牛棟玲 張妍春 劉紅莉

作者單位：1西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心 西北大學(xué)附屬人民醫(yī)院，西安710004；2西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院 陜西省眼科醫(yī)院 西北大學(xué)附屬人民醫(yī)院 西安市眼底病研究所，西安 710004

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是1型及2型糖尿?。―iabetes mellitus，DM）最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，是糖尿病患者終末器官損傷在眼部的表現(xiàn)，可導(dǎo)致不可逆的嚴(yán)重視力損害，是工作人群致盲的首位病因。近年來，隨著生活水平提高和生活方式改變，DM和DR的發(fā)病率均呈快速上升趨勢(shì)。據(jù)2021年發(fā)布的第10版《全球糖尿病地圖》統(tǒng)計(jì)，目前全球有5.37億DM患者，預(yù)計(jì)2040年將攀升至6.42億，其中大約2.24億可能發(fā)展為DR[2]，DR防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻，診療面臨巨大挑戰(zhàn)[3]，亟需新的技術(shù)來深入探討DR的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為制定更有效的檢測(cè)、防控和治療策略奠定基礎(chǔ)。然而，DR發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜[4]，且視網(wǎng)膜是一個(gè)高度異質(zhì)性的組織，視網(wǎng)膜不同細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展過程中如何變化，以及它們之間如何相互作用，仍有很多未知，DR發(fā)病機(jī)制很難剖析。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）能夠在單細(xì)胞分辨率下解析DR中各種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組特征、相互作用及其在疾病進(jìn)展中的時(shí)序變化[5]，為闡明視網(wǎng)膜組織異質(zhì)性和探索DR發(fā)病機(jī)制提供了高效方法?，F(xiàn)就scRNA-seq的技術(shù)原理及其在DR中的應(yīng)用，包括分析DR中主要的致病細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)錄組特征、揭示DR發(fā)病機(jī)制、鑒定新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 scRNA-seq特點(diǎn)及流程

細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和功能的基本組成單位，識(shí)別每一個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)特征具有重要價(jià)值。scRNA-seq通過分離和捕獲單細(xì)胞，繞過了傳統(tǒng)的基于組織樣本的bulk RNAseq造成的種群數(shù)據(jù)相關(guān)的平均偽像，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄本的異質(zhì)性和復(fù)雜性，允許對(duì)組織、器官、生物體內(nèi)不同細(xì)胞類型進(jìn)行分類和識(shí)別新的生物標(biāo)志物，在揭示疾病病理過程、研究免疫微環(huán)境、探討疾病轉(zhuǎn)化、指導(dǎo)疾病早期診斷、靶向治療、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮著越來越重要的作用[6]。

scRNA-seq的技術(shù)流程通常包括單細(xì)胞分離捕獲、轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、文庫構(gòu)建、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，其中單細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增是關(guān)鍵步驟[7]。首先，需要通過機(jī)械或酶解離、熒光活細(xì)胞分選和微流控芯片等技術(shù)手段分離捕獲單細(xì)胞；然后，提取單細(xì)胞的RNA，獲得高質(zhì)量、高純度的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；接著，將擴(kuò)增后的cDNA文庫進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。標(biāo)準(zhǔn)的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析包括多個(gè)階段，使用各種分析工具來完成[8]，如使用CellRanger獲得每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)矩陣，使用Seurat軟件控制多細(xì)胞數(shù)據(jù)或低質(zhì)量的細(xì)胞，獲得高質(zhì)量的表達(dá)矩陣。最后，利用免疫組化、原位雜交、基因工程細(xì)胞系模型和基因編輯技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證新鑒定的疾病相關(guān)基因或生物標(biāo)志物。

2 scRNA-seq在視網(wǎng)膜研究中的應(yīng)用

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）的一部分，是一個(gè)高度異質(zhì)性的組織，包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管床細(xì)胞。哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜由神經(jīng)視網(wǎng)膜（Neural retina，NR）和視網(wǎng)膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）組成。NR由數(shù)億個(gè)神經(jīng)元構(gòu)成，據(jù)估計(jì)有超過100種神經(jīng)細(xì)胞亞型，每一種細(xì)胞亞群都具有特定的生理、形態(tài)和分子定義。2015年scRNA-seq被Macosko等[9]首次應(yīng)用于視網(wǎng)膜分析，目前該技術(shù)正在成為揭示視網(wǎng)膜復(fù)雜性的最強(qiáng)大的工具之一，在構(gòu)建視網(wǎng)膜細(xì)胞圖譜[10]、鑒定視網(wǎng)膜細(xì)胞亞型[11]、揭示視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞類型[12]、評(píng)估視網(wǎng)膜發(fā)育[13]、闡明視網(wǎng)膜再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[14]、解析視網(wǎng)膜疾病發(fā)病機(jī)制和挖掘潛在治療靶標(biāo)[15]等方面已經(jīng)有所應(yīng)用并取得了較大進(jìn)展。例如，通過scRNA-seq技術(shù)成功建立了小鼠和人的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并發(fā)現(xiàn)了新的候選細(xì)胞亞型[9-10]，為研究視網(wǎng)膜細(xì)胞異質(zhì)性提供了細(xì)胞圖譜。通過比較中央凹區(qū)域和周邊視網(wǎng)膜中不同分類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，揭示了中央凹區(qū)域獨(dú)特的分子特性[16]。此外，通過比較胎兒視網(wǎng)膜和成熟視網(wǎng)膜組織的基因表達(dá)，為構(gòu)建視網(wǎng)膜疾病的體外模型奠定了基礎(chǔ)[17]。綜上，鑒于scRNA-seq在探索視網(wǎng)膜疾病發(fā)病機(jī)制和挖掘潛在治療靶標(biāo)方面的巨大潛力，有學(xué)者建議將其作為開發(fā)視網(wǎng)膜疾病新型療法的重要工具之一[18]。

3 scRNA-seq在DR中的應(yīng)用

3.1 揭示DR發(fā)病機(jī)制和挖掘新診療靶點(diǎn)

血-視網(wǎng)膜屏障（Blood retinal barrier，BRB）受損是DR和糖尿病黃斑水腫（Diabetic macular edema，DME）的基本病理改變，其中內(nèi)血-視網(wǎng)膜屏障（inner iBRB，iBRB）受損被認(rèn)為是視網(wǎng)膜血管疾病的的主要原因之一。Wang等[19]通過scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells，ECs）和周細(xì)胞（Pericytes，PCs）是構(gòu)成大鼠iBRB的主要細(xì)胞，其中CTXN3+ Müller細(xì)胞在BRB代謝廢物清除、內(nèi)皮損傷和血管生成方面具有潛在作用。Sampathkumar等[20]研究發(fā)現(xiàn)，DM和非DM下小鼠視網(wǎng)膜ECs和PCs的轉(zhuǎn)錄譜存在明顯差異，在DM小鼠中，與血管新生、炎癥通路和促凋亡通路激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄簇在ECs和PCs富集，而與內(nèi)皮屏障維護(hù)相關(guān)的基因則顯著下調(diào)。這些新基因和通路為解析DR早期iBRB的調(diào)控機(jī)制提供了重要信息。ECs介導(dǎo)血管功能并調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜環(huán)境，是DR疾病的病理中心。Sun等[21]發(fā)現(xiàn)DM引起ECs大量基因表達(dá)失調(diào)，確認(rèn)了DR特異性的ECs是來源于毛細(xì)血管的ECs，并且通過激活白介素-17（Interleukin-17，IL-17）在內(nèi)的多條炎癥通路，在導(dǎo)致炎癥和加速DR進(jìn)展中發(fā)揮作用，為DR病理機(jī)制的理解和潛在治療靶點(diǎn)的篩選提供了新的線索。

炎癥是早期DR的特征和DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[22]。炎癥細(xì)胞因子釋放、免疫細(xì)胞激活和白細(xì)胞淤滯使得視網(wǎng)膜處于持續(xù)的慢性低度炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致血管通透性增加和水腫加重，在DR發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。Lv等[23]利用scRNA-seq技術(shù)分析了鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的早期DR小鼠視網(wǎng)膜中的亞群細(xì)胞類型及其表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞cluster36是早期DR視網(wǎng)膜炎癥因子如IL-1β等的主要來源，小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了代謝重編程，促進(jìn)了其炎癥激活，并進(jìn)一步促進(jìn)了DR早期進(jìn)展，為通過改變小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)代謝微環(huán)境治療早期DR提供了理論依據(jù)。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，早期DR患者即存在視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和微血管變化，因此DR被認(rèn)為是一種神經(jīng)退行性疾病，但目前驅(qū)動(dòng)DR神經(jīng)病變的分子機(jī)制尚未闡明[24]。Yan等[25]分析來自健康供體的視網(wǎng)膜scRNA-seq數(shù)據(jù)，顯示已知的DR基因的表達(dá)主要存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cells，RGCs）。Becker等[26]整合人視網(wǎng)膜mRNA、miRNA和scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在沒有診斷為DR的DM患者中已經(jīng)可見RGCs特異性基因的部分丟失，提示在DR早期已經(jīng)存在RGCs損傷；而且RGCs特異性基因的表達(dá)在疾病進(jìn)展過程中持續(xù)下調(diào)，提示在該病理狀態(tài)下RGCs普遍丟失。Han等[27]利用CRISPR/Cas 9技術(shù)建立了pdx1基因雜合突變的斑馬魚模型，并進(jìn)行高水平的葡萄糖處理，以模擬DR疾病進(jìn)程。該研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜微血管結(jié)構(gòu)病變之前，視錐細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷就已經(jīng)獨(dú)立出現(xiàn)，其內(nèi)外節(jié)長度隨血糖升高顯著縮短；進(jìn)一步scRNA-seq顯示，高血糖狀態(tài)下，視錐細(xì)胞是最易受累的細(xì)胞類型，超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀離子通道1（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 1，HCN1）的基因表達(dá)隨著疾病進(jìn)展逐漸減少，提供了視錐細(xì)胞損傷是DR早期神經(jīng)病變機(jī)制的新見解[27]。

3.2 在不同分期DR及DME標(biāo)本中的應(yīng)用

3.2.1 揭示早期DR的細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)錄組特征 STZ誘導(dǎo)的DM小鼠視網(wǎng)膜屬于早期DR模型，常用于早期DR發(fā)病機(jī)制研究。Sun等[21]通過對(duì)健康和STZ誘導(dǎo)的DM小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)Cirbp、Rbm3、Mt1和Mt2等應(yīng)激誘導(dǎo)基因在大多數(shù)類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞中普遍被誘導(dǎo)，而雙極細(xì)胞則幾乎不受影響。基于Sun等[21]獲得的scRNA-seq數(shù)據(jù)，Zhang等[28]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DR早期可能與雙極細(xì)胞、Müller膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視錐細(xì)胞的數(shù)量顯著減少有關(guān)，但也與周細(xì)胞、視桿細(xì)胞、間變性細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著增加有關(guān)，其中，Müller膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和雙極細(xì)胞亞群參與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)通路，可能促進(jìn)疾病進(jìn)展，最終導(dǎo)致視力損傷和失明。Xiao等對(duì)DM獼猴視網(wǎng)膜的scRNA-seq分析顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞是高血糖條件下受影響最顯著的細(xì)胞類型，不僅其活化狀態(tài)和炎癥水平增加了，而且細(xì)胞間通訊強(qiáng)度也增強(qiáng)[29]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在DM小鼠視網(wǎng)膜的Müller膠質(zhì)細(xì)胞中，視黃醛結(jié)合蛋白1（Retinol binding protein 1，RLBP1）表達(dá)量下調(diào)，而過表達(dá)RLBP1能夠緩解DR相關(guān)的神經(jīng)血管變性，提示RLBP1可能是一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)[30]。這些研究為剖析早期DR的細(xì)胞和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3.2.2 揭示晚期DR的細(xì)胞類型和基因特征 Akimba小鼠是能復(fù)現(xiàn)臨床晚期DR特征的動(dòng)物模型之一。Van等[31]對(duì)12周大的野生型和Akimba小鼠的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)Akimba小鼠的視網(wǎng)膜出現(xiàn)了視桿細(xì)胞退化、膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞活化的失調(diào)表現(xiàn)，并伴有代謝、免疫、氧化還原和金屬離子失衡等轉(zhuǎn)錄改變。這些改變可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的支持功能損害、離子和水穩(wěn)態(tài)失衡、活性氧和促炎分子產(chǎn)生以及神經(jīng)退行性變。此外，該研究發(fā)現(xiàn)大膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了反應(yīng)性膠質(zhì)增生，并且存在不同的促纖維化和促炎亞群，這些均參與DR發(fā)病過程[31]。另1項(xiàng)研究揭示了增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（Proliferative diabetic retinopathy，PDR）中致病的主要視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，顯示視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞、雙極細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞與PDR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[30]。

纖維血管膜（Fibrovascular membranes，F(xiàn)VMs）的形成是PDR的關(guān)鍵病理標(biāo)志之一。然而，由于使用傳統(tǒng)的方法難以揭示不同細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)的變化，目前對(duì)FVMs發(fā)病機(jī)制的了解仍非常有限。Hu等[32]使用scRNA-seq技術(shù)揭示了PDR患者FVMs細(xì)胞的異質(zhì)性，在FVMs中確定了8個(gè)細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia，MG）在FVMs中占比最大，活化的MG參與了FVM的形成，在PDR發(fā)病中起核心作用；將MG進(jìn)一步細(xì)分為4個(gè)亞群：MG（1）、MG（2）、MG（3）和循環(huán)/增殖性MG，功能分析顯示，MG（1）的主要功能并非以往研究認(rèn)為的免疫調(diào)節(jié)作用，而是促纖維化及成纖維化。另1 項(xiàng)研究通過聯(lián)合分析PDR患者和對(duì)照組的FVMs樣本的bulk RNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)，確定了PDR的靶基因和細(xì)胞成分，發(fā)現(xiàn)CD44、細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）和骨膜蛋白（Periostin，POSTN）與PDR發(fā)病密切相關(guān)，POSTN可能是關(guān)鍵配體[33]。這些結(jié)果為更深入了解PDR分子機(jī)制提供了補(bǔ)充信息，同時(shí)為發(fā)現(xiàn)PDR新的基因特征和精準(zhǔn)治療提供了理論基礎(chǔ)。

3.2.3 探討DME發(fā)病易感性及機(jī)制 DME是DR的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，而目前關(guān)于DME中不同免疫細(xì)胞類型的表型、功能多樣性以及它們?cè)谛律苌珊脱苎装Y中的作用知之甚少。Peng等[16]發(fā)現(xiàn)與黃斑水腫相關(guān)的血小板源性生長因子-B（Platelet derived growth，PDGF-B）和內(nèi)皮素1（Endothelin 1，EDN1）基因的表達(dá)在視網(wǎng)膜中心凹中明顯高于外周內(nèi)皮細(xì)胞，這可能是該疾病中黃斑易感性增加的基礎(chǔ)。Ma等[34]通過對(duì)健康個(gè)體和DME患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞（Monocyte，MC）富含細(xì)胞因子通路和炎癥激活的基因，是介導(dǎo)DME的主要促炎細(xì)胞，其中促炎性CD14++ MC富含促血管生成和促炎性通路，可通過細(xì)胞因子尤其是白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的產(chǎn)生啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，并且可通過促進(jìn)MC與其他免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊而自募集和激活，在DME炎癥過程中發(fā)揮重要作用。該研究基于scRNA-seq方法構(gòu)建了DME患者的第一個(gè)免疫細(xì)胞圖譜，并證實(shí)了DME患者外周血存在先天免疫調(diào)節(jié)障礙，提示促炎CD14++ MC可以作為未來抗炎治療的潛在靶細(xì)胞群。

4 不足與展望

scRNA-seq在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已取得顯著進(jìn)展，成為研究細(xì)胞類型、功能和相互作用的強(qiáng)大工具[35]。然而，實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多局限和挑戰(zhàn)，包括獲取高質(zhì)量的單細(xì)胞樣本存在困難，樣本制備及細(xì)胞捕獲技術(shù)的偏差影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，檢測(cè)靈敏度的限制導(dǎo)致低豐度轉(zhuǎn)錄物表達(dá)被低估，無法提供細(xì)胞在組織中的精確位置信息，批次效應(yīng)與實(shí)驗(yàn)條件差異影響數(shù)據(jù)可比性和可重復(fù)性，以及數(shù)據(jù)分析解釋復(fù)雜等。為克服這些挑戰(zhàn)，研究者可采用測(cè)序深度增強(qiáng)、算法優(yōu)化或與其他技術(shù)結(jié)合的方法提高scRNA-seq敏感性和準(zhǔn)確性[36]；采用溫和的組織處理方法[37]，減少細(xì)胞損傷和功能丟失；運(yùn)用先進(jìn)的生物信息學(xué)方法進(jìn)行降維、聚類和差異分析[38]，提高數(shù)據(jù)處理準(zhǔn)確性和效率；并結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)[39]，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型、功能和位置的綜合分析。

目前，scRNA-seq在DR研究中已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但仍具有巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。隨著scRNA-seq應(yīng)用于更多不同分期及表型的DR樣本中，我們將更全面地了解DR的細(xì)胞異質(zhì)性，挖掘關(guān)鍵細(xì)胞類型和信號(hào)通路，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。同時(shí)，通過前瞻性地縱向收集患者的OCT和血液樣本等臨床數(shù)據(jù)，利用多模態(tài)數(shù)據(jù)集深化對(duì)DR中細(xì)胞功能和狀態(tài)變化的理解，以構(gòu)建更完整的疾病模型。此外，通過scRNA-seq結(jié)合動(dòng)物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)，并聯(lián)合應(yīng)用基因編輯、3D類器官培養(yǎng)和表觀遺傳修飾等技術(shù)，鑒定驗(yàn)證關(guān)鍵基因和通路，利用機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)技術(shù)挖掘新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為臨床診療提供證據(jù)支持。在未來，scRNA-seq有望發(fā)展成為用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)更完整、高通量、經(jīng)濟(jì)和易于操作的工具。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明牛棟玲：參與選題、收集文獻(xiàn)、撰寫論文，根據(jù)編輯部的意見進(jìn)行修改。張妍春：參與選題及文章構(gòu)思，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。劉紅莉：參與選題、文獻(xiàn)的分析解釋