范彬，彭騰騰，王 信，沈 薇，馬趣環(huán)，王新娣，劉東彥，尹盼盼，李海燕，石曉峰,

（1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000）

牡丹（Paeonia suffrutcosa）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.Moutan）多年生落葉灌木，因其花色艷麗，花朵碩大，被譽為“花中之王”[1?2]。牡丹除具有重要的觀賞價值外，其根、皮、花和籽均具有很高的藥用、營養(yǎng)和食用價值[3]。牡丹花粉營養(yǎng)豐富，含所有人體所需的常量、微量元素，且遠(yuǎn)高于牡丹花瓣和牡丹籽油，蛋白含量遠(yuǎn)高于其他40 種常見的植物類花粉[4?7]。牡丹花粉雖具有較高的保健價值，目前開發(fā)的相關(guān)產(chǎn)品有口服液[8]、酸奶[9]、保健面條[10]等，對其開發(fā)利用仍存在產(chǎn)品形式單一、精深加工滯后等問題[11]。隨著人們消費習(xí)慣和健康理念的轉(zhuǎn)變，無糖食品越來越受到消費者的重視[12]，無糖片糖是近年來市場上出現(xiàn)的一種新型的便攜食品，具有環(huán)保、無糖、保質(zhì)期較長、食用方便并具有功能性等特點[13]。實驗中采用糖醇為輔料，對牙齒具有良好的保健作用[14]，其中異麥芽酮糖醇具有高穩(wěn)定性、低熱量、甜味自然、吸濕性小等特性[15]，更適合于功能性食品的開發(fā)。

本文以牡丹花雄蕊上的孢子、牡丹的繁殖細(xì)胞，即牡丹花粉為原料，研制一種機械化生產(chǎn)、成本低、服用攜帶方便，易被特殊人群（如三高、糖尿?。┫M，適合各年齡段的人食用的花粉產(chǎn)品，并對牡丹花粉片糖的體外抗氧化性進(jìn)行研究，為延伸牡丹的進(jìn)一步精深加工和開發(fā)提供實驗室依據(jù)，以確保牡丹花粉藥食兩用價值得到充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹花粉 蘭州新區(qū)中川牡丹園基地2022 年6月采收；木糖醇 山東福田藥業(yè)有限公司；異麥芽糖醇 廣西維科特生物技術(shù)有限公司；蘋果酸 安徽雪狼生物科技股份有限公司；阿斯巴甜 江蘇漢光甜味劑有限公司；檸檬酸 濰坊英軒實業(yè)有限公司；甘露醇 青島明月海藻有限集團(tuán)有限公司；以上輔料均為食品級；DPPH 和ABTS 美國Sigma 公司；抗壞血酸（VC）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TDP-1.5 型單沖壓片機 上海綠翊機械造有限公司；YD-20KZ 型片劑硬度儀 天津市天大天發(fā)科技有限公司；SHZ-8 型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；ZB-ID 型智能崩解儀 天河醫(yī)療儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹花粉片糖的制備 將各原輔料粉碎過80 目篩，取適量牡丹花粉與適量填充劑（木糖醇-甘露醇）、甜味劑（異麥芽糖醇）和矯味劑（阿斯巴甜-檸檬酸-蘋果酸）粉碎混合均勻，加70%乙醇潤濕，混合攪拌，所得軟材過18 目篩制粒，將制粒好的物料于50 ℃烘箱干燥，干燥后的物料經(jīng)30 目篩整粒，整粒后的顆粒加入適量的硬脂酸鎂混合壓片[16]，即得。

1.2.2 單因素實驗 查閱文獻(xiàn)和預(yù)實驗基礎(chǔ)上，選擇木糖醇-甘露醇（4:1，g/g），阿斯巴甜-檸檬酸-蘋果酸比例（1:1:1，g/g）用量8%，潤滑劑硬脂酸鎂用量1%，在填充劑、甜味劑、牡丹花粉各用量分別為3.0、0.5、0.5 g 的條件下，按“1.2.1”項下的方法制備牡丹花粉片糖，選擇填充劑用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g）、甜味劑用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g）、牡丹花粉用量（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 g）進(jìn)行單因素實驗。

1.2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken 試驗設(shè)計原理[17]，以牡丹花粉（A）、填充劑（B）、甜味劑（C）用量為自變量，以質(zhì)量評價的綜合評分（R）作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，對牡丹花粉片糖的配方工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of RSM test

1.2.4 牡丹花粉片糖質(zhì)量評價方法

1.2.4.1 感官指標(biāo)評分 牡丹花粉片糖的感官指標(biāo)包括外觀和口感評價[18]，隨機抽取10 名志愿者進(jìn)行評價，其中裂片、松片或過酸或過甜、花粉味重，記0～3 分；表面粗糙、花片或微酸、微甜，記4～6 分；表面光潔、有光澤或酸甜可口，記7～9 分。

1.2.4.2 硬度評分標(biāo)準(zhǔn) 將牡丹花粉片糖徑向固定于片劑硬度儀兩橫桿之間，活動柱桿自動沿水平方向加壓，當(dāng)牡丹花粉片糖碎裂，記錄硬度值，每組測6 片，計算平均值。按測得的硬度值的大小范圍給予評分，硬度小于150 N，記1 分；150～200 N 之間，記2 分；大于200 N，記3 分，滿分3 分。

1.2.4.3 崩解時限評分標(biāo)準(zhǔn) 按《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）崩解時限檢查法[19]測定，崩解時限小于5 min 或大于15 min，記1 分；5～8 min 或10～15 min，記2 分；8～10 min，記3 分，滿分3 分。

1.2.4.4 質(zhì)量評價方法的建立 以牡丹花粉片糖的感官評價、硬度、崩解時限為評價指標(biāo)，綜合評分=感官評價×0.6+硬度×0.2+崩解時限×0.2[20]。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 模擬人體消化液的配制 參考相關(guān)文獻(xiàn)[20]，配制體外抗氧化活性所需消化液，其中模擬唾液中α-淀粉酶、模擬胃液中胃蛋白酶和模擬腸液中胰蛋白酶的酶活力分別達(dá)到200、2000 和75 U/ mL。

1.2.5.2 模擬人體消化樣品的制備 取適量牡丹花粉片糖于研缽中，研磨成細(xì)粉，精密稱定2.0 g，于錐形瓶，加入模擬唾液25 mL，密閉，于搖床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min 后，沸水浴滅酶10 min，快速冷卻，加入無水乙醇25 mL，離心（5000 r/min），取上清液于50 mL 容量瓶中，超純水定容至刻度[21]。模擬胃液和腸液的消化樣品制備時，相同條件下孵育2 h，其余制備方法同模擬唾液的消化樣品的制備[21?22]。

1.2.5.3 模擬人體累加消化樣品的制備 取適量牡丹花粉片糖于研缽中，研磨成細(xì)粉，精密稱定2.0 g，于錐形瓶，加入模擬唾液25 mL，密閉，于搖床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min 后，5 mol/L HCL 溶液調(diào)pH約1.2，加入胃蛋白酶0.08 g，孵育2 h，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 約6.8，加入胰蛋白酶0.0125 g 和膽酸鈉0.625 g，孵育2 h，待模擬人體消化完畢后，與“1.2.5.2”項下相同條件下滅酶、冷卻和離心，制備累加消化樣品[23?24]。

1.2.5.4 DPPH 自由基清除能力測定 分別吸取一定量的各模擬消化樣品、累加消化樣品及對照品VC溶液，配制成2、6、10、14、18 mg/mL 的溶液[20]，準(zhǔn)確吸取上述溶液各1 mL 于10 mL 的比色管中，加入2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液和2 mL 超純水，避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比，于517 nm 處測定樣品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[25?26]，計算牡丹花粉片糖各消化樣品對DPPH 自由基的清除率MDPPH（%），清除率公式為：

1.2.5.5 ABTS+自由基清除能力測定 分別吸取一定量的模擬消化樣品、累加消化樣品及對照品VC溶液，配制成1、2、3、4、5、6 mg/mL 的溶液，準(zhǔn)確吸取上述溶液各1 mL 于10 mL 的比色管中，加入2 mL ABTS 工作液（2 份35 mol/L 的ABTS 溶液和1 份25 mol/L 的K2S2O8溶液混勻，避光12 h，臨用前用無水乙醇稀釋，吸光度0.6±0.1）和1 mL 超純水，以超純水為參比，于734 nm 處測定樣品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[16]，計算牡丹花粉片糖各消化樣品對ABTS+自由基的清除率MABTS（%），清除率公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert.V 8.0.6 軟件對響應(yīng)面模型數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合；使用 SPSS 22.0 軟件各項試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 填充劑用量的篩選 結(jié)果見圖1。隨填充劑用量的增大，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，所制軟材細(xì)粉逐漸增多，顆粒均勻，易于制粒，硬度變小，崩解時間明顯降低；所含的木糖醇成分的增多，片劑酸味逐漸變?nèi)?。?dāng)填充劑用量達(dá)到3.0 g 時，制粒和壓片效果較好，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分最高。綜合上述，選擇填充劑用量2.0、3.0、4.0 g 三個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖1 填充劑用量的考察Fig.1 The investigation of filler dosage

2.1.2 甜味劑用量篩選 結(jié)果見圖2。固定填充劑用量，隨著甜味劑用量的逐漸增大，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分上升趨勢平緩，軟材的黏性逐漸變小，所制得的顆粒均勻，牡丹花粉片糖的硬度適中，當(dāng)甜味劑增大至2.0 g 時，軟材的黏性小，細(xì)粉較多，牡丹花粉片糖的硬度小，崩解時限變小，使牡丹花粉片糖的酸味逐漸變?nèi)?，甜味增加明顯。綜合上述，選擇甜味劑用量1.0、1.5、2.0 g 三個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖2 甜味劑用量的考察Fig.2 The investigation of sweetening agent dosage

2.1.3 牡丹花粉用量考察 結(jié)果見圖3。隨著花粉用量的增加，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分下降的趨勢明顯，制得的顆粒細(xì)粉多，硬度變小，出現(xiàn)松片或花片現(xiàn)象，牡丹花粉片糖的花粉味加重，澀感逐漸增強，當(dāng)牡丹花粉用量為0.75 g 時，牡丹花粉片糖的酸甜度適中，口感和硬度適中。綜合上述，選擇牡丹花粉用量0.50、0.75、1.00 三個水平進(jìn)行響應(yīng)面實驗。

圖3 牡丹花粉用量的考察Fig.3 The investigation of peony pollen dosage

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.2.1 方案設(shè)計及試驗結(jié)果 根據(jù)表1 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，研究牡丹花粉、填充劑、甜味劑與牡丹花粉片糖的綜合評分之間的關(guān)系，實驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert.V 8.0.6 軟件對表2 的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得牡丹花粉片糖對牡丹花粉（A）、填充劑（B）、甜味劑（C）用量的二次多項回歸模型方程為：R=?25.0388+42.99400A+6.98350B+6.65200C?2.07000AB+2.30000 AC+1.106500BC?29.71600A2?1.10725B2?3.54900C2，分析實驗結(jié)果見表3。

表3 回歸統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Result of regression statistical analysis

由表3 可知，三個因素中填充劑對牡丹花粉片糖配方工藝影響最小。模型的F=164.37（P<0.0001），表明模型方程具有高度的顯著性；失擬項F=3.50（P>0.05），表明模型擬合合理[27]。模型的決定系數(shù)為R2=0.9953，說明回歸方程擬合度高、誤差小[28]，表明了該模型可用于牡丹花粉片糖配方工藝的優(yōu)化。試驗結(jié)果顯示，A（牡丹花粉）、B（填充劑）、C（甜味劑）、AB、BC、A2、B2和C2項具有極其顯著的影響（P<0.05），可以得出各項考察因素對牡丹花粉片糖的工藝影響除具有線性關(guān)系外，還存在一定的交互綜合影響，可采用該線性回歸方程對其配方工藝進(jìn)行分析與預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面試驗分析與優(yōu)化 圖4 為各兩兩實驗因素對牡丹花粉片糖配方工藝綜合評分的響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)面圖均為凸形曲面圖，存在最高點，響應(yīng)面曲線圖的陡峭程度直觀反映了各因素工藝的影響，坡度越陡，說明實驗因素對綜合評分的影響越大，坡度平緩則影響較小[29]，等高線圖中，兩兩交互因素之間交互作用的強弱表現(xiàn)為圖中橢圓程度和密集程度，等高線較密，趨于橢圓形交互作用越強[30]。由此可見，因素A 和因素C 對牡丹花粉片糖配方工藝感官評分的影響最大；各因素交互作用對牡丹花粉片糖配方工藝感官評分的影響的顯著性，依次為：BC>AB>AC，這與方差分析結(jié)果相一致。

圖4 各因素用量交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface maps and contour lines of the influence of various factors on the comprehensive scoring

2.2.4 最佳配方工藝優(yōu)化與驗證 通過回歸模型方程的預(yù)測，得出牡丹花粉片糖的最佳配方為：牡丹花粉0.68 g、填充劑3.32 g、甜味劑1.65 g，考慮到實驗條件的可操作性，將其參數(shù)進(jìn)行修正，確定的最佳配方比為牡丹花粉：牡丹花粉0.7 g，填充劑3.3 g，甜味劑1.7 g。在此最優(yōu)配比條件下進(jìn)行驗證實驗，平行實驗3 次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡丹花粉片糖的綜合評分為6.39，模型預(yù)測值為6.42，兩者吻合良好。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由圖5 可見，牡丹花粉片糖各模擬消化樣品均對DPPH 自由基有一定的清除力，其清除能力依次為：腸液消化樣品>唾液消化樣品>胃液消化樣品，腸液消化樣品對DPPH 自由基清除率的IC50值最小，表明抗DPPH 自由基活性成分主要在腸液中消化，累加消化樣品的清除率最高值為91.56%，IC50值為5.720±0.478 mg/mL。

圖5 模擬各消化樣品對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of simulated digestion sample to DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 如圖6 可見，牡丹花粉片糖各模擬消化樣品均對ABTS+自由基有一定的清除力，其清除能力依次為：胃液消化樣品>腸液消化樣品>唾液消化樣品，胃液消化樣品對ABTS+自由基清除率的IC50值最小，表明抗ABTS+自由基活性成分主要在胃液中消化，累加消化樣品的清除率最高值為96.42%，IC50值為1.451±0.114 mg/mL。

圖6 模擬各消化樣品對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of simulated digestion sample to ABTS+ free radical

3 結(jié)論

牡丹花粉片糖的生產(chǎn)受填充劑、潤滑劑和甜味劑用量等諸多因素的影響，在單因素實驗中，選擇填充劑木糖醇-甘露醇比例為4:1，矯味劑用量為8%，潤濕劑為70%乙醇，潤滑劑硬脂酸鎂用量為1%，進(jìn)行濕法制粒壓片。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到牡丹花粉片糖配方工藝為：將0.7 g 牡丹花粉，3.3 g 填充劑和1.7 g 甜味劑混合均勻，加入70%乙醇潤濕制軟材，過18 目篩制粒，50 ℃條件下干燥，30 目篩整粒，所得顆粒與1%硬脂酸鎂混合后壓片，得到牡丹花粉片糖，在此配方條件下制作的牡丹花粉片糖片面光滑、硬度適中、口感較好，無明顯澀感，質(zhì)量評價綜合評分較高，符合相關(guān)要求。

為評價牡丹花粉片糖抗氧化活性，實驗測定了牡丹花粉片糖模擬人體各消化樣品的DPPH 和ABTS+自由基的清除率。結(jié)果顯示，腸液消化樣品對DPPH自由基的清除能力較強，而胃液消化樣品對ABTS+自由基的清除能力較強，其累加消化樣品的最高清除率分別為91.56%和96.42%。