李雨心 魏煒 陶勇 王曉君

作者單位：1首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院眼科，北京 100020；2中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190

眼內惡性腫瘤主要起源于視網(wǎng)膜和葡萄膜，其中，視網(wǎng)膜母細胞瘤（Retinoblastoma，Rb）是最常見的嬰幼兒原發(fā)性眼內惡性腫瘤，成人中則以葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）最為常見[1]。目前已有多種方法用于Rb的治療，Rb患兒的生存率和眼球保留率均有所改善，但對于復發(fā)性高和晚期頑固玻璃體腔種植Rb，現(xiàn)有的治療方法如眼動靜脈化療、玻璃體腔化療、放療和玻璃體切割術等療效均不佳。長期化療會導致多藥耐藥性，使Rb轉移及復發(fā)概率大大增加，同時可能導致骨髓抑制甚至繼發(fā)性白血病[2]；放療后可能出現(xiàn)放射性視網(wǎng)膜病變等嚴重并發(fā)癥，最終導致視力喪失甚至眼球摘除[1]；玻璃體切割術由于術中或術后嚴重的并發(fā)癥而備受爭議。UM瘤體的血供豐富，常在疾病發(fā)生的早期通過血源性播散形成轉移性葡萄膜黑色素瘤 （Metastatic uveal melanoma，mUM）。Shields等[3]發(fā)現(xiàn)分別有33%和25%的睫狀體和脈絡膜黑色素瘤患者在10年內發(fā)生轉移，轉移后1 年生存率約50%。雖然手術切除及放療可以控制局部腫瘤，但仍有50%的UM患者最終發(fā)展為mUM[4]。由于UM血行轉移可能在眼球摘除之前就已發(fā)生，因此，即使摘除了眼球，患者術后5年死亡率依然高達15%～53%[5]。面對UM的高轉移風險以及提高眼球保留率、降低死亡率的需求，現(xiàn)有治療方式對于保全患者的生命和視力依然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

隨著生物技術的迅速發(fā)展，生物治療作為一種新的治療方法被廣泛應用于多種腫瘤的治療。相較于傳統(tǒng)化療和放療，生物治療可以靶向殺傷腫瘤細胞，安全性更高；相較于手術治療，生物治療有望控制和消滅體內微小殘余病灶，防止腫瘤復發(fā)和轉移；生物治療還可以通過調動局部和全身的免疫反應增加晚期及轉移性腫瘤緩解的概率，為提高眼內惡性腫瘤生存率和眼球保留率帶來了新的希望。目前，免疫治療、基因治療、小分子抑制劑治療（Small molecule inhibitor，SMI）以及溶瘤病毒療法等多種生物治療在眼內惡性腫瘤中的研究發(fā)展迅速。筆者將對上述生物治療方法在眼內惡性腫瘤中的應用進展進行綜述。

1 免疫治療

正常情況下，機體免疫系統(tǒng)可以識別并清除腫瘤細胞，但腫瘤細胞為了生存，往往采用不同的策略使機體免疫產(chǎn)生抑制或耐受，如基因的改變使腫瘤細胞不能被免疫系統(tǒng)識別、腫瘤細胞表面產(chǎn)生免疫檢查點等免疫抑制因子與免疫細胞相互作用產(chǎn)生免疫抑制效應、改變腫瘤周圍正常細胞使其干擾免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的反應等。免疫治療是通過增強機體免疫原性、免疫反應性及降低免疫抑制性，從而恢復機體正常的抗腫瘤反應，抑制腫瘤的生長和轉移，在眼內惡性腫瘤中主要包括免疫檢查點抑制劑治療（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）、過繼免疫細胞治療（Adoptive immunotherapy，AIT）、腫瘤疫苗及靶向腫瘤抗原的單克隆抗體或雙特異性抗體等。

1.1 免疫檢查點抑制劑治療

ICIs通過抑制免疫檢查點信號，切斷腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，重新激活T細胞對腫瘤的免疫應答效應，從而達到抗腫瘤的作用。其中，程序性細胞死亡蛋白1（Programmed death-1，PD-1）、程序性細胞死亡配體1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）及細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等抑制劑是目前研究最多、臨床發(fā)展最快的ICIs方法[6]。ICIs的有效性取決于腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤情況以及免疫檢查點的表達情況。Li等[7]將腫瘤分為免疫Ⅰ型腫瘤即“熱”腫瘤（CD8+T細胞浸潤和PD-L1陽性表達）以及免疫Ⅱ型腫瘤即“冷”腫瘤（幾乎不存在或功能缺失的CD8+T細胞浸潤和PD-L1陽性表達）。其中，ICIs對“熱”腫瘤的治療效果更佳。

Madigan和Penfold[8]認為Rb是一種免疫原性較差的“冷”腫瘤，對于ICIs的反應欠佳。有學者發(fā)現(xiàn)化療后Rb腫瘤微環(huán)境中炎癥細胞如CD4+、CD8+、顆粒酶-b+淋巴細胞和巨噬細胞浸潤增加，腫瘤組織中CTLA-4 和PD-1 的表達升高[9]。Zhou等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠腫瘤移植模型中應用小分子抑制劑顯著增強T細胞的浸潤并提高ICIs的抗癌效力。由此，聯(lián)合小分子抑制劑、化療等治療可能使“冷”腫瘤轉換為“熱”腫瘤進而提高ICIs對于Rb的療效。

已有學者發(fā)現(xiàn)，單一使用PD-1/PD-L1 的抑制劑或與CTLA-4的抑制劑等聯(lián)合應用治療UM及mUM的效果欠佳，其可能原因為UM突變負荷低即免疫原性低、T細胞浸潤少、以及PD-L1低表達等[11]。目前新免疫檢查點及聯(lián)合治療UM的研究仍在進行中，比如：T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3和淋巴細胞激活基因3等；ICIs與其他療法聯(lián)合使用也正在開展臨床試驗[12]。

眼內惡性腫瘤的低免疫原性是ICIs反應差及產(chǎn)生耐藥的最主要原因，因此與其他治療如化療、放療等傳統(tǒng)療法相聯(lián)合以發(fā)揮協(xié)同增效作用可能是未來的研究方向。另外，個體化腫瘤活組織檢查及無創(chuàng)腫瘤監(jiān)測方法如液體活檢樣本中的循環(huán)腫瘤DNA等新興檢測技術的發(fā)展有利于判斷眼內腫瘤生物學亞型，為新的免疫檢查點標志物、ICIs治療反應的預測因素等提供更多有效的信息。

1.2 過繼免疫治療

通常在沒有外界干預下，人體可以識別并殺傷腫瘤細胞的免疫細胞數(shù)目非常少。AIT通過向腫瘤患者輸入經(jīng)體外擴增、激活或修飾的免疫活性細胞如淋巴細胞或外周血單核細胞等，使其可以特異性識別腫瘤相關抗原，進而達到殺傷腫瘤的目的。AIT根據(jù)其發(fā)展歷程依次包括自體淋巴因子激活的殺傷細胞、自體腫瘤浸潤性淋巴細胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、自然殺傷細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞、細胞毒性T細胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）以及細胞受體基因工程改造的T細胞（T cell receptorgene engineered T-cell，TCR-T）和嵌合抗原受體T細胞（Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）等[13]。目前用于眼內惡性腫瘤的AIT包括CAR-T、TIL、TCR-T等。

Rb免疫微環(huán)境中浸潤的免疫細胞及腫瘤細胞表面主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）均較少，因此與之相關的TIL及依賴腫瘤MHC的TCR-T療法的相關研究比較少見。Rb的CAR-T研究相對較多，目前Rb的CAR-T治療主要基于2個靶點——神經(jīng)節(jié)苷脂GD2和CD171[14]。Sujjitjoon等[15]開發(fā)了GD2 CAR-T的局部免疫治療制劑，并證明其在Rb小鼠模型中有較好的抗腫瘤作用。Wang等[16]利用GD2 CAR-T聯(lián)合可注射的水凝膠，在玻璃體腔給藥后，延長了CAR-T的滯留時間并防止其擴散以減少脫靶效應。

部分學者認為UM的免疫原性高于Rb等腫瘤，可能更易接受TIL療法[17]。在一項II期臨床試驗中，35%的UM患者單次輸注TIL后腫瘤消退[18]。另外一項I期臨床試驗中，SLC45A2基因編碼的膜相關黑素細胞分化抗原特異性自體CD8+T淋巴細胞與環(huán)磷酰胺、IL-2聯(lián)合治療mUM的療效正在驗證中[19]。雙特異性融合蛋白Tebentafusp是一種基于免疫動員抗癌單克隆T細胞受體的TCR-T技術，可定向于UM細胞表面HLA-A2提呈的黑色素瘤分化抗原gp100蛋白的抗原肽以及靶向T細胞的CD3 蛋白，將T細胞募集到腫瘤中。在2項mUM臨床試驗中，Tebentafusp均收獲了良好的治療效果，且不良反應是短暫可控的[20]。在UM的CAR-T研究方面，F(xiàn)orsberg等[21]在2種葡萄膜黑色素瘤小鼠模型中應用了HER2 CAR-T，結果表明腫瘤體積均有減小。

目前，AIT應用于眼內惡性腫瘤時，需克服多方面的挑戰(zhàn)。首先，眼內惡性腫瘤為實體瘤，為改善T細胞遷移和腫瘤浸潤情況，需共表達趨化因子等提高腫瘤浸潤能力。其次，相對于血液腫瘤，眼內惡性腫瘤的基因組更加不穩(wěn)定，導致異質性增加，進而產(chǎn)生腫瘤抗原逃逸。因此，設計AIT時應構建多靶點以增強抗腫瘤療效。另外，與血液腫瘤的靶點大多單一且特異不同，眼內惡性腫瘤中腫瘤特異性抗原很少，目前發(fā)現(xiàn)的眼內惡性腫瘤高表達的抗原如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3 等多為腫瘤相關抗原，在正常組織中也有表達，基于此類抗原的AIT很容易產(chǎn)生細胞毒性。因此，發(fā)掘新靶點、提高AIT的親和性和敏感性可以更有效地對靶點低表達的腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用。此外，與皮膚黑色素瘤相比，UM通常包含少量的腫瘤新抗原，亟需探索更個性化的AIT治療方法來克服這一障礙。最后，針對眼內惡性腫瘤的免疫抑制微環(huán)境，聯(lián)合ICIs等抗免疫抑制的方法，可能會增強T細胞對免疫抑制的抵抗力。

1.3 腫瘤疫苗治療

腫瘤疫苗是指將腫瘤抗原的不同種形式，如腫瘤相關蛋白或多肽、表達腫瘤抗原的免疫細胞等導入患者體內，克服腫瘤免疫抑制狀態(tài)，重新激活腫瘤特異性T細胞，并增加腫瘤反應性T細胞應答的多樣性，從而起到殺傷腫瘤的效果。另外，腫瘤疫苗還可以通過免疫記憶實現(xiàn)持續(xù)的腫瘤殺傷。目前，腫瘤疫苗在Rb中的研究較少。一種靶向神經(jīng)節(jié)苷脂NcGM3 的抗獨特性抗體疫苗-雷妥莫單抗在神經(jīng)外胚層腫瘤患者中療效得到了驗證。但該研究僅納入1例Rb患兒，對于Rb療效的普適性還有待進一步研究[22]。

在UM的治療方面，1項納入14例mUM患者的前瞻性研究表明，接種了載有gp100 肽和酪氨酸酶腫瘤肽的自體樹突狀細胞的患者顯示出良好的治療效果[23]。近年來，基于mRNA的腫瘤疫苗顯示出了巨大的潛力?，F(xiàn)已開展多項基于RNA腫瘤疫苗治療UM的工作：1 項III期臨床試驗（NCT01983748）正在招募3號染色體單體呈陽性的UM患者，患者將接種載有自體腫瘤RNA的樹突狀細胞；1項新的I期臨床試驗（NCT04335890）正在招募mUM患者，患者將接種載有腫瘤mRNA和驅動突變的RNA的樹突狀細胞以評估其療效。

由于眼睛是獨特的“免疫特權”器官，容易對腫瘤相關抗原產(chǎn)生免疫耐受，針對眼內惡性腫瘤組織的個性化腫瘤疫苗可能是未來研究的發(fā)展方向之一。眼內惡性腫瘤細胞中發(fā)生的突變可以產(chǎn)生新的自身抗原表位，稱為新表位或新抗原，屬于腫瘤特異性抗原的一種。相較于傳統(tǒng)腫瘤相關抗原的疫苗，新抗原的個性化腫瘤疫苗具有如下優(yōu)點：新抗原僅由腫瘤細胞表達，因此靶向性更高；新抗原源于體細胞突變的新表位，可能避開T細胞對自身表位的中心耐受，從而誘導對腫瘤的免疫反應。除此之外，更多腫瘤疫苗聯(lián)合其他療法的相關研究亟待開展。

2 小分子靶向抑制劑治療

隨著腫瘤生物學的飛速發(fā)展，抗腫瘤藥物的研發(fā)重點正在從傳統(tǒng)的細胞毒性藥物轉移到針對具有靶點特異性的新一代抗腫瘤藥物。SMI通過使用藥物或其他小分子物質特異靶向腫瘤周期相關因子、組蛋白去乙酰酶抑制劑、泛素-蛋白酶體通路等，阻斷癌細胞的生長和擴散。不同于傳統(tǒng)細胞毒性藥物，小分子靶向抑制劑只對腫瘤細胞起殺傷抑制作用，因此具有靶向性強、毒副作用低等特點。研究表明，Rb中差異最大的分子途徑是鼠雙微粒體2/4-P53（Murine double minute 2/4, MDM2/MDM4）通路。MDM2/MDM4 可以抑制Rb中P53 的表達，并且可以促進P53 的泛素化降解[24]。Nutlin-3是一種選擇性MDM拮抗劑，可特異性阻斷P53 與MDM2/4 的相互作用，對Rb細胞系和異種移植腫瘤模型均具有較好的殺傷作用[25]。組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase, HDAC）抑制劑可以通過抑制HDAC活性來增強P53 乙?；?，抑制MDM2 介導的P53 泛素化[26]。在過去的幾年中，干擾表觀遺傳調控的新療法在Rb中逐漸涌現(xiàn)：Zhang等[27]通過多組學研究表明伴隨Rb1基因突變，表觀遺傳變化如SYK的上調共同參與了Rb腫瘤的進展；HDAC抑制劑可以抑制SYK與HDAC結合來調節(jié)轉錄，進而促使細胞凋亡。多數(shù)Rb是由遺傳性基因突變引起的，少數(shù)非遺傳性突變的Rb是由MYCN擴增引發(fā)的。BET蛋白抑制劑能夠競爭性結合轉錄復合物活性結合區(qū)，使其從染色質區(qū)解離，從而抑制下游分子MYCN的表達。

在UM患者中，GNAQ/GNA11 基因突變率超過90%，是SMI治療的理想靶點。對于具有此突變的UM患者而言，可使用特異的GαQ和Gα11 蛋白抑制劑或阻斷Gα蛋白下游的信號通路傳導的藥物來進行靶向治療。其中，最常見的Gα蛋白下游的信號通路包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號通路和Yes相關蛋白信號通路等[28]。BAP1是一種位于染色體3p21.1上的腫瘤抑制基因，其缺失與UM的轉移高度相關[29]。BAP1缺失導致組蛋白H2A過度泛素化和DNA甲基化，可通過HDAC抑制劑及應用溴結構域蛋白4的抑制劑來逆轉[30]。SMI與其他治療方法如ICIs的組合有望為眼內惡性腫瘤的治療開辟新道路。近年來，無創(chuàng)液體活檢技術不斷發(fā)展，為動態(tài)分析眼內惡性腫瘤基因組及更好地發(fā)揮SMI抗腫瘤效能帶來了新的希望。

3 溶瘤病毒治療

溶瘤病毒是一種具有復制能力的病毒，能夠選擇性地感染體內外的腫瘤細胞，并在腫瘤中大量復制最終使細胞溶解。隨著腫瘤細胞的溶解，釋放出的大量病毒能夠感染更多的腫瘤，進而產(chǎn)生病原相關分子模式、損傷相關分子模式等刺激DC細胞的抗原遞呈誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤反應。溶瘤病毒可以增強腫瘤的免疫原性、有效改善腫瘤微環(huán)境、對抗腫瘤免疫失調以及增強腫瘤細胞對放療和化療的敏感性。溶瘤病毒療法還可以與基因療法相結合，以增強靶向性以及抗腫瘤效應。目前，溶瘤性單純皰疹病毒1型（HSV-1）、塞內加谷病毒（SVV-001）、腦心肌炎病毒（EMC）等在體外和體內實驗中均被證明可有效治療局部侵襲性和轉移性Rb。在與基因治療相結合的溶瘤病毒療法中，一種轉基因的5型溶瘤腺病毒VCN-01可以選擇性地在Rb1通路功能障礙引起的具有高水平轉錄因子E2F-1的細胞中復制，而不會在正常視網(wǎng)膜中復制[31]。VCN-01的Ⅰ期臨床研究正在進行中，初步結果顯示其在1 例接受該治療的Rb患者體內展示出較好的抗腫瘤活性[32]。傳統(tǒng)治療（如化療和放療等）可能會增強免疫系統(tǒng)的免疫抑制，從而使得機體允許腺病毒在宿主中復制所產(chǎn)生的效應。因此，對于Rb這類“冷”腫瘤而言，溶瘤病毒療法與傳統(tǒng)療法的聯(lián)合應用將會是未來的研究方向。

在UM異種腫瘤移植模型中，注射溶瘤HSV-1 的小鼠中局部腫瘤和遠端皮下腫瘤體積均縮小。更重要的是局部腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)為巨噬細胞相關因子干擾素-γ的表達增加，巨噬細胞從M2 表型向M1 表型轉變。Kimpel等[33]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)人類黑色素瘤對水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）敏感。VSV聯(lián)合轉基因療法治療mUM患者的I期臨床試驗（NCT03865212）正在進行中。溶瘤腺病毒 （Oncolytic adenovirus，OAd）在激活天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，還可以誘導DC細胞成熟和T細胞活化，從而在宿主體內激發(fā)體液和細胞免疫應答。一項UM體外實驗表明，OAd H101與烷化劑聯(lián)合應用可阻斷細胞周期，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[34]。隨著生物技術的發(fā)展，更有效、更安全的溶瘤病毒療法將是未來的發(fā)展方向，如應用具有眼內惡性腫瘤趨向性的載體細胞等增強溶瘤病毒的腫瘤趨向性，采用構建陽離子脂質體包裹溶瘤腺病毒等方式提高生物安全性、聯(lián)合轉基因提升其療效等。

4 基因治療

基因治療是指在患者的腫瘤細胞中插入某種特定的基因片段、核酸物質或克隆基因，從而改變腫瘤細胞的行為，進而達到治療目的?；蛑委熤饕ɑ虺聊委?、抑癌基因治療及自殺基因治療等。相較于其他療法，基因治療可以直接改變癌細胞遺傳物質，具有適應證廣和靶向性強等優(yōu)點，且眼睛特有的生理特性更是為眼內注射治療性病毒載體提供了有利的環(huán)境。

Rb常由Rb1 抑制基因的雙等位基因失活引發(fā)，因此Rb1是常見的Rb基因治療靶點[35]。除Rb1外，CKS1B是另一個針對Rb基因治療的靶點。Zeng等[36]證明CKS1B在Rb細胞和組織中過度表達，沉默CKS1B基因可以抑制Rb細胞的生長和侵襲，同時抑制Rb的血管生成。除了基因沉默治療和抑癌基因治療，自殺基因也應用于Rb的研究中，并主要用于玻璃體腔內種植的晚期Rb治療。Yi等[37]證明自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷系統(tǒng)（Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV）可導致Rb細胞系的死亡。

Jager等[38]發(fā)現(xiàn)了6 個變異基因與UM相關，分別是GNAQ、GNA11、BAP1、EPB41L3、EIF1AX和SF3B1，為該病的基因診斷與治療提供了理論基礎。除此之外，眼睛有適合基因治療的3個主要特征即局部注射的可及性、利于適應病毒載體抗原性的免疫特權狀態(tài)以及保護其他器官免受累及的血視網(wǎng)膜屏障，因此應用基因治療的前景光明。在過去10年中，基因治療的方向在不斷發(fā)展，逐漸摒棄將經(jīng)過基因改造的健康基因回輸?shù)饺梭w內，轉為精確修復細胞內的異?；?。CRISPR-Cas9 的發(fā)現(xiàn)更是為基因治療的持續(xù)創(chuàng)新提供了動力。理論上來說，基因治療可從根本上治療疾病，但如何提高基因轉染效率、提高基因表達效率以及降低其對機體器官功能的影響仍需進一步探索。

5 結語與展望

生物治療在眼內惡性腫瘤的應用研究已有很多成功的案例，給腫瘤患者帶來了新的希望。生物治療與傳統(tǒng)治療相比，具有特異性更強、抗腫瘤更徹底等優(yōu)勢，可使正常組織的損傷達到最小化，是潛在替代放療、化療等傳統(tǒng)療法的新選擇，為早期眼內惡性腫瘤帶來了新的治療模式。同時，生物治療可殺傷組織內殘余的微小病灶，有效防止癌癥復發(fā)及轉移，為玻璃體腔播散型Rb以及mUM等晚期眼內惡性腫瘤患者帶來了保住眼球的希望。但是，生物治療目前處于初步發(fā)展階段，在臨床上仍然不能完全取代傳統(tǒng)治療方式。

生物治療在眼內惡性腫瘤治療的應用中亟需解決的問題包括：發(fā)掘更多有效的腫瘤分子靶標，更精準有效地提高對腫瘤的殺傷力；生物治療的效果存在較大的個體化差異，ctDNA等新型診斷模式有助于無創(chuàng)腫瘤基因組分析，為尋找能夠有效預測治療效果的生物標志物提供幫助，對于生物治療在臨床中的應用具有重要的意義；將生物治療與化療等傳統(tǒng)療法聯(lián)用，發(fā)揮協(xié)同增效作用，可以探索出新的、更有效的精準治療模式；根據(jù)生物治療的性質、腫瘤的病理類型和發(fā)展趨勢，結合患者特征有計劃地治療，可以最大限度地增加抗腫瘤效力、減少治療造成的不良反應；眼內惡性腫瘤的治療目標從最初的保命到保住眼球到現(xiàn)在的保視力，如何通過生物治療最大限度地保留患者視力將是未來的趨勢。另外，大型的多中心、雙盲臨床試驗將提供可靠的循證醫(yī)學依據(jù)，是眼內惡性腫瘤生物治療的必經(jīng)之路。伴隨著生物技術的進步以及更多循證依據(jù)的產(chǎn)生，眼內惡性腫瘤的生物治療必將迎來更美好的明天。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明李雨心：調研文獻，論文撰寫，對編輯部的修改意見進行修改。魏煒：選題設定，終審論文，對編輯部的修改意見進行核修。陶勇：設計方案，終審論文，根據(jù)編輯部的修改意見進行核修。王曉君：設計框架，論文修訂，對編輯部的修改意見進行核修