì)胞損傷是2 型糖尿病發(fā)病的決定因素，因此研究保護(hù)和恢復(fù)胰島β 細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能成為防治2 型糖尿病的關(guān)鍵。氧化應(yīng)激是2 型糖尿病胰島β 細(xì)胞損傷的致病機(jī)制之一。Nrf2/ARE 途徑是細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的重要的信號(hào)通路。課題組前期研究表明，砷暴露能夠誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞內(nèi)核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/ARE 信號(hào)通路活化，抵御急性氧化應(yīng)激損傷。富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF，商品名為Tecfidera），是一款可以口服治療多發(fā)性硬化癥的新藥。近年來研究表明DMF 除多發(fā)性硬化癥以外，還對(duì)多種疾病具有治療潛力。DMF 是Nrf2 激動(dòng)劑，因此本研究以小鼠胰島β 細(xì)胞株MIN6 為研究對(duì)象，探討DMF 在亞砷酸鈉誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制，旨為砷致2 型糖尿病的預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

小鼠胰島β 細(xì)胞株MIN6 由中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院贈(zèng)送。DMEM、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（Invitrogen 公司）；胎牛血清（Procell 公司），β-巰基乙醇、DMF、亞砷酸鈉、二甲基亞砜、Triton X-100、多聚甲醛、TRIzol（Sigma 公司）；MTT 試劑盒（Promega 公司）；ROS 檢測(cè)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、含DAPI 封片劑（碧云天公司）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（Thermo 公司）；Nrf2 抗體、GAPDH 抗體（Santa Cruz 公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（武漢三鷹公司）；Alexa Fluor 594 標(biāo)記的驢抗兔二抗（Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與染毒

將MIN6 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，采用含5 μL/L β-巰基乙醇、15 %胎牛血清、50 μg/mL 青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，于5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)DMF 最適處理濃度篩選結(jié)果，將MIN6 細(xì)胞隨機(jī)分為4 組：正常對(duì)照組、4 μmol/L NaAsO2組、25 μmol/L DMF 預(yù)處理+4 μmol/L NaAsO2組、50 μmol/L DMF 預(yù)處理+ 4 μmol/L NaAsO2組。

1.3 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活性

將MIN6 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h 后，按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為24 h，然后加入含MTT液的無血清培養(yǎng)基，避光孵育3 h，棄上清，加入二甲基亞砜，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值，波長為490 nm。

1.4 TUNEL 熒光染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡

將MIN6 細(xì)胞接種于6 孔板中的蓋玻片上，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h 后，按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為24 h，使用4 %多聚甲醛1 h，再加入0.2 % Triton X-100 處理5 min，H2O2封閉10 min，PBS 漂洗，滴加50 μL TUNEL反應(yīng)緩沖液，避光孵育1 h，含DAPI 封片劑封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，并拍照，以TUNEL 反應(yīng)陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 DCFH-DA 熒光探針法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS 水平

將MIN6 細(xì)胞接種于6 孔板中的蓋玻片上，5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h 后，按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為6 h，加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA，避光孵育30 min，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察及照相，Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

1.6 免疫細(xì)胞熒光法觀察細(xì)胞內(nèi)Nrf2 定位表達(dá)

將MIN6 細(xì)胞接種于6 孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為6 h，4 %多聚甲醛固定1 h，0.2%Triton X-100 處理5 min，PBS 漂洗3 次，兔抗小鼠Nrf2 一抗（1∶500）4 ℃ 孵育過夜，Alexa Fluor 594 標(biāo)記的驢抗兔二抗（1∶1 000）避光孵育1 h，洗滌，含DAPI 封片劑封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，并拍照。

1.7 免疫印跡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Nrf2 蛋白表達(dá)水平

將MIN6 細(xì)胞按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為6 h 后，胰蛋白酶消化后收集、裂解、離心、提取上清液。BCA 方法測(cè)定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：Nrf2（1∶500）、GAPDH（1∶1 000），4℃ 過夜，山羊抗兔二抗（1∶1 000）、山羊抗小鼠（1∶1000）二抗孵育，發(fā)光顯色，使用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以Nrf2 與內(nèi)參GAPDH 的蛋白條帶平均灰度值的比值表示Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。

1.8 Real-time RT-PCR 測(cè)定目的基因mRNA 表達(dá)水平

按細(xì)胞分組進(jìn)行染毒處理，其中25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理時(shí)間為6 h，4 μmol/L NaAsO2處理時(shí)間為6 h，每組細(xì)胞加入1 mL TRIzol 試劑與200 μL的三氯甲烷，離心后提取上清液加入同體積的異丙醇，再次離心后使用得到RNA 沉淀，使用75%乙醇溶液清洗3 遍后加入DEPC 水溶解得到細(xì)胞總RNA。使用TaKaRa 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒合成cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，采用 β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照，最終以2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Nrf2 上游引物序列為5′-CCCATTTGTAGATGACCATGAG-3′，下游引物序列為5′-CCATGTCCTGCTCTATGCTG-3′；Ho-1 上游引物序列為5′-ACAGAGGAACACAAAG ACCAG-3′，下游引物序列為5′-GTGTCTGGGAT GAGCTAGTG -3′；Trx1 上游引物序列為5′-GCTTG TCGTGGTGGACTTCTCTG-3′，下游引物序列為5′-CAGCAACATCCTGGCAGTCATCC-3′；Gclc 上游引物序列為5′- ACCATCACTTCATTCCCCAG-3′，下游引物序列為5′-TTCTTGTTAGAGTACCGAA GCG-3′；Gclm 上游引物序列為5′-AATCAGCCCCG ATTTAGTCAG-3′，下游引物序列為5′-CGATCCTA CAATGAACAGTTTTGC-3′；β-actin 上游引物序列為5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3′，β-actin 下游引物序列為5′-AGGAGGAGCAATGATCTTGATC TT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism 8 進(jìn)行結(jié)果分析。多組間單個(gè)變量比較應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIN6 細(xì)胞活性比較

應(yīng)用10、25、50、100、200、400 μmol/L DMF處理MIN6 細(xì)胞24 h，與正常對(duì)照組比較，10、25、50 μmol/L DMF 處理對(duì)細(xì)胞活性未見明顯影響（圖1A）。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇25 μmol/L 和50 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DMF 的預(yù)處理濃度。

圖1 MIN6 細(xì)胞活性

應(yīng)用25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理MIN6 細(xì)胞6 h，再經(jīng)4 μmol/L NaAsO2處理24 h。MTT 結(jié)果顯示，與NaAsO2組比較，DMF 預(yù)處理可以顯著提升MIN6 細(xì)胞的活性，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。

2.2 MIN6 細(xì)胞凋亡水平比較

與正常對(duì)照組比較，NaAsO2組中綠色凋亡熒光信號(hào)數(shù)量顯著增多，并與藍(lán)色DAPI 熒光共定位于細(xì)胞核，融合為藍(lán)綠色熒光；經(jīng)25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理干預(yù)后，可以顯著減少綠色凋亡熒光信號(hào)數(shù)量，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A、2B）。

圖2 MIN6 細(xì)胞凋亡情況。A～D：各組TUNEL（A1～D1）、DAPI（A2～D2）和Merge（A3～D3）熒光染色圖片，標(biāo)尺=10 μm。A：正常對(duì)照組；B：NaAsO2 組；C：低劑量DMF 組；D：高劑量DMF 組；E：各組MIN6 細(xì)胞凋亡率分析。*P＜0.05 vs 正常對(duì)照組；#P＜0.05 vs NaAsO2 組；△P＜0.05 vs 低劑量DMF 組.

2.3 MIN6 細(xì)胞ROS 水平比較

NaAsO2組中代表ROS的DCF綠色熒光強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組；與NaAsO2組比較，DMF預(yù)處理組DCF綠色熒光強(qiáng)度顯著降低，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A、3B）。

圖3 MIN6 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量情況。各組DCFH-DA 熒光探針染色圖片。A：正常對(duì)照組；B：NaAsO2 組；C：低劑量DMF 組；D：高劑量DMF 組。標(biāo)尺=10 μm。E：各組MIN6 細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光強(qiáng)度比值分析。*P＜0.05 vs 正常對(duì)照組；#P＜0.05 vs NaAsO2 組；△P＜0.05 vs 低劑量DMF 組.

2.4 MIN6 細(xì)胞Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，MIN6 細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L NaAsO2染毒6 h 后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增多。經(jīng)25、50 μmol/L DMF 預(yù)處理6 h 后，再經(jīng)4 μmol/L NaAsO2作用6 h 后，細(xì)胞內(nèi)mRNA和Nrf2 蛋白表達(dá)顯著高于NaAsO2組，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A、4B、4C）。

圖4 MIN6 細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)情況

2.5 MIN6 細(xì)胞Nrf2 蛋白定位表達(dá)情況比較

正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光弱，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。經(jīng)NaAsO2處理后，細(xì)胞內(nèi)的Nrf2 紅色熒光增強(qiáng)，并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，主要定位于細(xì)胞核中。DMF 的預(yù)先干預(yù)后，再經(jīng)NaAsO2處理，可見細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2 紅色熒光進(jìn)一步增強(qiáng)（圖5）。

圖5 MIN6 細(xì)胞內(nèi)Nrf2 蛋白定位表達(dá)情況。標(biāo)尺=10 μm。A1～D1：Nrf2 表達(dá)；A2～D2：DAPI 染色；A3～D3：合并。A：正常對(duì)照組；B：NaAsO2 組；C：低劑量DMF 組；D：高劑量DMF 組.

2.6 MIN6 細(xì)胞Ho-1、Trx1、Gclc、Gclm mRNA 表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，NaAsO2組MIN6細(xì)胞內(nèi)Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm mRNA表達(dá)顯著提升；25、50 μmol/L DMF預(yù)處理組MIN6細(xì)胞Ho-1、Trx1、Gclc、Gclm mRNA表達(dá)水平明顯高于NaAsO2組，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 各組Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm mRNA 表達(dá)水平

3 討論

砷是一種類金屬元素，位于化學(xué)元素周期表第四周期第VA 族，廣泛分布在大氣、水和陸地等自然環(huán)境中，以無機(jī)砷和有機(jī)砷2 種形式存在，其中無機(jī)砷為劇毒。人類可以通過飲用受污染的水、食用受污染的食品、吸煙、工業(yè)加工等多種途徑接觸到無機(jī)砷。砷是世界衛(wèi)生組織列出的引起重大公共衛(wèi)生關(guān)注的10 種化學(xué)品之一，目前全球約有3 億人處于高砷暴露的威脅中[1-2]。長期接觸無機(jī)砷，可導(dǎo)致慢性砷中毒。流行病學(xué)研究顯示，無機(jī)砷在飲用水中的濃度＞50 μg/L 時(shí)，無機(jī)砷暴露與2 型糖尿病[3]、高血壓[4]、心血管疾病[5]，甚至癌癥[6]等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

胰腺內(nèi)分泌部又稱胰島，是由十多個(gè)到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的內(nèi)分泌細(xì)胞團(tuán)，分布于胰腺外分泌部的小葉內(nèi)。胰島中含有A、B、D、PP、D1 等細(xì)胞，其中B 細(xì)胞又稱β 細(xì)胞，約占胰島細(xì)胞總數(shù)的70%，主要功能為合成和分泌胰島素。胰島素是體內(nèi)唯一的一種降血糖的激素，因此胰島β 細(xì)胞損傷引發(fā)胰島素合成或分泌障礙就會(huì)導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。氧化應(yīng)激是砷中毒最重要的發(fā)病機(jī)制之一[7-8]。Nrf2 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的核心調(diào)控者，在機(jī)體各種組織、器官幾乎均有表達(dá)。生理狀態(tài)下，Nrf2 與抑制蛋白Keap1 偶連錨定在胞漿，當(dāng)受到親電子化合物或氧化物攻擊時(shí)，Nrf2 與Keap1 解偶連，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與目的基因5’端抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，AREs）結(jié)合，增加其調(diào)控的抗氧化基因的表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化的能力[9-10]。Pi 等[11]在永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中首次發(fā)現(xiàn)砷暴露能夠在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上增加Nrf2 的表達(dá)，提高Nrf2 相關(guān)基因的表達(dá)。本課題組前期的研究結(jié)果也已證實(shí)，亞砷酸鈉暴露能夠誘導(dǎo)小鼠胰島MIN6 細(xì)胞內(nèi)Nrf2/ARE 通路的活化，并利用Nrf2 基因沉默的MIN6 細(xì)胞證實(shí)Nrf2/ARE通路的激活在亞砷酸鈉誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[12-14]。

DMF 商品名為Tecfidera，2013 年被美食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，列入臨床用藥，用于治療復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化[15]。2021 年正式獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市[16]。近來，隨著藥物研究的深入，發(fā)現(xiàn)DMF 除多發(fā)性硬化癥以外，還對(duì)多種疾病具有治療潛力，例如DMF 可以通過GSH-Gpx4通路誘發(fā)鐵死亡和有效抑制STAT3 磷酸化，對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤不同亞型發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。DMF 亦是Nrf2 激動(dòng)劑，以往研究已顯示DMF 能夠以Nrf2 依賴的方式減少心肌缺血/再灌注損傷[18]；DMF 可以通過激活Nrf2 信號(hào)通路抑制糖尿病引起的心肌組織損傷等[19，20]。本研究以小鼠胰島β 細(xì)胞株MIN6 為研究對(duì)象，探討DMF 在亞砷酸鈉誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制，為砷致2型糖尿病的預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NaAsO2組比較，DMF 預(yù)處理可以顯著提高M(jìn)IN6 細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡數(shù)量，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，提示DMF 預(yù)處理后顯著降低亞砷酸鈉對(duì)MIN6 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。為了進(jìn)一步探究DMF 對(duì)亞砷酸鈉誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制，本課題組檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)Nrf2/ARE 信號(hào)通路表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與NaAsO2組比較，DMF 預(yù)處理能夠明顯增加細(xì)胞內(nèi)的Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，免疫細(xì)胞熒光染色可見Nrf2 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集增強(qiáng)，并與DMF濃度存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外，DMF 預(yù)處理顯著上調(diào)Nrf2 下游調(diào)控的Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm 等ARE 目的基因的mRNA 表達(dá)水平。這些結(jié)果說明DMF 可能是通過上調(diào)Nrf2/ARE 信號(hào)通路，拮抗亞砷酸鈉對(duì)胰島MIN6 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。