楊春蘭，麥琬婷，陳圣杰，葉 勇, ，王 捷,

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021；2.玉林市第一人民醫(yī)院，廣西玉林 537400）

余甘子是壯族習(xí)用藥材，為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實。其味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效，民間及臨床上常將其用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干等[1]。據(jù)報道，余甘子果實具有多種藥理特性，如抗氧化[2?3]、解熱鎮(zhèn)痛[4]、抗腫瘤[5?6]、抗炎[7]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[8]、肝保護作用[9?10]、胃保護作用[11?12]、保護缺血-再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[13]、保護UVB 誘導(dǎo)的光老化等[14]。余甘子作為重要的藥食同源品種，其主要有效成分為酚類，包括酚酸類、鞣質(zhì)類和黃酮類，包括沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子酸和訶子聯(lián)苯酸等[15?17]。而余甘子葉作為余甘子重要的藥用部位，具有免疫調(diào)節(jié)[18?19]、抗腫瘤[20]、抗炎[21]、抗氧化[22]、抗結(jié)直腸癌[23]等作用，被廣泛應(yīng)用于臨床糖尿病、艾滋病與皮膚病等的治療。有研究表明，余甘子葉主要含酚酸類、黃酮類、有機酸、多糖、三萜等活性成分[24?26]。

目前，有關(guān)余甘子葉的研究主要在化學(xué)成分的提取分離和生物活性研究等方面，對其最佳采收期的研究還未見報道，而酚酸類成分是余甘子葉的主要活性成分之一，活性成分的含量隨著自然環(huán)境的改變而改變，比如氣候、土壤和水分等。采收期不同，藥材的成分含量也會有所差異。余甘子葉的質(zhì)量控制方法目前主要有HPLC 測定余甘子葉中槲皮素、山奈酚的含量[27?28]，分光光度法測定總黃酮含量[29]，但同時測定酚酸類成分如表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸和訶子酸等的含量卻未見報道。在本課題組前期的研究中，已通過HPLC 建立余甘子葉指紋圖譜，并指認了表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸和訶子酸5 種酚酸類成分。因此，在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究建立了HPLC 同時測定余甘子葉5 種酚酸類成分含量的方法，并結(jié)合主成分分析方法分析其含量變化，以確定余甘子葉的最佳采收期，為深入研究開發(fā)利用余甘子葉提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子葉 采集于廣西貴港市平南種植基地，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)中藥教研室韋妍妍老師鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的新鮮葉，樣品采摘后經(jīng)低溫鼓風(fēng)干燥，粉碎，過40 目篩，避光密封保存，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

表沒食子兒茶素（HPLC≥98%）上海源葉生物科技有限公司；柯里拉京（HPLC>98%）、鞣花酸（HPLC≥98%）成都瑞芬思生物科技有限公司；訶子聯(lián)苯酸（HPLC 98%）、訶子酸（HPLC 98%）成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司。

LC-20A 島津高效液相色譜儀 日本島津公司；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CD-UPH-II-20L 超純水器 成都優(yōu)越科技有限公司；XT-YM-6001 粉碎機 永康市共慶工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 參照文獻[30]優(yōu)化得到供試品溶液的制備方法：將余甘子葉粉碎，過40 目篩，于陰涼處密封保存?zhèn)溆谩Ｈ∮喔首尤~粉末約0.5 g置于50 mL 具塞錐形瓶內(nèi)，精密稱定，精密加入30%甲醇20 mL，稱定重量，超聲（500 W，60 kHz）30 min，靜置冷卻，稱定重量，用30%甲醇補足減失重量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過至1.5 mL 進樣瓶，即得供試品溶液。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸和訶子酸對照品適量，精密稱定，甲醇溶解、定容，配制成濃度分別為551.0、622.5、715.0、520.0、508.0 μg·mL?1的混合對照品溶液。

1.2.3 色譜條件 參照冀靜等[31]的方法。采用Inertsil ODS-3 C18色譜柱（5 μm，4.6×250 mm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～10 min，5%～10% A；10～20 min，10%～13% A；20～30 min，13%～17% A；30～40 min，17%～20% A；40～45 min，20%～25% A；45～65 min，25%～85% A；65～80 min，85%～5% A；80～95 min，5% A。二極管陣列全波長掃描，254 nm，流速：1.0 mL·min?1，進樣量：10 μL。

1.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取“1.2.1”和“1.2.2”項下供試品溶液、混合對照品溶液適量，按“1.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

1.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容稀釋成系列濃度溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。

1.2.6 精密度試驗 取編號為S4 的余甘子葉1 份，按“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 取編號為S4 的余甘子葉1 份，按“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，記錄峰面積。

1.2.8 重復(fù)性試驗 取編號為S4 的余甘子葉6 份，按“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。

1.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的編號為S4 的余甘子葉6 份，每份0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入含量相當(dāng)?shù)幕旌蠈φ掌啡芤?，按?.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積，計算回收率。

1.2.10 樣品含量測定 定量方法采用外標法中的工作曲線法。分別取不同采集時間的余甘子葉按“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣分析，計算含量，每個樣品取兩份，每份平行測定兩次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文采用SPSS 24.0、Microsoft Excel 2010、Origin2018 軟件處理數(shù)據(jù)及繪制圖表，含量測定中每個樣品取兩份，每份平行測定兩次，數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察結(jié)果

結(jié)果見圖1。各成分理論板數(shù)不低于3000，分離度均大于1.5。

圖1 對照品（A）及樣品（B）HPLC 色譜圖（254 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A) and sample (B)(254 nm)

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

以濃度（μg·mL?1）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析，得標準曲線方程，見表2。5 個成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 余甘子葉中5 種成分標準曲線Table 2 Calibration curves of five constituents of Phyllanthus emblica L.

2.3 精密度試驗結(jié)果

計算得到表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸、訶子酸峰面積的RSD 分別為1.02%、1.09%、1.88%、0.83%、1.44%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

計算得到表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸、訶子酸峰面積的RSD 分別為1.91%、1.01%、2.27%、1.15%、1.49%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

計算得到表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸、訶子酸的平均含量分別為1.51、1.93、2.49、2.54、49.80 mg·g?1，RSD 分別為1.98%、2.05%、1.09%、0.63%、1.14%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗結(jié)果

通過計算得出表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸、訶子酸的平均加樣回收率分別為98.30%、101.22%、99.59%、98.73%、99.76%，RSD分別為2.66%、1.61%、0.43%、1.59%、0.60%，見表3。

表3 余甘子葉加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 3 Results of recovery tests of Phyllanthus emblica L.(n＝6)

2.7 樣品含量測定結(jié)果

不同采收時期的余甘子葉中5 種有效成分的含量動態(tài)變化見圖2、圖3 與圖4。對5 種酚酸類成分各個月份的含量進行非參數(shù)檢驗中的Friedman 檢驗，結(jié)果顯示不同采收期的5 種酚酸類成分含量均存在顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明采收期不同，各成分含量存在差異。如圖2 和圖3 所示，不同采收期余甘子葉中5 種酚酸類成分的含量呈動態(tài)變化。在整年中，表沒食子兒茶素含量變化不大，基本趨于平穩(wěn)，在4 月、3 月和7 月含量達到高峰，11 月最低?？吕锢┖坎▌哟?，在7 月達到最高，4 月最低。訶子聯(lián)苯酸含量也隨采收期不同而有較大的起伏，在5 月、6 月和7 月持續(xù)上升，并在7 月到達頂峰。鞣花酸和訶子酸含量與柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸含量變化趨于一致，總體來說，隨著采收期的延長，各成分含量基本呈現(xiàn)一個下降、上升、下降的變化，并且在夏季達到最大值。由圖4 所示，7 月5 種酚酸類成分總含量最高，為（55.158±0.83）mg/g，5 月5 種酚酸類成分總含量次之，為（51.077±0.33）mg/g，11 月5 種酚酸類成分總含量最低，為（30.740±0.43）mg/g。因此，余甘子葉可能受不同生長期的氣候、水分和溫度等因素的影響，其酚酸類成分含量的積累可能產(chǎn)生一定程度的差異。

圖2 不同采收期余甘子葉中表沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸的含量動態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of the contents of Epigall ocatechin,Corilagin,Scorpion Biphenyl acid and Ellagic acid in the leaves of Phyllanthus emblica L.during different harvesting periods

圖3 不同采收期余甘子葉中訶子酸的含量動態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of the contents of Scorpion acid in the leaves of Phyllanthus emblica L.during different harvesting periods

圖4 不同采收期余甘子葉各成分總量變化Fig.4 Changes of the total components in the leaves of Phyllanthus emblica L.during different harvesting periods

2.8 主成分分析

由于不同采收期余甘子葉中5 種酚酸類成分的含量差異較大，因此采用SPSS 24.0 軟件對各成分含量進行分析，將數(shù)據(jù)標準化處理后得到各原始變量的標準分：Z表沒食子兒茶素、Z柯里拉京、Z訶子聯(lián)苯酸、Z鞣花酸、Z訶子酸，然后進行降維因子分析，提取3 個因子數(shù)，結(jié)果見表4，特征根λ1=2.939，特征根λ2=1.006，特征根λ3=0.704，前3 個主成分的累積方差貢獻率為92.976%，提示這3 個主成分可以反映余甘子葉藥材的全部信息，因此提取前3 個主成分，分別記作F1、F2、F3。由表5 成分得分系數(shù)矩陣可知，柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸和鞣花酸在第1 主成分有較高載荷，表沒食子兒茶素、柯里拉京和訶子酸在第2 主成分有較高載荷，表沒食子兒茶素、柯里拉京和訶子聯(lián)苯酸在第3 主成分有較高載荷。并且得到3 個因子得分，分別記作FAC1_1、FAC2_1、FAC3_1。主成分的得分是相應(yīng)的因子得分乘以相應(yīng)的方差的算術(shù)平方根，即F1=FAC1_1×2.939 的算術(shù)平方根，F(xiàn)2=FAC2_1×1.006 的算術(shù)平方根，F(xiàn)3=FAC3_1×0.704 的算術(shù)平方根，再以各主成分的貢獻率對主成分得分進行加權(quán)平均，即綜合得分=（58.779×F1+20.127×F2+14.071×F3）/92.976，求得主成分綜合得分，結(jié)果見表6。由表6可知，綜合得分最高的月份為7 月，其次是6 月。說明余甘子葉適合在7 月采摘，此時酚酸類有效成分累積可能達到高峰。

表4 不同采收期余甘子葉主成分分析結(jié)果Table 4 Analysis result of principal component of Phyllanthus emblica L.in different harvest periods

表5 不同采收期余甘子葉成分得分系數(shù)矩陣Table 5 Component score coefficient matrix of Phyllanthus emblica L.in different harvest periods

表6 不同采收期余甘子葉藥材主成分因子得分Table 6 Principal component factor scores of cotyledons of Phyllanthus emblica L.in different harvest periods

3 討論與結(jié)論

中藥材成分復(fù)雜，往往是多種有效成分共同發(fā)揮作用，因此測定多種有效成分的含量來評價中藥材的質(zhì)量，而含量跟采收期有一定的聯(lián)系[32]。余甘子樹主要分布于我國的廣西、廣東、福建、貴州、云南等地，余甘子葉作為余甘子樹新的研究部位，具有較高的食用和藥用價值，酚酸類成分是余甘子葉中的主要活性成分，其中的表沒食子兒茶素具有抗氧化、抗癌等作用[33?34]；柯里拉京具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓、抗菌、抗炎等活性，具有很大的藥用價值[35]；訶子聯(lián)苯酸具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗脂質(zhì)過氧化等藥理作用，是許多常用中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[36]；鞣花酸具有天然抗氧化、清除體內(nèi)自由基、保護低氧缺血所致的腦損傷等作用[37]；訶子酸可顯著緩解腎臟纖維化水平、改善腎臟功能[38]。因此，開展余甘子葉的研究對于開發(fā)利用新的藥用資源具有重要的意義。

本研究對廣西貴港市平南種植基地不同采收期的12 批余甘子葉樣品中的5 種酚酸類有效成分進行含量測定，由圖2、圖3 可看出，柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸和鞣花酸的含量隨不同采收月份的變化趨勢基本一致，在7 月達到最高值，隨后開始下降，含量最低值都在4 月，這提示在余甘子葉中這3 種酚酸類成分的代謝過程可能具有相關(guān)性，需要進一步深入研究；訶子酸全年各月份的含量均遠遠高于其他酚酸類成分，在11 月達到最低值，在8 月達到最高值；而表沒食子兒茶素不同月份含量卻遠遠低于其他成分，且含量在2 月至4 月呈上升趨勢并在4 月達到最高值，這時其他成分含量反而下降，這與其他成分含量變化趨勢不同，其中的原因尚不明確，還需進一步探討。由圖4 可知，不同采收期的余甘子葉中5 種酚酸成分總含量變化為7 月>5 月>8 月>6 月>1 月>9 月>4 月>2 月>10 月>12 月>3 月>11 月，含量總和在7 月達到最大值，在11 月達到最小值。主成分分析的結(jié)果顯示綜合得分最高的月份為7 月，說明此時酚酸類有效成分累積可能達到高峰，可能是因為7 月正處于廣西的夏季高溫天氣，伴隨著強日照和強降水，酚酸類物質(zhì)含量上升。范青等[39]研究表明紅樹莓葉片生長代謝過程中酚酸類物質(zhì)在5～7 月份含量最高。劉娟秀等[40]研究表明不同采收期蒼耳草中總酚酸量在7 月中旬較高，本研究結(jié)果與這二者的結(jié)果具有一致性。

綜合考慮，7 月份采摘余甘子葉其酚酸類成分含量最高，藥用價值較高，因此以7 月份為余甘子葉的最佳采收期。本研究建立了同時測定余甘子葉5 種酚酸類成分含量的方法，為余甘子葉藥材的最佳采收期及合理開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)，但在植物生長代謝過程中其酚酸類成分之間的相關(guān)性仍需進一步研究和完善。