李六水，欒好明，李亞利，劉憲軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京 101149

急性心肌梗死（AMI）是臨床上常見的心血管系統(tǒng)急危重癥，通常是由于冠狀動脈閉塞、血流中斷而導(dǎo)致急性持續(xù)性缺血、缺氧狀態(tài)，從而造成部分心肌急性壞死［1］，大多因心肌持續(xù)性缺血、缺氧而出現(xiàn)心功能急劇降低，患者出現(xiàn)劇烈胸痛癥狀。AMI 是導(dǎo)致我國城鄉(xiāng)居民死亡的主要疾病之一，根據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2021 概要》［2］，從2005 年開始，其死亡率呈快速上升趨勢；AMI 也是西方國家居民的主要死亡原因之一［3］，現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。抗血小板治療是AMI 治療的重要手段。我國指南［4-8］均推薦，只要不存在禁忌證，患者在診斷AMI 時，均應(yīng)立即口服（或嚼服）首劑阿司匹林300 mg，后以75～100 mg/d 長期維持；經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）是目前AMI 治療的主要手段，阿司匹林也是PCI 術(shù)后預(yù)防血栓事件的常規(guī)藥物之一；此外，阿司匹林也是AMI 二級預(yù)防的主要藥物，AMI 患者只要無禁忌證都應(yīng)長期服用阿司匹林［4］。但在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，有部分患者服用阿司匹林無效或療效降低，無法達到預(yù)期的抗血小板藥理學(xué)效應(yīng)，或無法有效地預(yù)防血栓事件，這一現(xiàn)象被稱為阿司匹林抵抗（AR）［9］?，F(xiàn)有研究表明，遺傳變異是阿司匹林治療失敗，即AR 的重要促成因素之一，如阿司匹林在體內(nèi)的重要代謝酶或作用靶點的改變均可能會使其體內(nèi)代謝過程或藥物效應(yīng)發(fā)生變化，從而影響其正常藥理作用的發(fā)揮［10］。與AR 遺傳易感性相關(guān)的候選基因包括血小板膜糖蛋白Ⅲa受體血小板抗原2（GPⅢa PLA2）基因和血小板內(nèi)皮聚集受體1（PEAR1）基因等，這些基因上重要單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的遺傳變異可能直接導(dǎo)致AR［10］。對與AR 相關(guān)的多態(tài)性位點進行觀察分析，有助于預(yù)判常規(guī)使用阿司匹林的療效或不良反應(yīng)。本研究通過對漢族AMI 患者中與AR 相關(guān)的2 個重要的多態(tài)性位點，即GP Ⅲa PLA2 （rs5918）和PEAR1 （rs12041331）位點的基因型和等位基因進行分析，并與1000 Genomes 數(shù)據(jù)庫中收錄的部分人群的等位基因頻率分布進行對比，明確GPⅢa PLA2、PEAR1 基因多態(tài)性分布特征，以便更好地指導(dǎo)阿司匹林在AMI患者中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院2016年11月—2022年12月收治的漢族AMI患者265 例作為研究對象，其中男207 例、女58 例，年齡22～96（62.80 ± 13.82）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2001年中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》中AMI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；漢族；住院期間完成GP Ⅲa PLA2 （rs5918）和PEAR1（rs12041331） 2 個位點基因型檢測；病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述AMI 診斷標(biāo)準(zhǔn)，或疑似AMI但未確診；非漢族；住院期間未完成GPⅢa PLA2（rs5918）和PEAR1 （rs12041331） 2 個位點基因型檢測，或僅完成其中1個位點基因型檢測；病歷資料不完整。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，納入者對多態(tài)性位點基因型檢測知情同意。

1.2 GPⅢa PLA2 （rs5918）和PEAR1 （rs12041331）位點基因型檢測 根據(jù)Watson-Crick 堿基互補配對原理，采用熒光染色原位雜交方法檢測GP Ⅲa PLA2 （rs5918）和PEAR1（rs12041331） 2 個位點的基因型。先用一次性真空EDTA 抗凝管采集AMI患者的外周靜脈血2～3 mL，輕搖采血管，使血樣與抗凝劑充分混勻；再用移液器取靜脈血樣150 μL，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL 并充分混勻后靜置；3 000 r/min離心10 min后棄去上清液；加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）50 μL 后充分混勻；分別取1.5 μL 混懸液至相應(yīng)多態(tài)性位點基因型檢測的測序反應(yīng)通用試劑管（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）中，充分混勻后置于雙通道實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）中，設(shè)定相關(guān)參數(shù)，檢測患者的GP Ⅲa PLA2 （rs5918）和PEAR1（rs12041331） 2 個位點基因型。

對本研究中所選取的漢族AMI 患者樣本中PEAR1 （rs12041331）位點基因型的分布進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗［11］，判斷所選取的樣本群體在該位點上是否達到遺傳平衡，從而判斷所選取的樣本對漢族AMI 患者是否具有穩(wěn)定的代表性。

采用頻數(shù)計數(shù)法統(tǒng)計本研究的樣本群體中GPⅢa PLA2 （rs5918）和PEAR1 （rs12041331） 2個位點上的基因型頻率，如野生型純合子基因型頻率=野生型純合子數(shù)量/樣本總量×100%；根據(jù)基因型頻率推算等位基因頻率，并將推算得到的等位基因頻率與1000 Genomes 數(shù)據(jù)庫中收錄的部分其他人群中相應(yīng)等位基因頻率的分布進行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，若有超過1/4 的單元格的理論頻數(shù)均＜5，則采用Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究中在GPⅢa PLA2 （rs5918）位點上CC 基因型的實際頻數(shù)為0（見后述），根據(jù)該位點基因型頻數(shù)不便于進行遺傳平衡檢驗，因此根據(jù)PEAR1（rs12041331）位點基因型頻數(shù)進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。本研究中，265 例漢族AMI 患者PEAR1 （rs12041331）位點GG、GA和AA基因型的實際頻數(shù)分別為103、120、42 例，計算得3 種基因型的理論頻數(shù)分別為100.26、125.48、39.26 例。PEAR1（rs12041331）位點上各基因型的實際頻數(shù)和理論頻數(shù)的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.25，P=0.88＞0.05），說明該位點達到遺傳平衡，本研究中選取的樣本群體對漢族AMI患者具有穩(wěn)定的代表性。

2.1 漢族AMI 患者中GP Ⅲa PLA2 （rs5918）、PEAR1 （rs12041331）基因型頻率及等位基因頻率265 例漢族AMI 患者中，GPⅢa PLA2 （rs5918）位點野生型純合子（TT 型）、突變型雜合子（TC 型）和突變型純合子（CC 型）的基因型頻數(shù)分別為260、5、0例，基因型頻率分別為98.11%、1.89%、0； T 等位基因頻率為99.06%，C等位基因頻率為0.94%。

PEAR1 （rs12041331）位點野生型純合子（GG型）、突變型雜合子（GA型）和突變型純合子（AA型）的基因型頻數(shù)分別為103、120、42 例，基因型頻率分別為38.87%、45.28%、15.85%；G、A 等位基因頻率分別為61.51%、38.49%。

2.2 漢族AMI 患者與1000 Genomes 數(shù)據(jù)庫中收錄的部分其他人群中GPⅢa PLA2 （rs5918）、PEAR1（rs12041331）位點等位基因頻率比較 北京漢族、南方漢族、日本東京、孟加拉、非洲裔美國人群、芬蘭人群、墨西哥裔美國洛杉磯人群和秘魯利馬人群中，GPⅢa PLA2 （rs5918）位點T 等位基因頻率分別為99.03%、99.52%、99.04%、88.95%、91.80%、88.89%、89.84% 和94.71%；PEAR1 （rs12041331）位點G 等位基因頻率分別為60.19%、56.67%、56.25%、63.37%、56.56%、93.43%、84.38% 和70.00%。

漢族AMI 患者中，GP Ⅲa PLA2 （rs5918）和PEAR1 （rs12041331）位點等位基因分布與北京漢族、南方漢族和日本東京人群等東亞人群相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為0.15、0.03、0.16、0.11、1.47、1.72；P均＞0.05）；GPⅢa PLA2 （rs5918）位點等位基因分布與孟加拉、芬蘭、秘魯利馬人群、非洲裔美國人群和墨西哥裔美國洛杉磯人群相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，T 等位基因頻率均高于后5 類人群（χ2值分別為40.16、41.72、10.29、20.11、29.54，P均＜0.01）；漢族AMI 患者中PEAR1 （rs12041331）位點等位基因分布與孟加拉及非洲裔美國人群相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為0.19、1.02，P均＞0.05），但該位點G 等位基因頻率低于秘魯利馬人群、芬蘭和墨西哥裔美國洛杉磯人群（χ2值分別為74.0、10.20、24.02，P均＜0.05）。

3 討論

編碼GP的基因具有高度多態(tài)性，重要基因位點的突變可能會改變GP Ⅱb/Ⅲa 受體的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響血小板黏附、聚集過程，也成為導(dǎo)致血栓形成的重要因素。如GPⅢa 編碼基因在GP Ⅲa 編碼區(qū)2 號外顯子1565 位核苷酸位置（rs5918）常表現(xiàn)出血小板抗原多態(tài)性（PLA1/PLA2）［12］，對應(yīng)等位基因分別稱為PLA1 和PLA2。攜帶PLA2 等位基因早在1996 年首次被報道與冠心病的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)［13］，2004 年被報道與心肌梗死的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)［14］。GPⅢa PLA2 （rs5918）位點的多態(tài)性分布在不同種族、不同地域中存在較大差異。本研究中，漢族AMI患者中該位點上PLA1（T）等位基因頻率大于99%，PLA2（C）等位基因頻率低于1%，與北京漢族、南方漢族及日本東京人群等東亞人群類似，但PLA1（T）等位基因頻率明顯高于孟加拉、芬蘭、秘魯利馬人群及非洲裔美國人群和墨西哥裔美國洛杉磯人群等非東亞人群。本研究的265 例漢族AMI 患者中GP Ⅲa PLA2 （rs5918）位點上僅5 例PLA1/PLA2（TC）型突變，其余均為PLA1/PLA1（TT）型，占98.11%，而PLA2/PLA2（CC）型缺如，與李春曉［15］報道的研究結(jié)果類似，其報道的青島地區(qū)需阿司匹林治療的152例漢族動脈粥樣硬化高?；颊咧?，151例（99.34%）為PLA1/PLA1（TT）型，1 例（0.66%）為PLA1/PLA2（TC）型，也未見PLA2/PLA2（CC）型。本研究與其相比，GPⅢa PLA2 （rs5918）位點基因型的分布無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果也與石秀錦等［16］報道的138 例缺血性疾病患者的研究結(jié)果類似，其研究中，該位點上PLA1/PLA1（TT）型137 例（99.28%），PLA1/PLA2（TC）型1 例（0.72%），無PLA2/PLA2（CC）型，本研究與之相比，基因型分布也無統(tǒng)計學(xué)差異。

PEAR1 基因是調(diào)控血小板功能的重要基因，其多態(tài)性已被證實與血小板反應(yīng)性有關(guān)［17］。PEAR1基因中的重要SNPs 位點包括rs12041331、rs11264579、rs11264580、rs12566888 等。國內(nèi)外大量研究證據(jù)顯示，PEAR1 （rs12041331）位點的多態(tài)性會影響血小板反應(yīng)性。我國學(xué)者XU 等［18］報道，中國冠狀動脈支架植入術(shù)患者中，PEAR1（rs12041331）位點為AA型的患者與非AA型患者相比，術(shù)后30 d 內(nèi)發(fā)生主要心血管不良事件的風(fēng)險增加2.78倍。美國學(xué)者LEWIS等［19］指出，基線血小板聚集的GWAS 薈萃分析發(fā)現(xiàn)，PEAR1 （rs12041331）位點是與ADP 和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集效應(yīng)相關(guān)性最強的基因多態(tài)性位點，基因分型顯示PEAR1 （rs12041331）位點與雙聯(lián)抗血小板療效具有強相關(guān)性；在PCI 術(shù)后接受雙聯(lián)抗血小板治療的白種人和非裔美國患者中，PEAR1 （rs12041331）位點上等位基因A 攜帶者（即非GG 型患者）比GG 型純合子患者相比，發(fā)生心血管事件或心血管死亡的風(fēng)險更高；而單用阿司匹林的患者中，該位點上等位基因A 攜帶者（即非GG 型患者）發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險也顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，漢族AMI 患者中PEAR1（rs12041331）位點等位基因A 攜帶者占61.13%（即45.28%+15.85%），GG 型純合子患者僅占38.87%，與上述XU 等［18］報道的基因型分布類似，其報道的2 007 例行冠脈支架植入術(shù)并接受氯吡格雷和阿司匹林治療的中國急性冠脈綜合征或穩(wěn)定型冠脈疾病患者中，GG 型純合子（768 例）占38.27%，GA 型雜合子（941 例）占46.89%，AA 型純合子（298 例）占14.85%，本研究與之相比，PEAR1 （rs12041331）位點基因型的分布無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究也發(fā)現(xiàn)，漢族AMI 患者中PEAR1 （rs12041331）位點攜帶等位基因A頻率與北京漢族、南方漢族、日本東京人群及孟加拉和非洲裔美國人群類似，卻高于芬蘭人群以及墨西哥裔美國洛杉磯人群和秘魯利馬人群，可能與種族、地域等因素有關(guān)，也可能是由于本研究中選取的是AMI 人群，而數(shù)據(jù)庫中收錄的多是非特定疾病的一般人群。

總之，在漢族AMI 患者中，GP Ⅲa PLA2（rs5918）位點上突變少見，攜帶等位基因T 頻率很高，與1000 Genomes 數(shù)據(jù)庫中收錄的部分其他人群類似；而PEAR1 （rs12041331）位點上突變多見，與部分既往數(shù)據(jù)存在差異，可能與所觀察人群為AMI疾病狀態(tài)有關(guān)，即該位點突變使AMI 發(fā)生風(fēng)險升高，但也可能是種族差異等因素導(dǎo)致。對漢族AMI患者用藥前行GP Ⅲa PLA2 （rs5918）、PEAR1（rs12041331）位點的多態(tài)性檢測，有助于在用藥前預(yù)測患者是否存在AR，并根據(jù)相關(guān)檢測結(jié)果指導(dǎo)臨床安全、有效地選用藥物。