楊夢(mèng)怡 牛世博 張 靜 彭 亮 黨 潔 霍正浩 陸 宏

（寧夏醫(yī)科大學(xué)教育部生育力保持省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

人類第2指和第4指長度之比（2D∶4D）被公認(rèn)為產(chǎn)前性激素暴露水平的一個(gè)宏觀生物標(biāo)志物[1]，不僅與一些體質(zhì)性狀或心理特征密切相關(guān)，且與神經(jīng)、心血管、生殖等系統(tǒng)某些性激素依賴疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有一定關(guān)聯(lián)[2-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，2D∶4D 的發(fā)育可能受某些相關(guān)基因（如LIN28B基因[7]、SMOC1基因[8]和AR基因[9]等）單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的影響，但這些基因如何調(diào)控指長比的形成尚不清楚。T盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（T-box transcription factor，TBX）蛋白家族是胚胎發(fā)育過程中所必需的，其編碼基因TBX可通過啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域激活或抑制不同的靶基因來調(diào)節(jié)個(gè)體胚胎的發(fā)生[10]。其中，TBX3和TBX5基因?qū)棺祫?dòng)物胚胎，尤其是前肢和后肢的發(fā)育具有極其重要的調(diào)控作用[10]。以往對(duì)雞胚胎進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，TBX3基因可通過對(duì)BMP和Shh信號(hào)通路的調(diào)控，參與其Ⅳ趾和Ⅲ趾的正常發(fā)育[11]。而TBX5基因在包括斑馬魚[12]、雞[13]和小鼠[14]在內(nèi)的一些脊椎動(dòng)物中，也被證實(shí)對(duì)諸如骨骼、指（趾）骨等的形成至關(guān)重要。為確定TBX3基因和TBX5基因是否參與人類指長比（2D∶4D）的發(fā)育，本研究對(duì)2D∶4D 與TBX3和TBX5基因5個(gè)SNP在寧夏人群的分布特征及其間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了比較分析，以期初步探討人類指長發(fā)育的生物學(xué)基礎(chǔ)，為今后的相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循“知情同意”原則。選取在校漢族學(xué)生799 人作為研究對(duì)象，其中男性398 人，女性401 人，年齡16～26 歲，平均年齡（19.51±1.23）歲。所有研究對(duì)象均為祖籍寧夏的健康個(gè)體，并自我報(bào)告雙親間3 代內(nèi)無血緣關(guān)系。排除手部殘疾者或手部精細(xì)結(jié)構(gòu)缺失者。

1.2 指長的測(cè)量及2D∶4D 的計(jì)算

采用數(shù)碼相機(jī)拍攝研究對(duì)象雙手掌面照片[9]。將照片導(dǎo)入圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）測(cè)量2D 和4D。每個(gè)樣本測(cè)量2 次（r＞0.95），取平均值，分別計(jì)算左手2D∶4D 和右手2D∶4D。

1.3 TBX3/TBX5 基因SNP 的篩選

采用基因組SNP 在線軟件：SNPinfo Web（http：//snpinfo．niehs．nih．gov/），進(jìn)行SNP 的篩選，選取r2≥0.8；最小等位基因頻率≥0.05；位于基因啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)、5′或3′非翻譯區(qū)的功能性SNP，最終納入TBX3 基因3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)（rs2242442、rs1061651、rs8853），TBX5 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)（rs11067101、rs6489956）進(jìn)行研究。

1.4 基因組DNA 的提取

采用EDTA 抗凝采血管采集研究對(duì)象外周血2～3 mL。按照試劑使用說明，用TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒對(duì)研究對(duì)象外周血基因組DNA 進(jìn)行提取，隨后將DNA 滴入分光光度計(jì)（nanodrop）的微量池孔上進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，要求DNA 濃度大于20 ng/μL，A260/A280 的比值在1.7～1.9 之間，對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的DNA 置于-20℃冰箱保存。

1.5 SNPs 位點(diǎn)的基因分型

采用多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（諾禾生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行基因分型。PCR 程序分2 輪進(jìn)行，一輪PCR：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 10 min，72 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，4 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，24 個(gè)循環(huán)；二輪PCR：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；60 ℃4 min，72 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，5 個(gè)循環(huán)；65 ℃ 1 min，72℃ 30 s，10 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物于Illumina X-10 測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。隨機(jī)抽取5%的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，分型一致率應(yīng)為100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

受試者的群體代表性采用Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)比較基因型頻率和等位基因頻率；獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2D∶4D 均值的性別差異；單因素方差分析評(píng)估2D∶4D 與SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用SPSS 25.0 軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2D∶4D 均值在不同性別間的比較

2D∶4D 均值在不同性別間的分布見表1。結(jié)果顯示，女性左手2D∶4D 和右手2D∶4D 的變化范圍基本相當(dāng)，但均值均顯著高于男性（P＜0.01）。

表1 不同性別間2D∶4D 均值的比較[±s （min～max），mm]

表1 不同性別間2D∶4D 均值的比較[±s （min～max），mm]

*P＜0.01 vs 男性

組別n左手右手男性3980.960±0.037（0.727～1.060）0.964±0.035（0.835～1.060）女性4010.969±0.034（0.876～1.097）*0.971±0.034（0.882～1.063）*

2.2 TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性分布在不同性別間的比較

H-W平衡檢驗(yàn)表明，本研究所選各位點(diǎn)均具有良好的群體代表性（P＞0.05）。不同性別間5個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性分布的比較結(jié)果顯示，TBX3/TBX5基因rs2242442、rs1061651、rs8853、rs11067101、rs6489956 5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)各基因型及等位基因頻率在兩性間的分布規(guī)律相似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 不同性別間TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性分布的比較[n （%）]

2.3 2D∶4D 與TBX3/TBX5基因5個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析

寧夏大學(xué)生2D∶4D 與TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示：不論男性或女性，TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性與左手2D∶4D 和右手2D∶4D 均無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）（表3）。

表3 不同性別2D∶4D 與TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析（±s，mm）

表3 不同性別2D∶4D 與TBX3/TBX5 基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析（±s，mm）

基因SNP 位點(diǎn)基因型男性 （n=398）女性 （n=401）左手2D∶4D右手2D∶4D左手2D∶4D右手2D∶4D TBX3rs2242442GG0.961±0.0370.970±0.0350.964±0.0310.968±0.035 GA0.959±0.0390.963±0.0360.970±0.0320.972±0.034 AA0.962±0.0310.961±0.0320.971±0.0420.972±0.033 rs1061651TT0.957±0.0400.961±0.0370.967±0.0330.972±0.036 TC0.962±0.0350.967±0.0330.967±0.0360.970±0.034 CC0.959±0.0370.965±0.0340.974±0.0290.973±0.032 rs8853TT0.959±0.0340.966±0.0320.972±0.0320.971±0.032 TC0.961±0.0350.964±0.0350.966±0.0350.970±0.034 CC0.959±0.0460.963±0.0400.969±0.0340.975±0.037 TBX5rs11067101GG0.963±0.0340.967±0.0330.966±0.0340.970±0.033 GA0.959±0.0350.963±0.0360.970±0.0330.971±0.035 AA0.958±0.0450.965±0.0350.973±0.0360.975±0.035 rs6489956CC0.962±0.0370.965±0.0340.970±0.0340.972±0.034 CT0.952±0.0320.964±0.0360.963±0.0310.967±0.034 TT0.975±0.0400.964±0.0410.951±0.0380.970±0.033

3 討論

指長比（2D∶4D）的發(fā)育受產(chǎn)前睪酮（prenatal testosterone，PT） 或產(chǎn)前雌激素（prenatal estrogen，PE）暴露水平的影響[15]。女性的2D∶4D通常比男性高[16]，本研究結(jié)果再次驗(yàn)證了2D∶4D的性別差異性這一特征。此外，有研究顯示，右手2D∶4D 對(duì)PT（PE）暴露水平的敏感性更強(qiáng)，更能體現(xiàn)產(chǎn)前性激素對(duì)指長發(fā)育的影響[17]。在本研究中，雙手2D∶4D 均被發(fā)現(xiàn)可反映PT（PE）的暴露水平。

作為T-box 基因家族中對(duì)脊椎動(dòng)物肢體發(fā)育的重要調(diào)控基因，人類TBX3 或TBX5 基因的突變與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]。例如，TBX3 基因突變可導(dǎo)致尺骨-乳腺綜合征，患者除乳腺缺損等主要癥狀外，亦可出現(xiàn)指骨、掌骨缺如或發(fā)育不良，指間關(guān)節(jié)屈曲攣縮畸形，且有并指癥的傾向[18]。而TBX5 基因突變則可導(dǎo)致心-手畸形綜合征，患者除心發(fā)育缺陷外，還表現(xiàn)出前肢缺陷，包括橈骨發(fā)育不全和指骨缺失等異常特征[19]。這些結(jié)果提示，TBX3 和TBX5 基因不僅在人類四肢骨（包括指骨）的發(fā)育過程中扮演著重要的角色，且參與了其不同形態(tài)模式的決定。此外，臨床研究表明，T-box 基因堿基的遺傳變異可能導(dǎo)致其表達(dá)水平的改變，從而影響人類某些性激素相關(guān)疾病的發(fā)生[20]。例如，F(xiàn)ernandez-Moya 等[21]研究智利人群TBX3 基因多態(tài)性對(duì)乳腺癌的作用時(shí)，顯示該基因rs2242442 位點(diǎn)雜合子GA 和G 等位基因攜帶者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，提示G 等位基因在乳腺癌的發(fā)生過程中可能具有保護(hù)作用。Wang 等[22]對(duì)中國漢族人群的研究顯示，TBX5 基因rs6489956 C＞T 變異與先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）遺傳易感性的增加相關(guān)，CT 和TT 基因型攜帶者CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是CC 基因攜帶者的1.83 倍（OR=1.83，95% CI：1.48～2.28）。上述與TBX3 和TBX5 基因多態(tài)性有關(guān)的性激素依賴性疾病亦被報(bào)道與指長比間存在相關(guān)性[5，23-24]。由此推測(cè)，TBX3 和TBX5基因位點(diǎn)多態(tài)性變化與2D∶4D 形成之間可能存在某種潛在的聯(lián)系。本研究分別對(duì)TBX3 基因3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)和TBX5 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏大學(xué)生2D∶4D 間的關(guān)系進(jìn)行了分析，遺憾的是，無論在男性還是女性，均未見兩者之間存在顯著關(guān)聯(lián)。由于目前上述2 個(gè)基因多態(tài)性與人類指長發(fā)育關(guān)系的相關(guān)研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道，故我們對(duì)本文中陰性結(jié)果產(chǎn)生的真正原因暫時(shí)還難以給出一個(gè)令人滿意的解釋。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示[25-26]，Tbx3 和Tbx5 基因分別與T-box 家族成員中另外2個(gè)基因Tbx2 和Tbx4 同源，相互之間的功能密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，Tbx2 和Tbx3 基因在雞趾骨等多種組織中具有類似的表達(dá)模式[25]；而小雞Tbx4 異常表達(dá)后觀察到的足趾異常、發(fā)育不全和/或橈骨缺失與人類TBX5 基因突變導(dǎo)致的表型亦相近[26]。這些現(xiàn)象說明，除了Tbx3 和Tbx5 基因外，Tbx2和Tbx4 基因可能也共同參與了對(duì)動(dòng)物指（趾）骨發(fā)育過程的調(diào)控。據(jù)此我們初步分析，本文中未能發(fā)現(xiàn)TBX3 和TBX5 基因多態(tài)性與2D∶4D 間顯著關(guān)聯(lián)的主要原因之一，可能源于研究中僅單獨(dú)考慮了T-box 基因家族中TBX3 和TBX5 兩個(gè)基因?qū)?D∶4D 形成的影響，而忽略了其同源基因TBX2 和TBX4 在指骨發(fā)育過程中與它們的協(xié)同作用。此外，本文中選取的TBX3 和TBX5 基因各SNPs 的數(shù)量相對(duì)有限，可能還不足以較全面體現(xiàn)這2 個(gè)基因多態(tài)性與2D∶4D 間的真正關(guān)系。這些也提示在后續(xù)研究中，應(yīng)適當(dāng)擴(kuò)大對(duì)T-box 基因家族成員中相關(guān)基因及SNP 位點(diǎn)的納入范圍，通過基因互作、連鎖分析等方法在不同人群中對(duì)二者間的關(guān)系進(jìn)行更加完善的分析和探討，將對(duì)更好的從分子遺傳學(xué)角度闡釋2D∶4D 的生物學(xué)發(fā)生基礎(chǔ)及其與相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

綜上所述，本研究雖未見TBX3、TBX5 基因家族中的5 個(gè)SNP 對(duì)寧夏人群2D∶4D 的形成具有明顯作用，但仍不能完全否認(rèn)TBX3 和TBX5 基因多態(tài)性與指長比間可能存在的潛在關(guān)聯(lián)?；赥-box 基因家族在人類肢體（骨骼）發(fā)育過程中的重要作用及這些基因變異與人類性激素相關(guān)疾病的密切關(guān)系，其與2D∶4D 間的關(guān)聯(lián)性依然需要此領(lǐng)域相關(guān)學(xué)者的共同努力去明確。